Abstract

Introducere

Actuala epidemie de obezitate și problemele sale de sănătate asociate au făcut ca examinarea influențelor asupra comportamentului alimentar să fie de o importanță capitală. În timp ce cauzele escaladării recente a obezității sunt complexe, disponibilitatea crescândă a alimentelor foarte gustoase și calorice, bogate în grăsimi și carbohidrați, a jucat un rol cheie (1). Stresul crescând al vieții de zi cu zi a fost asociat cu o motivație crescută pentru astfel de alimente (2-4). O susceptibilitate crescută la stres a fost, de asemenea, legată atât de obezitate, cât și de tulburarea alimentară (5, 6). Recent, în acord cu această literatură clinică, a fost propus un model în care aportul de alimente dense în energie atenuează efectele negative asociate cu un stres cronic (7). Studiul actual a fost conceput pentru a determina modul în care stresul cronic afectează preferințele macronutrienților pentru a obține o perspectivă asupra contribuțiilor stresului și a unui fenotip sensibil la stres asupra hrănirii gustative, a consumului excesiv și a sindromului metabolic.

aportului

Diferențele în sensibilitatea la stres s-au dovedit, de asemenea, că influențează comportamentele alimentare umane. În cadrul unui laborator, femeile cu un răspuns mai mare la cortizol au consumat mai multe calorii în urma stresului decât cele cu niveluri mai mici de cortizol (2). Mai mult, în acest studiu, aportul caloric a fost corelat pozitiv cu starea de spirit negativă în urma stresului. Sistemul de stres, în special hiperactivitatea axei de stres hipotalamo-hipofizo-suprarenale (HPA), a fost, de asemenea, asociat cu tulburarea alimentară excesivă la om (5, 6). Interesant este faptul că persoanele care își scad aportul caloric global în timpul stresului arată în continuare o preferință crescută pentru alimentele foarte gustoase (3). În timp ce aceste studii și alte studii s-au concentrat asupra aportului caloric general și a categoriilor generale de alimente (alimente de tip gustare vs. alimente de tip masă), preferința pentru macronutrienți specifici în timpul expunerii la stres este mai puțin clară.

Examinarea efectelor stresului sau a hormonilor de stres asupra preferinței macronutrienților în studiile pe animale a dat rezultate contradictorii. Administrarea factorilor de stres exogeni are efecte diferite asupra preferințelor, cu doze mai mari de glucocorticoizi care par să promoveze consumul de grăsimi și doze relativ mai mici care afectează consumul de carbohidrați (8, 9), tulpina de fond și vârsta jucând, de asemenea, un rol în relația dintre stres și alegerea dietei 10 ). O serie de studii axate în mod special pe aportul de grăsimi au arătat, de asemenea, că glucocorticoizii crescuți duc la un consum crescut de grăsimi atunci când sunt oferite ca singura dietă preferată (11-13). În mod adecvat, aportul de grăsime scade comportamentele asemănătoare anxietății și facilitează recuperarea stresului (13-16). Studiile privind consumul excesiv la șobolani arată, de asemenea, că expunerea anterioară la stres poate fi un factor declanșator necesar pentru a promova consumul excesiv de alimente gustoase (17, 18). Aceste studii susțin o legătură importantă între căile de stres și preferințele dietetice, care pot fi importante pentru efectele predispozante ale stresului la obezitate și consumul excesiv la persoanele cu sensibilitate crescută.

