Divizia de Chirurgie Plastică și Reconstructivă, Departamentul de Chirurgie, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, New York

inflamația

Divizia de Chirurgie Plastică și Reconstructivă, Departamentul de Chirurgie, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, New York

Divizia de Chirurgie Plastică și Reconstructivă, Departamentul de Chirurgie, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, New York

Divizia de Chirurgie Plastică și Reconstructivă, Departamentul de Chirurgie, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, New York

Divizia de Chirurgie Plastică și Reconstructivă, Departamentul de Chirurgie, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, New York

Divizia de Chirurgie Plastică și Reconstructivă, Departamentul de Chirurgie, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, New York

Divizia de Chirurgie Plastică și Reconstructivă, Departamentul de Chirurgie, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, New York

Divizia de Chirurgie Plastică și Reconstructivă, Departamentul de Chirurgie, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, New York

Adresa pentru cereri de reimprimare și alte corespondențe: B. J. Mehrara, Weill Cornell Univ. Medical Center, 1275 York Ave., Suite MRI 1006, New York, New York 10065 (e-mail: [email protected]).

Abstract

În studiul de față, am analizat efectele obezității induse de dietă (DIO) asupra fiziologiei limfatice și a dezvoltării limfedemului utilizând un model de șoarece. Aici, arătăm că șoarecii adulți masculi C57BL/6J hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi devin obezi și dezvoltă o capacitate de transport a lichidului limfatic redus la momentul inițial, comparativ cu colegii slabi care au hrană cu o dietă normală de chow. Mai important, arătăm că șoarecii obezi au un fenotip de limfedem de coadă mai sever cu depunere crescută de adipos, fibroză și inflamație. În mod interesant, folosind un model de iritare topică, am constatat că șoarecii obezi au o înclinație semnificativ crescută la inflamația țesuturilor în comparație cu șoarecii slabi, cu infiltrare marcat crescută de macrofage și neutrofile. Luate împreună, rezultatele noastre sugerează că obezitatea scade funcția limfatică și crește tendința de inflamație la momentul inițial și că aceste efecte sunt amplificate de leziuni limfatice, ducând la un fenotip de limfedem mai sever.

Toate protocoalele experimentale au fost revizuite și aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Șoarecii masculi C57BL/6J au fost cumpărați de la Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) și întreținuți într-un mediu controlat de temperatură și lumină. Pentru a stabili DIO, șoarecii masculi adulți au fost menținuți pe o dietă bogată în grăsimi (60% kcal din grăsimi, W.F Fisher & Son) începând cu vârsta de 6 săptămâni ad libitum timp de 8-10 săptămâni. Șoarecii masculi de tip sălbatic martor, în funcție de vârstă, au fost menținuți pe o dietă normală (13% kcal din grăsimi; Purina PicoLab Rodent Diet 20, W.F Fisher & Son) pentru aceeași perioadă de timp (19, 29). La încheierea experimentului, animalele au fost cântărite cu ajutorul unei cântare digitale (Sartorius, Bradford, MA).

Modelul limfedemului de coadă de șoarece.

Animalele cu control obez și slab au suferit leziuni limfatice utilizând un model de limfedem bine descris de coadă de șoarece, în care sistemul limfatic superficial și profund al cozii a fost excizat printr-o excizie circumferențială a pielii de 2 mm în mijlocul porțiunii cozii (5, 9, 23, 26). Grupul nostru și alții au arătat anterior că acest model are ca rezultat limfedemul susținut al cozii distale, afectarea severă a funcției limfatice și caracteristicile histologice ale limfedemului clinic (de exemplu, inflamație cronică, depunere adipoasă și fibroză) timp de cel puțin 10 săptămâni postoperator ( 5, 9, 23, 26). Un set separat de animale obeze și slabe (n = 8-10 animale/grup) nu au avut intervenții chirurgicale pe coadă și au servit drept controale de bază. Animalele au fost eutanasiate 6 săptămâni postoperator și analizate așa cum este prezentat mai jos.

Volumele cozii, limfoscintigrafia și analiza histologică.

Calculele volumului cozii au fost analizate utilizând măsurători multiple ale circumferinței cozii digitale distale față de zona de leziune limfatică și formula conului trunchiat, așa cum s-a descris anterior (9). Limfoscintigrafia a fost, de asemenea, efectuată așa cum a fost descris anterior pentru a cuantifica fluxul limfatic către ganglionii limfatici sacri prin injectarea a 50 μl de tehnetiu filtrat (99 m Tc) coloid de sulf în coada distală (6). Absorbția ajustată la decădere a fost înregistrată în ganglionii limfatici sacri utilizând o cameră X-SPECT (Gamma Medica, Northridge, CA), iar analiza regiunii de interes a fost efectuată utilizând software-ul ASIPro (CTI Molecular Imaging, Knoxville, TN) (9).

