Corespondență către: Paolo Ruggiero, Novartis Vaccines & Diagnostics s.r.l., Centrul de cercetare, Via Fiorentina 1, Siena I-53100, Italia. [email protected]

Telefon: + 39-577-243111 Fax: + 39-577-243564

Abstract

OBIECTIV: Să investigheze dacă vinul roșu și ceaiul verde ar putea exercita activitate anti-H pylori sau anti-VacA in vivo într-un model de șoarece de infecție experimentală.

METODE: Vinul roșu fără etanol și concentratele de ceai verde au fost administrate pe cale orală ca amestec al celor două băuturi la șoareci infectați cu H pylori sau separat la șoareci tratați cu VacA. Colonizarea gastrică și inflamația gastrică au fost cuantificate prin analize microbiologice, histopatologice și imunohistochimice.

REZULTATE: La șoarecii infectați cu H pylori, amestecul de vin roșu și ceai verde a prevenit semnificativ gastrita și a limitat localizarea bacteriilor și VacA la suprafața epiteliului gastric. În mod similar, ambele băuturi au prevenit în mod semnificativ deteriorarea epiteliului gastric la șoarecii tratați cu VacA; ceaiul verde, dar nu și vinul roșu, a modificat, de asemenea, localizarea VacA în epiteliul gastric.

CONCLUZIE: Vinul roșu și ceaiul verde sunt capabile să prevină deteriorarea epiteliului gastric indus de H pylori, posibil implicând inhibarea VacA. Această observație susține posibila relevanță a dietei asupra rezultatului patologic al infecției cu H pylori.

INTRODUCERE

MATERIALE ȘI METODE

Bacterii

S-a folosit SPM 326, o tulpină de tip I H pylori care exprimă izoformă s1/m1 VacA [15]. Bacteriile au fost cultivate la 37 ° C în plăci Columbia Agar (Oxoid, Basingstoke, Marea Britanie) conținând 5% ser proaspăt de cal defibrinat și supliment Dent (Oxoid), în condiții microaerofilice, utilizând CampyGen (Oxoid) și recoltate în soluție salină imediat înainte de provocare.

Toxină

VacA nativă de tip s1/m1 a fost produsă și testată pentru activitatea de vacuolare pe celulele HeLa așa cum s-a descris anterior [16,17]. Înainte de utilizare, a fost activat la pH 2,0 timp de 10 minute la temperatura camerei, apoi neutralizat și diluat în soluție salină.

Concentrate de vin roșu și ceai verde

Vinul roșu (RW) a fost produs pe o podgorie familială locală (Sarmede, Italia) prin procesul tradițional de fermentare spontană, fără aditivi. Infuzia de ceai verde (GT) a fost obținută prin fierberea a 2 g de frunze liofilizate și altfel netratate din Maroc în 1 L de apă distilată timp de 5 minute. GT și concentratele RW fără alcool au fost obținute prin distilare sub vid la 30 ° C, apoi depozitate în alicote la -20 ° C. Înainte de administrare, concentratele au fost decongelate, diluate în apă pentru a atinge concentrația de 3 ori (RW) sau de 1,5 ori (GT) în comparație cu volumul original și filtrate la 0,2 μm. Amestecul RW + GT a fost preparat la aceleași concentrații finale.

Șoareci și design de studiu

tabelul 1

Programul tratamentelor

grupnD -1 la D de sacrificiuD 0D 2D 4D 14
RW + GT6RW + GTInfecţieInfecţie-Sacrificiu
Infectat61% glucozaInfecţieInfecţie-Sacrificiu
Neinfectat61% glucozaSalinăSalină-Sacrificiu
RW5RWVacA 10 μgVacA 10 μgSacrificiu-
5RWVacA 50 μgVacA 50 μgSacrificiu-
GT5GTVacA 10 μgVacA 10 μgSacrificiu-
5GTVacA 50 μgVacA 50 μgSacrificiu-
Controlul VacA51% glucozaVacA 10 μgVacA 10 μgSacrificiu-
51% glucozaVacA 50 μgVacA 50 μgSacrificiu-
Salină51% glucozaSalinăSalinăSacrificiu-

