Profesorul BuHyun Youn

steatoza

Departamentul de Științe Biologice,

Universitatea Națională Pusan ​​Busandaehak-ro 63 beon-gil,

Geumjeong-gu, Busan, 46241 (Coreea)

Tel. 82-51-510-2264, Fax 82-51-581-2962, E-mail [email protected]

Articole similare pentru „”

  • Facebook
  • Stare de nervozitate
  • LinkedIn
  • E-mail

Abstract

Introducere

Lactotransferrina (Ltf) este o glicoproteină care leagă fierul secretată în lapte și în fluidele interstițiale și are diferite funcții, inclusiv antiinflamatoare, -biotice, -oxidante, -virale și -cancer [13]. Mai mult, administrarea Ltf s-a arătat anterior că reduce acumularea de lipide hepatice și ameliorează NAFLD la modelele murine [13, 14]. Majoritatea investigațiilor cu privire la rolul Ltf în prevenirea NAFLD au fost efectuate acum un deceniu și s-a descoperit că Ltf a prevenit NAFLD prin suprimarea captării chilomicronului [15]. Mai mult, un studiu structural a explicat că Ltf conține o regiune bogată în arginină, care era similară cu locul apolipoproteinei E (ApoE) care se leagă de receptorul lipoproteinelor cu densitate scăzută (LDLr), proteinei legate de LDLr 1 (LRP-1) sau lipolizei -receptorul de lipoproteine ​​stimulat (LSR) [16]. În studiul recent, s-a confirmat că Ltf se leagă de LSR și inhibă clearance-ul chilomicronului prin experimente de blotare a ligandului [17]. Cu toate acestea, rolul expresiei hepatice Ltf în reglarea NAFLD și mecanismul de reglare a expresiei Ltf încă nu au fost încă elucidate.

Stabilirea unui model animal adecvat este importantă pentru investigațiile preclinice. În studiile de investigare a mecanismului dezvoltării NAFLD, mulți in vivo Modelele NAFLD au fost generate de diete, inclusiv dietă bogată în fructoză, bogată în grăsimi și MCD (deficiență de metionină și colină) sau prin modificări genetice, inclusiv supraexprimarea SREBP-1c sau reducerea silențioasă a PPARα [18]. Abordări pentru stabilirea unui nou model NAFLD au fost sugerate în mod constant în studii pentru a elucida mecanismul molecular al NAFLD. Cu toate acestea, modelele au arătat în mod obișnuit acumularea severă de lipide hepatice în câteva zile, care este prea scurtă pentru a imita steatoza hepatică inițială a pacienților, chiar luând în considerare diferența de timp a șoarecilor umani și șoareci [19]. Pe măsură ce dezvoltarea NAFLD a petrecut câteva luni la pacienți, modelul de dezvoltare cronică a NAFLD poate arăta sub evenimente moleculare hepatice în modelele acute. În plus, utilizarea modelelor NAFLD induse de dietă nu a putut identifica forța motrice a NAFLD găsită la pacienții fără dietă anormală sau mutații genetice. Prin urmare, modelul NAFLD cronic și independent de dietă poate depăși limitarea modelelor actuale de șoarece NAFLD.

În acest studiu, am efectuat o investigație pentru a descoperi mecanismul steatozei hepatice inițiale prin stabilirea unui nou model de șoarece NAFLD cu iradiere a întregului corp pe baza studiilor anterioare. Am analizat apoi profilurile transcriptomice hepatice și am demonstrat mecanismul molecular al steatozei hepatice.