Pentru analiza histologică și imunohistochimică, secțiunile de coadă au fost recoltate, fixate scurt în paraformaldehidă răcită cu gheață 4% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), decalcificate folosind EDTA 5% (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) timp de 72 de ore, și parafină încorporată. Secțiunile abdominale au fost recoltate de la șoareci obezi și martori, folosind truse de biopsie de 5 mm (Fray Products, Buffalo, NY), fixate în paraformaldehidă de 4% (Affymetrix, Cleveland, OH) și ulterior încorporate parafină. Secțiunile colorate cu hematoxilină și eozină au fost preparate utilizând tehnici standard, iar analiza grosimii țesutului subcutanat a fost efectuată în secțiuni transversale histologice situate la 1,5 cm distanță de locul chirurgical de către examinatorii orbi (n = 6-8 secțiuni/grup). Distanța de la stratul bazal al epidermei la fascia profundă a fost analizată în 4 regiuni/secțiune standardizate.

Colorarea imunohistochimică a fost efectuată în conformitate cu tehnicile noastre stabilite (5). Țesuturile încorporate în parafină au fost rehidratate pe scurt și demascarea antigenului a fost efectuată folosind citrat de sodiu în fierbere (Sigma-Aldrich). Activitatea peroxidazei endogene a fost stinsă, iar legarea nespecifică a fost blocată cu 2% BSA-20% ser animal. Țesuturile au fost incubate cu anticorp primar peste noapte la 4 ° C și colorarea anticorpului a fost vizualizată utilizând anticorpi secundari conjugați cu peroxidază de hrean, dezvoltați cu complex diaminobenzaminic (Vector, Burlingame, CA). Anticorpii primari utilizați pentru petele imunohistochimice au inclus receptorul hialuronan endotelial al vasului limfatic (LYVE) -1, CD45 și CD4 (toți din R&D, Minneapolis, MN). Toți anticorpii secundari au fost obținuți din Vector Laboratories. Secțiunile au fost analizate folosind microscopie cu câmp luminos, iar regiunile de interes au fost scanate folosind un scaner cu diapozitive Mirax (Zeiss, München, Germania). Numărul de celule a fost efectuat pe secțiuni de mare putere, cu un minim de 4-6 animale/grup și 4-5 câmpuri de mare putere (HPF)/animal de către doi recenzori orbi.

Fibroza a fost evaluată folosind metodele noastre publicate anterior pentru a cuantifica colorarea roșie Sirius (Polysciences, Warrington, PA) și imunohistochimia de tip I a colagenului (4). Pe scurt, indicele cicatricial roșu Sirius a fost calculat utilizând microscopie cu lumină polarizată pentru a determina raportul birrefringenței portocaliu/roșu/galben/verde și a fost analizat utilizând software-ul Metamorph Offline. Imunohistochimia colagenului de tip I a fost efectuată utilizând un anticorp împotriva colagenului de șoarece de tip I (Abcam, Cambridge, MA) și cuantificată ca raport dintre aria dermei colorate pozitiv într-un prag fix și aria țesutului.

Inflamarea indusă de uleiul de Croton și citometria de flux.

Pentru a determina dacă șoarecii obezi au o tendință crescută de inflamație, am folosit un test de ulei de croton bine descris (7). Experimentele noastre preliminare au fost efectuate folosind coada șoarecelui; cu toate acestea, am constatat că, în aceste cazuri, uleiul de croton a provocat doar inflamații minime datorită grosimii relative a pielii cozii. Ulterior, am efectuat aceste experimente aplicând fie ulei de croton, fie PBS (control) pe pielea abdominală rasă, așa cum a fost descris anterior de Bao și colab. (7). Un total de 150 pl de ulei de croton 2% (Sigma-Aldrich) au fost dizolvate în acetonă 70% (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) și aplicate pe o regiune abdominală de 2 × 2 cm. La douăsprezece ore după aplicarea uleiului de croton, secțiuni de țesut au fost recoltate pentru analiză histologică și citometrie în flux.

analize statistice.