Pe baza acestor conexiuni între sensibilitatea la stres și alimentația indusă de stres, am utilizat un model de șoarece care afișează răspunsuri de stres dezadaptativ și sensibilitate crescută pentru a evalua efectele stresului cronic asupra selecției macronutrienților. Acești șoareci, deficienți pentru factorul de eliberare a corticotropinei receptor-2 (CRFR2), prezintă un răspuns HPA exagerat la stres, întârzierea recuperării stresului și răspunsuri crescute de adaptare dezadaptative în paradigme comportamentale multiple (19). Mai mult, am raportat anterior că acești șoareci prezintă, de asemenea, modificări ale markerilor de utilizare și stocare a energiei periferice, permițându-ne să examinăm efectele sensibilității la stres a întregului organism asupra preferințelor macronutrienților în timpul stresului cronic (20, 21). În aceste studii, am emis ipoteza că proporția de calorii consumate de șoareci dintr-o dietă bogată în grăsimi ar fi crescută de stres și că aceste efecte ar fi exagerate în modelul nostru de șoarece de sensibilitate la stres. În plus, am emis ipoteza că aportul specific al dietei bogate în grăsimi foarte preferat în timpul accesului limitat ar arăta un răspuns genotipic și mai mare la stres.

Materiale și metode

Preferință nelimitată pentru alegerea macronutrienților

Șoarecii cu deficit de CRFR2 (KO) și colegii de tip sălbatic (WT) au fost generați pe un fundal mixt C57Bl/6: 129J de încrucișări heterozigote, așa cum s-a descris anterior (19). Șoarecii masculi (WT n = 20; KO n = 19) au fost adăpostiți individual sub un ciclu de lumină/întuneric 12:12 (lumini la 0700 h), cu alimente și apă disponibile ad libitum. Șoarecii au primit peleți pre-cântăriți cu diete bogate în grăsimi, proteine ​​bogate și carbohidrați (Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ) timp de 16 zile. Dieta bogată în grăsimi (4,73 kcal/g) conținea 44,9% grăsimi, 35,1% carbohidrați și 20% proteine ​​în kcal. Dieta bogată în proteine ​​(4,29 kcal/g) conținea 29,5% grăsimi, 30,5% carbohidrați și 40% proteine, iar dieta bogată în carbohidrați (3,85 kcal/g) conținea 10% grăsimi, 70% carbohidrați și 20% proteine. Vezi Tabelul 1 pentru compoziția detaliată a dietei. Toate dietele conțineau o cantitate egală de vitamine și minerale și au fost concepute pentru a fi complete din punct de vedere nutrițional și cât mai asemănătoare ca textură și aspect.

tabelul 1

Compoziția dietelor.

% kcalHigh FatHote ProteineHigh carbohidrați
Cazeină19.739.419.7
L-cistină0,30,60,3
Frica de porumb7.27.531.1
Maltodextrină9.94.93.5
Surcoza171734,5
Ulei de soia5.55.55.5
Untură39.4244.4
Amestec de vitamine111

Aportul alimentar și greutatea corporală au fost măsurate în zile alternative (la aproximativ 1600 ore) pe tot parcursul studiului. Șoarecii au primit o săptămână de acces la toate dietele pentru a se familiariza cu ei înainte de a începe măsurările. În acel moment, peletele alimentare pre-cântărite au fost plasate pe podeaua cuștii și au fost cântărite și schimbate la fiecare două zile. Cantitatea de hrană dată a fost suficientă pentru a se asigura că șoarecii nu au rămas fără nici o dietă. În urma studiilor inițiale, experimentul a fost repetat într-un al doilea set dacă animalele (n = 4-6) pentru a colecta tampoane individuale de grăsime și a măsura nivelurile plasmatice de leptină. Toate studiile au fost făcute conform protocoalelor experimentale aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Pennsylvania și toate procedurile au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare instituționale.