Histopatologie

Din stomacuri încorporate în parafină, secțiuni cu grosimea de 4 μm au fost tăiate, depilate și colorate cu hematoxilină-eozină (HE), apoi examinate orbește. Gastrita a fost clasificată în antrum, corpus și fundul fiecărui stomac în conformitate cu sistemul Sydney actualizat [18] și a marcat de la 0 la 3, corespunzător la normal, ușor, moderat și, respectiv, sever. Secțiunile gastrice au fost, de asemenea, supuse colorării imunohistochimice (IHC) folosind fie un anticorp policlonal anti-H pylori (HistoLine), fie un anticorp monoclonal anti-VacA așa cum s-a descris deja [13,19].

analize statistice

Datele au fost evaluate prin testul U cu o singură coadă Mann-Whitney. Valori de probabilitate mai mici de 5% (P 3 și respectiv 2,6 × 10 3 CFU/stomac, lipsit de diferențe semnificative (P = 0,22). În timp ce la animalele tratate cu RW + GT H pylori a fost detectabil de IHC în principal pe suprafața mucoasă gastrică (Figura (Figura1A), 1A), în controlul infectat s-a observat atât colorare superficială cât și profundă (Figura (Figura1C). 1C). În secțiunile adiacente, localizarea VacA de către IHC a rezultat foarte similară cu cea a H pylori, cu diferența că colorarea VacA a apărut ușor mai slabă la animalele tratate cu RW + GT (Figura (Figura1B) 1B) și ușor mai puternică la controalele infectate (Figura (Figura1D) 1D) în comparație cu colorarea corespunzătoare H pylori.

verde

Imagini reprezentative ale detectării IHC a H pylori (A și C) sau VacA (B și D) în secțiuni de mucoasă gastrică de la șoareci infectați cu H pylori în prezența (A și B) sau în absența (C și D) a RW + Tratament GT. În epiteliul gastric al controalelor infectate (C și D, secțiuni adiacente) H pylori și VacA sunt detectabile cu un model similar, atât superficial, cât și profund, în timp ce la tratamentul RW + GT (A și B, secțiuni adiacente) imunocolorația este în principal limitată la suprafața epiteliului. Inserțiile la mărire mai mare arată morfologia tipică H pylori (vârfuri de săgeți).

Vinul roșu și ceaiul verde previn gastrita indusă de H pylori

Scorul gastritei șoarecilor infectați cu H pylori (A) sau tratați cu VacA (B) în prezența sau în absența RW și/sau GT, așa cum este indicat. Media scorurilor antrum, corpus și fundus ale fiecărui grup. Bare = SE. a P b P (Figura 2B). 2B). Modificările mucoasei au fost semnificativ mai ușoare la șoarecii care au primit RW sau GT (Figurile (Figurile 2B, 2B, 3A și C) decât cele observate în controalele VacA (Figurile (Figurile 2B 2B și și 3E). 3E). Controalele VacA au prezentat leziuni epiteliale ușoare în antr, și moderată/severă în corpus și fundus, unde s-a observat alterarea arhitecturii mucoasei, cu vacuolizare epitelială, eroziune difuză a mucoasei și unele ulcerații (Figura (Figura 3E). 3E). Mucoasa gastrică din martorii salini nu a prezentat modificări apreciabile așa cum era de așteptat (Cifre (Figurile 2B 2B și și 3G 3G).

Imagini reprezentative ale secțiunilor mucoasei corpului gastric la șoareci tratați cu 50 μg de VacA în prezența (AD) sau în absența (E și F) a RW sau GT așa cum este indicat, în comparație cu martorul tratat cu soluție salină (G și H) . Colorare HE (A, C, E și G): controlul VacA (E) arată o pierdere tipică a arhitecturii mucoasei, cu zone de resturi celulare și amestec de celule inflamatorii (vârf de săgeată), aproape nedetectabile în prezența RW (A) sau GT (C). Detectarea IHC a VacA (B, D, F și H): distribuția VacA la tratamentul RW (B) este atât superficială, cât și profundă, similar cu cea a controlului tratat cu VacA (F), în timp ce la tratamentul GT (D) VacA este detectabil numai pe suprafața epiteliului gastric.