Analiza statistică a fost efectuată utilizând software-ul GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA). Elevi t-testul a fost utilizat pentru a compara diferențele dintre două grupuri. Analiza între mai multe puncte de timp (limfoscintigrafie) a fost efectuată utilizând ANOVA bidirecțională cu teste post hoc pentru a compara grupurile individuale. Analiza descriptivă și metodele grafice au fost utilizate pentru a analiza și rezuma rezultatele. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SD, cu excepția cazului în care se specifică altfel, cu P

FIG. 1.Șoarecii obezi au depozit adipos crescut după leziuni limfatice. A: măsurători ale greutății corporale în control (adică neoperate) și șoareci limfedematoși hrăniți fie cu o dietă bogată în grăsimi (HFD; șoareci obezi), fie cu o dietă normală de chow (șoareci slabi). *P

Obezitatea cu sau fără leziuni limfatice scade absorbția ganglionului 99m Tc.

În concordanță cu studiile noastre anterioare, care au comparat captarea ganglionilor limfatici la extremitatea superioară a șoarecilor obezi și slabi, am constatat că absorbția coloidului de sulf marcat cu 99m Tc de către ganglionii limfatici sacri după injectarea cozii distale a fost semnificativ redusă la șoarecii obezi comparativ cu șoarecii slabi la linia de bază (Fig. 2, A - C) (29). Șoarecii obezi au scăzut absorbția nodală de vârf și au scăzut absorbția ajustată la descompunere comparativ cu șoarecii martor (P + limfatice cutanate în coada pielii 1,5 cm distal de zona de leziune limfatică (Fig. 2E).

FIG. 2.Obezitatea cu sau fără leziuni limfatice scade absorbția ganglionului 99m Tc. A: hărți reprezentative ale căldurii de control și cozi limfedematoase de șoarece injectate cu 99m Tc pentru limfoscintigrafie. Săgețile albe indică ganglionii limfatici sacri. B și C: cuantificarea captării 99m Tc ajustată prin descompunere de către ganglionii limfatici sacri în control (B) și limfedematoasă (C) șoareci. D: cuantificarea absorbției nodale de vârf la animalele martor și limfedematoase 6 săptămâni postoperator. *P + nave (stânga grafic) și LYVE-1 + zona naveidreapta grafic) în secțiuni martor și coadă limfodematoasă 6 săptămâni postoperator.

Șoarecii obezi au un răspuns inflamator exagerat după leziuni limfatice.

Studiile anterioare au arătat că inflamația celulelor T a grăsimii viscerale este un regulator crucial al răspunsurilor patologice la obezitate, inclusiv sindromul metabolic și cancerul (19, 30). În plus, laboratorul nostru și alții au demonstrat că celulele T reglează negativ limfangiogeneza și funcția limfatică și că inflamația celulelor CD4 + joacă un rol crucial în patogeneza limfedemului (16, 31). Prin urmare, pentru a analiza efectele obezității asupra inflamației în general și a inflamației celulelor CD4 + în special, am efectuat colorare imunohistochimică pe țesuturile cozii șoarecilor atât în ​​modelele de control (adică neoperate), cât și în cele ale limfedemului. Interesant, am constatat că șoarecii obezi nu au avut modificări semnificative în numărul de celule CD45 +/HPF și doar creșteri modeste (deși semnificative) ale numărului de celule CD4 +/HPF în țesuturile subcutanate ale cozii la momentul inițial (P + celule; FIG. 3, A și B). Cu toate acestea, analiza secțiunilor de țesut din cozile limfedematoase a demonstrat o creștere semnificativă a inflamației celulei CD45 + (de 3 ori) și a celulei CD4 + (de 2,5 ori) la șoarecii obezi comparativ cu șoarecii de control slabP

FIG. 3.Șoarecii obezi au un răspuns inflamator exagerat după leziuni limfatice. A și B: fotomicrografii reprezentative (mărire × 20) și cuantificarea CD45 +A) și CD4 + (B) celule pe câmp de mare putere (HPF) în secțiuni martor și coadă limfedematoasă a șoarecelui la 6 săptămâni după operație. *P

Șoarecii obezi au fibroză crescută după leziuni limfatice.