Stresul variabil cronic

Pentru a examina efectele stresului asupra preferinței de alegere a macronutrienților, am folosit stresul variabil cronic (CVS), un model de stres relevant din punct de vedere etologic conceput pentru a fi rezistent la obișnuință. Șoarecii (WT n = 11; KO n = 12) au prezentat un factor de stres pe zi timp de 17 zile. Stresorii au fost concepuți pentru a fi imprevizibili, care apar atât în ​​timpul ciclului de lumină, cât și al întunericului. Au fost utilizați șapte factori de stres individual, ordinea factorilor de stres schimbându-se în fiecare săptămână (vezi Tabelul 2). Stresorii au fost 24 h de lumină constantă, 5 min anestezie cu izofluran, fiind găzduiți în cușca murdară a altui bărbat timp de 24 h, schimbări multiple ale cuștii (4-5 X) cu intervale variabile într-o singură zi, 15 min de reținere fizică, 24 h de zgomot nou folosind un generator de zgomot alb (Brookstone, Merrimack, NH) și un obiect nou plasat în cușcă peste noapte (tub de sticlă sau marmură). Șoarecii au fost sacrificați 24 de ore după stresorul final. Un grup de control (WT n = 9; KO n = 7) nu a experimentat CVS, dar a primit altfel o manipulare și tratament identice pe parcursul perioadei de studiu.

masa 2

Ordinea factorilor de stres.

Stressor Ziua de studiu
24 ro Lumină0,13
5 min anestezie am/pm1,7,14
Găzduit în cușca unui alt mascul2,10,15
Modificări multiple ale cuștii3.11
15 minute de reținere am/pm0, 4, 8, 17 (ultimul punct de timp)
Obiect nou6, 9, 16
Zgomot nou5, 12, 16

Fiziologie

Pentru a evalua modificările nivelurilor de glucoză circulante din cauza stresului și a modificărilor dietetice, sângele din coadă a fost luat pentru a măsura glucoza serică hrănită folosind glucometrul OneTouch Ultra (Johnson & Johnson, Milpitas, CA) în după-amiaza zilei înainte de sacrificiu.

Corticosteronul plasmatic a fost comparat pe tot parcursul CVS pentru a asigura un răspuns continuu la stres. Sângele din coadă a fost extras imediat înainte și după reținerea de 15 minute pentru a determina efectele CVS asupra nivelurilor de corticosteron bazale și induse de stres. Grupurile CVS au fost palide în ziua 0, ziua 8 și ziua 17 de stres. Reținerea a fost efectuată între 1000 și 1100. Șoarecii de control nu au fost reținuți sau sângerați pentru a elimina orice efect al stresului asupra consumului de dietă sau a greutății corporale, așa cum am raportat anterior răspunsuri genotipice la o reținere acută (19). Sângele a fost centrifugat timp de 10 minute la 5000 rpm la 4 ° C, iar plasma a fost colectată și depozitată la -80 ° C. Nivelurile de corticosteron au fost determinate utilizând un kit de testare radioimună disponibil comercial (MP Biomedicals, Orangeburg, NY). Au fost folosiți doi microlitri de plasmă pe probă și toate probele au fost preluate în duplicat. Sensibilitatea testului a fost de 7,7 ng/ml, iar coeficienții de varianță intra și inter-test au fost de 7,3% și respectiv 6,9%.

Leptina plasmatică a fost analizată din sângele din trunchi prelevat în ziua sacrificării, cu plasmă separată ca pentru testul de corticosteron. Nivelurile de leptină au fost determinate prin test radioimun (Linco Research, St. Charles, MO). Cincizeci de microlitri de plasmă au fost folosiți pe probă și toate probele au fost preluate în duplicat. Sensibilitatea testului a fost de 0,2 ng/ml, iar coeficienții de varianță intra și inter-test au fost de 7,2% și respectiv 7,9%.