Materiale și metode

Linii celulare, cultivare și transfecție

AML12 (linia celulară de hepatocite normale murine), MIHA și HL-7702 (linia celulară de hepatocite normale umane) au fost utilizate în cercetare. Linia de celule AML12 a fost daruită cu generozitate de prof. Univ. Heung-Sik Choi (Universitatea Națională Chonnam, Gwangju, Republica Coreea). Linia celulară MIHA a fost daruită cu generozitate de prof. Univ. Suk Woo Nam (Universitatea Catolică din Coreea, Seul, Republica Coreea). Linia de celule HL-7702 a fost daruită cu generozitate de prof. Univ. Soon-Sun Hong (Școala de Medicină a Universității Inha, Incheon, Republica Coreea). AML12 a fost crescut în DMEM/F-12, MIHA a fost crescut în DMEM și HL-7702 a fost crescut în RPMI-1640 conținând 10% FBS, 100U/ml penicilină și 100 ug/ml streptomicină. Celulele au fost incubate în atmosferă umidificată, 95% aer/5% CO2 la 37 ° C.

Transfecția tranzitorie a fost efectuată în urma studiului anterior [25]. Pe scurt, amestecul de Lipofectamine ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) și pCMV6-Ltf (Origene Technologies, Rockville, MD) a fost incubat 30 de minute pentru formarea lipozomilor și aplicat pe celulele MIHA sau HL-7702 timp de 12 ore. După schimbul cu medii proaspete, celulele au fost utilizate pentru alte experimente.

Anticorpi și reactivi

Anticorpii primari specifici pentru Ltf, p-Stat5, Stat5, α-tubulin au fost cumpărați de la Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anticorpii secundari specifici pentru IgG de șoarece, IgG de iepure și IgG de capră au fost achiziționați de la Enzo Life Sciences (Ann Arbor, MI). Hormonul de creștere (GH) a fost achiziționat de la Prospec (East Brunswick, NJ), iar coumestrolul a fost achiziționat de la Enzo Life Sciences.

Protocolul și iradierea animalelor

Experimentele pe animale au fost efectuate în urma studiului anterior [26, 27]. Pe scurt, șoarecii masculi C57BL/6 de 3 săptămâni au fost cumpărați de la Orient Bio Inc. (Busan, Republica Coreea). Protocoalele pentru animale au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea Națională Pusan ​​(Busan, Republica Coreea) și efectuate în conformitate cu prevederile Ghidului NIH pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator. Șoarecii au fost adăpostiți individual sau în grupuri de până la cinci în cuști sterile. Animalele au fost întreținute în unități de îngrijire a animalelor într-o cameră cu temperatură reglată (23 ± 1 ° C) sub un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore, alocate și randomizate pentru experimentele de către tehnicianul instalației și puse în carantină timp de 1 săptămână înainte de studiu. Animalele au fost hrănite cu apă și cu o dietă standard pentru șoareci ad libitum. Pentru experimentele pe animale pentru modelul de șoarece NAFLD indus de dietă, șoarecii au fost hrăniți cu dietă bogată în fructoză (60% fructoză în greutate), bogată în grăsimi (60% calorii din grăsimi) sau dietă MCD.

Șoarecii au fost anesteziați înainte de iradiere și expuși la iradiere unică de 6 Gy de raze gamma generate de extractorul Gamma Cell 40 (Nordion International Inc., Kanata, Ontario, Canada). Șoarecii iradiați au fost incubați timp de 5 săptămâni și injectați intraperitoneal cu GH (2 ug/g · zi) sau coumestrol (0,5 ug/g · zi) conform experimentelor. Șoarecii au fost sacrificați după anestezie, iar sângele și ficatul au fost recoltate pentru analiză în urma studiului anterior [28]. Sângele a fost colectat din inimă, coagulat, iar serul a fost izolat prin centrifugare (1500 g, 15 min). Serul a fost înghețat la -70 ° C până la alte experimente. Ficatul a fost tăiat în grosimea de 4 mm și înmuiat într-un compus de temperatură optimă de tăiere (OCT) (Sakura Finetek, Tokyo, Japonia) pentru analize histologice. Probele de ficat din stânga au fost înghețate direct în azot lichid, depozitate la -70 ° C până la alte experimente.