Fibroza și hiperkeratoza sunt semnele histologice ale limfedemului (4, 5, 9, 20, 25). În plus, grupul nostru a demonstrat anterior că fibroza este un regulator critic al regenerării limfatice și al funcției limfatice și că acest răspuns este dependent de inflamația celulelor CD4 + (4, 33). Prin urmare, pentru a analiza efectele obezității asupra fibrozei țesuturilor moi, am analizat depunerea de colagen folosind imunohistochimie și colorarea roșu Sirius așa cum am raportat anterior (6). În concordanță cu analiza noastră a celulelor CD4 +, am constatat că șoarecii obezi au crescut semnificativ fibroza dermică după leziuni limfatice, reflectată de depunerea crescută de colagen și indicele cicatricial crescut (P

FIG. 4.Șoarecii obezi au fibroză crescută după leziuni limfatice. A: microfotografii reprezentative (mărire × 20) și cuantificarea depunerii de colagen de tip I la animale martor și limfedematoase 6 săptămâni postoperator. *P

Șoarecii obezi au un răspuns inflamator acut crescut la stimulii nocivi.

Având în vedere că am constatat că șoarecii obezi au avut un răspuns inflamator cronic exagerat după leziuni limfatice, am urmărit apoi să stabilim dacă obezitatea a crescut și potențialul de inflamație acută. Acest lucru este important, deoarece am arătat anterior că leziunea limfatică activează foarte rapid răspunsurile imune înnăscute și semnale de pericol endogen (32). Pentru a atinge acest obiectiv, am aplicat ulei de croton, un model de dermatită iritantă bine stabilit, pentru a investiga diferențele în inflamația acută dintre șoarecii obezi și cei șoareci. În concordanță cu rapoartele noastre anterioare, am constatat că șoarecii obezi aveau un număr crescut de macrofage și leucocite CD45 + în grăsimea lor subcutanată la momentul inițial (Fig. 5A) (29). Înainte de aplicarea uleiului de croton, șoarecii obezi aveau structuri asemănătoare coroanei compuse din macrofage care înghițeau adipocite necrotice. Acest efect a fost semnificativ crescut la 12 ore după expunerea la ulei de croton, rezultând un aflux masiv de macrofage și monocite. Aceste descoperiri au fost confirmate cu citometrie în flux, care a demonstrat o creștere masivă a numărului de celule CD45 +, macrofage și neutrofile în țesuturile subcutanate ale șoarecilor obezi la 12 ore după expunerea la ulei de croton (P + celule și P

FIG. 5.Șoarecii obezi au un răspuns inflamator acut crescut la stimulii nocivi. A: putere redusă reprezentativă (fund; Mărire × 5) și de mare puteretop; Mărire × 40) secțiuni histologice de hematoxialină și eozină colorate ale șoarecilor slabi și obezi ai pielii abdominale înainte (0 h) și 12 ore după activarea uleiului de croton. Săgeata neagră scurtă indică o structură asemănătoare coroanei. B - D: parcele de flux și cuantificarea leucocitelor (B), macrofage (C) și neutrofile (D) din pielea abdominală a șoarecilor slabi și obezi înainte (0 h) și 12 ore după aplicarea uleiului de croton. *P

Interesant este că nu am găsit diferențe semnificative în numărul de vase limfatice sau suprafața vaselor atunci când am comparat șoareci obezi și slabi fie înainte de rănire, fie 6 săptămâni după ablația limfatică. Acest lucru a fost oarecum surprinzător, deoarece noi și alții am arătat anterior că celulele T în general secretă un număr de citokine antilimfangiogenice, inclusiv interferon-γ și factor de creștere transformant-β1 (16, 31). Cu toate acestea, este probabil ca mediul citokinelor la șoarecii obezi să poată fi diferit (adică, o expresie crescută a citokinelor limfangiogenice), rezultând astfel o diferență netă minimă în răspunsul limfanggiogen general în țesuturi. Este, de asemenea, posibil ca în momentul de 6 săptămâni să se fi rezolvat modificările care au avut loc în vasele limfatice. Oricum ar fi, reglarea proliferării și diferențierii celulelor endoteliale limfatice în obezitate este un domeniu important și va fi subiectul studiilor viitoare.

În concluzie, am arătat că obezitatea crește inflamația, fibroza și depunerea adiposă ca răspuns la leziuni limfatice, oferind astfel o justificare a studiilor epidemiologice care demonstrează un risc crescut de limfedem la pacienții obezi. Aceste rezultate sunt importante deoarece încep să identifice mecanismele celulare și moleculare care reglementează patologia limfedemului și sugerează că abordările antiinflamatorii sau antifibrotice vizate pot fi utile în prevenirea dezvoltării limfedemului la pacienții obezi. În plus, prezentul studiu oferă dovezi observaționale suplimentare că patologia limfedemului este legată de reacțiile inflamatorii secundare stazei limfatice.

Această lucrare a fost susținută de subvențiile NIH R01-HL111130-01 (către B. J. Mehrara) și 5-T32-CA009501-25 (către D. A. Cuzzone).