Pentru a examina cantitățile relative de grăsime corporală în urma stresului și preferințelor de alegere a macronutrienților, carcasele decapitate au fost congelate pe gheață uscată și transportate la Universitatea din Pennsylvania Mouse Phenotyping Core pentru analiza grăsimii corporale. Carcasele au fost decongelate la temperatura camerei, cântărite, uscate peste noapte într-un cuptor la 60 ° C și cântărite din nou. Carcasele au fost apoi dizolvate într-un amestec 2: 1 de EtOH: KOH peste noapte într-un cuptor la 60 ° C, amestecat cu EtOH 50% și incubate cu 1M MgCl2 pe gheață timp de 10 min. Probele au fost centrifugate la 15.000 rpm timp de 30 min și supernatantul îndepărtat pentru a determina conținutul de grăsime. Tampoanele individuale de grăsime (grăsime reproductivă, renală, mezenterică și brună) au fost, de asemenea, disecate dintr-un set separat de șoareci tratați identic (n = 4 - 6 per grup) și au fost cântărite pentru a examina diferențele în distribuția grăsimilor.

Analiza biochimică

Țesutul adipos maro (BAT) a fost omogenizat și proteina extrasă și separată prin SDS-PAGE urmată de Western blot așa cum s-a descris anterior (21). Pentru a examina posibilele modificări ale termogenezei care nu tremură, membranele au fost testate pentru niveluri de proteine ​​de decuplare (UCP1; Calbiochem, La Jolla, CA) și normalizate la -actină (Sigma, St. Louis, MO). Analiza a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (22).

Acces limitat la dietă

Deoarece cantitatea de dietă bogată în grăsimi consumată în timpul accesului ad libitum a fost de aproximativ 95% din caloriile totale pentru ambele genotipuri, am dezvoltat un model cu acces limitat în care șoarecilor li s-a oferit dieta preferată bogată în grăsimi doar o oră pe zi pentru a evalua mai bine posibile diferențe genotipice în consumul indus de stres atunci când dieta bogată în grăsimi nu era principala sursă de calorii. Șoarecii masculi (n = 4-6 per grup) au fost adăpostiți individual cu pelete alimentare plasate pe podea. O cantitate pre-cântărită de chow standard (Purina Lab Diet, St. Louis, MO) a fost disponibilă în orice moment. Chow de casă conține 4,00 kcal/g constând din 28% proteine, 12,1% grăsimi și 59,8% carbohidrați. Timp de o oră în fiecare zi (1430-1530 ore), fiecărui șoarece i s-a furnizat o singură peletă de dietă HF pre-cântărită în cușca de acasă. S-au măsurat aportul de dietă și aportul de chow de 24 de ore. Șoarecii au primit trei zile pentru a se familiariza cu dieta și programul de hrănire înainte de începerea studiului. CVS a fost inițiat cu o zi înainte de prima măsurare a aportului, așa cum este descris mai sus, și a continuat timp de 13 zile.

Analiza datelor și statisticile

Rezultate

Efectele stresului asupra aportului caloric și alegerea macronutrienților

Pentru a determina modul în care stresul afectează preferințele macronutrienților, șoarecii au primit 16 zile de alegere dietetică în condiții bazale sau în timpul CVS. Aportul caloric total normalizat la greutatea corporală medie nu a fost diferit între genotipuri, dar a fost afectat de tratamentul stresului (F = 32,1, P Fig. 1A). Analiza aportului caloric total pe parcursul studiului a arătat că aportul caloric a scăzut în timp (F = 29,3, P Fig. 1B) și a fost crescut cu CVS (F = 32,0, P Fig. 1A). Au existat, de asemenea, efecte semnificative ale stresului (F = 27,3, P Fig. 1C). Analiza aportului ridicat de proteine ​​a relevat, de asemenea, un efect semnificativ al stresului (F = 13,0, P = 0,001), șoarecii martor consumând o dietă mai bogată în proteine ​​decât șoarecii stresați (Fig. 1A). Un efect principal al stresului asupra consumului relativ de proteine ​​a fost de asemenea observat (F = 12,9, P = 0,001; Fig. 1D). Analiza aportului de carbohidrați a relevat un efect semnificativ al stresului asupra consumului global ridicat de carbohidrați (Fig. 1A), șoarecii supuși CVS consumând mai puțin din dieta bogată în carbohidrați (F = 12,1, P Fig. 1E).