Analiza histologică

Analiza histologică a fost efectuată așa cum a fost descris într-un studiu anterior [29]. Blocul de ficat înghețat a fost secționat în grosime de 8 um folosind criostate (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL), uscat la temperatura camerei timp de 1 oră și depozitat la -20 (C. Pentru colorarea hematoxilinei și eozinei (H&E), lamelele au fost fixate în soluție de formalină timp de 10 min în RT și spălate în TBS (50 mM Tris-Cl, 150 mM NaCI, pH 7,6) timp de 5 min de două ori. Lamelele au fost incubate în soluție de hematoxilină (Muto Pure Chemicals, Tokyo, Japonia) timp de 3 minute și spălate în apă distilată (DW) și albastre în 1% HCI 70% EtOH. Apoi lamele au fost mutate în soluție de eozină (Muto Pure Chemicals) și incubate timp de 5 minute și spălate în DW de trei ori. Ulterior, deshidratarea a fost efectuată prin incubare în serie în 70% EtOH, 95% EtOH, 100% EtOH și xilen. Diapozitivele au fost montate în soluția de montare Permount (Fisher Scientific, Pittsurgh, PA). Diapozitivele colorate au fost vizualizate cu microscopul de fluorescență Olympus IX71 (Olympus Optical Co. Ltd.).

Pentru colorarea cu ulei roșu O (ORO), lamelele au fost fixate în formalină și spălate în TBS de două ori. Soluția stoc ORO (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) a fost diluată în 3: 2 cu DW pentru a face soluția de lucru ORO. Lamelele au fost incubate în soluție de lucru ORO timp de 15 min, spălate în DW. Lamele au fost contracolorate în soluție de hematoxilină timp de 3 minute și spălate, deshidratate și montate așa cum este descris mai sus.

Pentru colorarea cu roșu Sirius, lamele au fost fixate în formalină și spălate în DW de două ori. Apoi lamele au fost incubate în soluția de colorare roșie Sirius (0,1% Roșu direct 80 (Sigma Aldrich) soluționat în acid picric) timp de 60 min. Apoi lamelele au fost spălate în acid acetic 0,5% de două ori, deshidratate și montate așa cum s-a descris mai sus.

Testul trigliceridelor (TG)

Evaluarea conținutului de trigliceride în țesutul hepatic sau hepatocite a fost efectuată în urma trusei de testare TG (BioVision, Milpitas, CA). Pentru a izola conținutul de lipide, țesutul hepatic și celulele au fost omogenizate și lizate în soluție de 5% NP-40 în DW. Lizatele au fost fierte în bloc de căldură la 80 ° C timp de 5 min și răcite la temperatura camerei timp de 10 min. Această procedură a fost repetată de două ori. Ulterior, probele au fost centrifugate la 13.000 rpm timp de 2 minute și s-a obținut supernatantul. Evaluarea conținutului TG a fost efectuată în urma instrucțiunilor producătorilor, iar rezultatele au fost măsurate de cititorul GloMax® Multi Microplate (Promega, Madison, WI). Pentru normalizarea TG din probele de ficat, conținutul de proteine ​​din supernatant a fost cuantificat prin trusa de testare a proteinelor BioRad (BioRad Laboratories, Hercules, CA) în urma studiului anterior [30].