Ceaiul verde modifică localizarea VacA în mucoasa gastrică

Prezența și distribuția VacA au fost examinate de IHC în mucoasa gastrică tratată cu RW și GT (Figura (Figura 3B 3B și D), în comparație cu VacA și martorii salini (Figura (Figura 3F 3F și H)). Superficial și profund în mucoasă gastrică a șoarecilor care au primit fie 10 μg (date neprezentate), fie 50 μg de VacA (Figura (Figura 3F), 3F), doza mai mare de VacA producând o colorare similară calitativ, dar mai intensă decât doza mai mică șoarecii tratați cu RW colorare în comparație cu controalele tratate cu VacA (Figura (Figura 3B 3B și respectiv F). În schimb, mucoasa gastrică a șoarecilor tratați cu GT a arătat doar colorarea superficială a VacA, care a fost nedetectabilă în criptele glandelor (Figura (Figura 3D). 3D Controalele saline au fost complet negative așa cum era de așteptat (Figura (Figura 3H 3H).

DISCUŢIE

MULȚUMIRI

Suntem datori cu G Matteucci și R Sabato pentru gestionarea resurselor animale și cu S Torricelli și M Tortoli pentru manipularea animalelor.

COMENTARII

fundal

Infecția cu H pylori a stomacului uman provoacă gastrită atrofică, ulcer peptic și limfom al țesutului limfoid asociat mucoasei gastrice (MALT) și joacă un rol relevant în carcinogeneza gastrică. Actuala terapie pe bază de antibiotice se confruntă cu probleme de rezistență la antibiotice sau lipsa de conformitate a pacientului. În prezent, nu sunt autorizate vaccinuri. Cercetările actuale se concentrează atât pe antimicrobiene, cât și pe vaccinuri.

Frontierele cercetării

S-a raportat că mai multe extracte de plante sau substanțe derivate din plante, inclusiv polifenoli, exercită activitate anti-H pylori in vitro și/sau, mai important, in vivo. Acest domeniu de cercetare ar putea conduce nu numai la descoperirea de noi antimicrobiene, ci și la clarificarea posibilei relevanțe a dietei în mecanismul complex al interacțiunii gazdă-agent patogen și în rezultatul patologic al infecției cu H pylori.

Inovații și descoperiri

Raportăm pentru prima dată capacitatea amestecului de vin roșu (RW) și ceai verde (GT) de a se limita la suprafața mucoasei colonizării gastrice H pylori, care altfel era atât superficială, cât și profundă. Colonizarea modificată la șoarecii tratați cu RW + GT a fost însoțită de prevenirea gastritei, similar cu cea raportată de Matsubara și colab., Cu extracte GT în gerbilele mongole. La șoarecii administrați cu toxină VacA, tratamentul GT a prevenit atât inflamația gastrică, cât și penetrarea limitată a VacA în mucoasa gastrică, în timp ce RW a fost capabil să prevină numai inflamația gastrică; efectul ambelor substanțe poate fi cel puțin parțial legat de inhibarea VacA, pe care am observat-o anterior in vitro cu aceste substanțe. Rezultatele obținute cu GT la șoareci tratați cu VacA sunt similare cu cele raportate de Yahiro și colab., Cu extract de bractee de hamei.

Evaluare inter pares

Autorii au descris efectele vinului roșu și ale ceaiului verde împotriva gastritei prin infecția cu H pylori sau VacA la șoareci. A fost interesant faptul că combinația de vin roșu și ceai verde a împiedicat inducerea deteriorării mucoasei gastrice la modelul animal. Cu toate acestea, nu este clar dacă vinul roșu și ceaiul verde ar putea preveni daunele, respectiv.

Deoarece autorii au tratat animalele înainte de administrarea microorganismului (sau VacA), nu a fost clar dacă și tratamentul combinat ar putea inhiba gastrita stabilită. Lucrările ulterioare ar putea clarifica mai bine acest punct.

Note de subsol

Sprijinit parțial printr-o subvenție pentru biotehnologie a proiectului țintă CNR și o subvenție pentru tineri investigatori de la Universitatea din Padova

S- Editor Wang GP L- Editor Luzte M E- Editor Bi L