Profilarea expresiei genelor și analiza datelor

Analiza transcriptomică a fost efectuată în urma studiului anterior [31]. Pe scurt, ARN-ul total a fost izolat din țesutul hepatic folosind RNeasy® (Invitrogen, Carlsbad, CA) și calificat de spectrofotometrul Nanodrop-1000 (Thermo scientific, Waltham, MA). ARN-ul a fost convertit în șablon de ADNc dublu catenar prin IVT (transcriere in vitro), purificat utilizând modulul de curățare a probei Affymetrix și fragmentat utilizând endonuclează de restricție. ADNc fragmentat a fost marcat la sfârșit cu dideoxinucleotidă biotinilată și hibridizat la matrice GeneChip® Mouse Gene 2.0 ST. Datele au fost normalizate utilizând algoritmul Robust Multi-array Average (RMA) implementat în software-ul Affymetrix Expression Console (versiunea 1.3.1.) (Http://www.affymetrix.com) și distribuțiile de semnal au fost comparate folosind graficul folosind instrumentele obținute din Proiectul Bioconductor (http://www.bioconductor.org). Genele exprimate diferențial (DEG-uri) au prezentat diferențe medii de semnal de 1,5 ori între grupurile de control și cele de tratament. Harta termică a fost descrisă prin metoda ierarhică de grupare. Rezultatul microarray-ului a fost depus în OUG (Nr. De acces GSE103622).

RT-PCR semicantitativ

Pentru a evalua nivelul ARNm în celulă și țesut, RT-PCR semicantitativă a fost efectuată în urma studiului anterior [32]. ARN-ul total extras din țesutul hepatic sau hepatocite a fost convertit în ADNc folosind trusa de sinteză ADNc SuperScript® VILO și mixul master (Invitrogen, Carlsbad, CA). CDNA a fost amplificat folosind polimeraza Taq (Takara Bio Inc., Tokyo, Japonia), urmând instrucțiunile producătorilor cu grunduri adecvate. Exemplele de secvențe utilizate pentru experimente au fost listate mai jos. Mouse Gapdh F: GGT GAA GGT CGG TGT GAA CGG ATT R: GAT GCC AAA GTT GTC ATG GAT GAC C Mouse Ltf F: CGA AGC ACG AAT GAC AAA GA R: ACA AAG CCA ATG GCA GAC TC Human GAPDH F: ATG ACA AGA AGG TGG TG R: CAT ACC AGG AAA TGA GCT TG Human LTF F: GAG AAG GAG TGT TCA GTG GT R: ATA GTG AGT TCG TGG CTG TC

Analiza Western blot

Analiza western blot a fost efectuată așa cum sa descris anterior [33]. Pentru a prepara eșantionul de proteine, țesutul sau celulele au fost omogenizate și lizate în test de radioimunoprecipitare (RIPA) tampon de liză (50 mM Tris, 150 mM NaCI, pH 7,4, 1% Triton X-100, 25 mM NaF, 1 mM ditiotreitol (DTT ), 20 mM EGTA, 1 mM NA3VO4, 0,3 mM fluorură de fenilmetansulfonil (PMSF) și 5 U/ml aprotinină). Apoi lizatele au fost centrifugate cu 13, 000 rpm la 4 ° C timp de 15 min. Supernatantul a fost obținut și concentrația proteinei totale a fost măsurată prin trusa de testare a proteinei BioRad (BioRad Laboratories). 40 μg de probe de proteine ​​au fost încărcate în SDS-PAGE și transferate în membranele de nitroceluloză. Membranele au fost blocate în 5% BSA în TBST (10 mM Tris, 100 mM NaCI și 0,1% Tween 20) timp de 1 oră la RT și incubate cu anticorpi primari peste noapte la 4 ° C. Ulterior, membranele au fost spălate în TBST și sondate cu anticorpi secundari timp de 1 oră la RT și s-a aplicat sistemul de detectare ECL (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) pentru a detecta.

Test imunosorbent legat de enzime (ELISA)

Pentru a evalua nivelurile de GH seric, serul izolat din sânge a fost utilizat în ELISA în urma studiului anterior [34]. Sângele obținut a fost incubat 15 minute la RT pentru coagulare și centrifugat pentru izolarea cheagurilor. Serul supernatant a fost obținut și aplicat pentru ELISA. ELISA a fost efectuat folosind kit-ul GH ELISA (USCN Life Science Inc., Houston, TX) urmând instrucțiunile producătorilor.

Imunofluorescență (IF)

Pentru a evalua localizarea subcelulară a Stat5, IF a fost efectuat în urma studiului anterior [35]. Pe scurt, celulele au fost însămânțate în sticlă lamelară, tratate cu GH timp de 30 min și fixate cu acetonă rece ca gheața timp de 20 min la -20 ° C. Apoi, celulele au fost blocate cu 1% BSA în PBS timp de 1 oră la RT și incubate cu anticorpi primari peste noapte la 4 ° C. Ulterior celulele au fost spălate și sondate cu anticorpi secundari conjugați DyLight® 488 (Thermo Fisher Scientific) și vizualizați cu microscopul de fluorescență Olympus IX71.

Izolarea și tratamentul lipoproteinelor bogate în TG

Plasma umană pentru cercetare a fost achiziționată de la Crucea Roșie Coreeană (Busan, Republica Coreea). Pentru a obține lipoproteina bogată în TG din serul uman sau murin, am efectuat izolarea lipoproteinelor bogate în TG în urma unui studiu precedent [36]. Am alocat ser tubului din polialomer (Beckman Coulter, Pasadena, CA) și am plasat același volum de NaCl (d= 1,006g/ml) soluție pe ser. Tubul a fost centrifugat prin ultracentrifugare (Beckman) cu rotor SW 40 (Beckman) cu 40 000 rpm timp de 24 de ore la 4 ° C. După centrifugare, s-a obținut 10% din volumul total și conținutul TG a fost măsurat prin trusa de testare TG așa cum s-a descris mai sus. În plus, proba de lipoproteine ​​bogate în TG a fost amestecată cu tampon de probă SDS și încărcată în SDS-PAGE pentru colorare cu argint. Pentru experimentele de evaluare a efectului lipoproteinei bogate în TG în in vitro model, lipoproteina bogată în TG a fost tratată cu o concentrație de TG de 0,2 mg/ml timp de 24 de ore și acumularea de TG a fost observată prin colorare ORO sau test TG.

Colorarea cu argint

Pentru a confirma izolarea lipoproteinei bogate în TG din ser și pentru a compara cantitatea de lipoproteine ​​bogate în TG din serul de șoarece, am efectuat SDS-PAGE și colorare cu argint așa cum este descris într-un studiu anterior [37]. Setul de pete de argint Pierce ™ (Thermo Scientific) a fost utilizat conform instrucțiunilor producătorilor. Pe scurt, lipoproteina izolată bogată în TG a fost amestecată cu tampon de probă SDS și încărcată în SDS-PAGE. Gelurile au fost fixate timp de 30 de minute și spălate în DW de două ori. Soluția sensibilizantă a fost aplicată pe gel timp de 15 minute și colorată cu soluție de azotat de argint. Apoi gelul a trecut la dezvoltarea unei soluții timp de 5 min. Dezvoltarea a fost oprită, spălată și scanată.

analize statistice

Toate datele numerice sunt prezentate ca media ± eroare standard (SEM) a cel puțin trei experimente independente, iar dimensiunile eșantionului sunt calculate pentru a permite atingerea semnificației. Rezultatele experimentale au fost analizate de ANOVA unidirecțional, urmat de testul diferenței semnificative sincer al lui Tukey sau testul t Student. Software-ul Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, CA) a fost utilizat pentru a efectua analize statistice, iar semnificația statistică a fost acceptată pentru p-valorile de 1,5 ori în expresie au fost descrise în harta de căldură (271 gene au fost reglate în sus și 184 gene au fost reglate în jos). Genele au fost rearanjate prin grupare ierarhică. Poziția Ltf în harta de căldură a fost marcată cu săgeată. (B) Nivelurile de expresie hepatică ale ARNm Ltf la șoareci au fost evaluate prin RT-PCR semicantitativă. Expresia ARNm a fost cuantificată din trei experimente independente. Media ± SEM. *, p