• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: [email protected]

ABSTRACT

Celulele de mamifere sunt echipate cu două mașini imune înnăscute distincte care detectează infecțiile virale și declanșează inducerea interferonilor de tip I (IFN) și a citokinelor proinflamatorii (17). Acizii nucleici virali extracelulari sunt recunoscuți de receptorii de tip Toll (3, 7, 8 și 9) în endozom, în timp ce acizii nucleici intracelulari, cum ar fi ARN dublu catenar (dsRNA) și ARN 5'-trifosfat, sunt recunoscuți de către gena I inductibilă de acid retinoic (RIG-I)/proteina genei asociate diferențierii melanomului 5 (MDA5 sau Helicard) din citoplasmă (2, 11-13, 31, 34). DsRNA extracelular activează factorul de reglementare 3 NF-κB și IFN (IRF3)/IRF7 prin receptorul Toll-like 3 și proteina adaptor TRIF, iar dsRNA intracelular activează NF-κB și IRF3/IRF7 prin RIG-I și proteina adaptor mitocondrială MAVS/VISA/Cardiff/IPS-1; ambele căi induc producția IFN de tip I (1, 18, 28, 35, 40).

regulamentul

Proteina RIG-I este o ARN helicază citosolică DEXD/H cutie cu dsRNA sau proprietăți de legare a ARN-ului 5'-trifosfat (13, 31, 42). RIG-I activează producția de IFN de tip I ca răspuns la prezența unui genom de ARN viral intracelular, precum virusul Sendai sau virusul hepatitei C (38, 42) și joacă roluri centrale în reglarea producției de IFN ca răspuns la infecție virală în fibroblaste și celule convenționale dendritice (15). Răspunsul antiviral la infecția cu virusul ARN este abolit în celulele fibroblaste embrionare murine (MEF) cu deficit de RIG-I și invers, replicarea virală este restricționată în celulele care supraexprimă RIG-I (42). În plus, semnalizarea antivirală mediată de RIG-I/MDA5 poate fi perturbată de diferite proteine ​​virale derivate din virusul hepatitei C, paramixovirusurile sau virusul gripal (3, 8, 29).

Deși șoarecii cu deficit de ISG15 au fost raportați inițial că prezintă semnalizare IFN normală și rezistență la infecțiile cu virusul stomatitei veziculare (VSV) și infecțiile cu virusul choriomeningitei limfocitotice (LCMV), s-a dovedit recent că acești șoareci au o susceptibilitate crescută la gripă, herpes și infecții virale Sindbis ( 23, 30). Rolul antiviral al ISG15 a fost, de asemenea, susținut de observații că supraexprimarea ISG15 reprimă replicarea virusului Sindbis în mai multe organe ale șoarecilor cu deficit de receptor IFN-α/β și protejează gazda împotriva letalității induse de virus (22). Printre țintele celulare recent identificate ale ISG15 se numără mai multe proteine ​​antivirale induse de IFN, inclusiv PKR, MxA, HuP56 și RIG-I, sugerând că conjugarea ISG15 poate juca un rol regulator important în răspunsurile antivirale mediate de IFN (26, 43). Cu toate acestea, șoarecii cu deficiență de Ube1L care nu reușesc să producă conjugați ISG15 au prezentat semnalizare IFN-α/β normală și răspunsuri antivirale la infecțiile cu VSV și LCMV (20).

Proteina RIG-I detectează componentele virale intracelulare și inițiază un răspuns antiviral, care stimulează producția de IFN. IFN, la rândul său, activează transcrierea RIG-I, generând astfel o buclă de feedback pozitiv care duce la acumularea de proteină RIG-I în timpul răspunsului imun antiviral. În același timp, Lgp2 inductibil cu IFN interferează cu recunoașterea dsRNA de către proteina RIG-I și, prin urmare, funcționează ca un regulator negativ (33, 41, 42). Aici, raportăm o buclă suplimentară de feedback negativ care controlează nivelurile celulare ale proteinei RIG-I prin ISGilarea proteinei, care este indusă de semnale antivirale sau IFN-α/β. Aceste rezultate au dezvăluit un mecanism prin care puterea de semnalizare mediată de RIG-I poate fi reglată fin pentru a menține un echilibru între apărarea înnăscută și hipersensibilitatea în timpul răspunsurilor antivirale.

MATERIALE ȘI METODE

Plasmide. ADNc ISG15 de șoarece de lungime completă a fost obținut de la ficatul șoarecilor tratați cu LPS prin transcriptază inversă PCR (RT-PCR) și apoi clonat în siturile EcoRI/XhoI ale plasmidei pCS2-MT. Secvențele primare PCR au fost după cum urmează: 5'-CCGGAATTCGCAGCAATGGCCTGGGAC-3 'și 5'-CCGCTCGAGGGCACACTGGTCCCCTCC-3'. ADNc RIG-I uman de lungime completă a fost izolat din pEF-BOS-Flag-RIG-I (furnizat de Takashi Fujita) și subclonat în pcDNA3.1/Plasmida Hygro (Invitrogen). O mutație punctuală Flag-RIG-I (K172R) a fost introdusă cu kitul de mutageneză direcționată către site-ul QuikChange conform instrucțiunilor producătorului (Stratagene). Plasmidele pCAGGS-HA-UBE1L și pFlag-CMV-UbcM8 au fost furnizate cu amabilitate de Dong-Er Zhang (Institutul de Cercetare Scripps), iar plasmidele hemagglutinină (HA) -Ub, Flag-human ISG15 și Flag-UBP43 au fost furnizate de Chin Ha Chung (Universitatea Națională din Seul, Coreea). Plasmidele pEGFP-N (Clonetech) și pISRE-luc (Stratagene) au fost achiziționate, iar plasmida luciferază pPRDIII-I a fost furnizată cu amabilitate de Katherine A. Fitzgerald (Universitatea din Massachusetts).

Anticorpi și Western blot. Celulele au fost lizate în tampon de liză (150 mM NaCI, 1% Triton X-100, 0,1% sodiu dodecil sulfat [SDS], 0,5% deoxicolat, 25 mM Tris-HCI, pH 7,5) conținând 1 mM ditiotreitol, 0,57 mM fenilmetilsulfonil fluor 5 μg de leupeptină/ml, 2 μg de pepstatin A/ml, 5 μg de aprotinină/ml și 1 mM benzamidină. Toate substanțele chimice au fost achiziționate de la Sigma. Lizatele celulare totale au fost analizate folosind geluri de poliacrilamidă denaturare (SDS). Anticorpi împotriva Flag (M2; Sigma), HA (Roche), Myc (Roche), actină (Santa Cruz Biotechnology), gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (GAPDH; Chemicon), proteină fluorescentă verde (GFP; Santa Cruz Biotechnology) și Proteina RIG-I (R37; Immuno-Biological Laboratories Co.) a fost achiziționată, iar anticorpul RIG-I anti-uman a fost descris anterior (14). Semnalele imunoreactive au fost dezvoltate folosind reactivul Super Signal (Pierce).

Imunoprecipitare. Lizatele celulare totale (1 mg) au fost preclarate cu imunoglobulină de șoarece G (IgG) și proteine ​​G/proteine ​​A-agaroză (Calbiochem, La Jolla, CA) și apoi incubate cu anti-Flag sau IgG de șoarece peste noapte la 4 ° C. Margelele au fost spălate cu tampon de spălare (150 mM NaCI, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% deoxicolat, 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCI, pH 8,0) și analizate pe geluri SDS-poliacrilamidă. Controalele de intrare au constat din 5% din lizați (extracte de celule întregi).

Testele reporterului Luciferase. Celulele COS-7, HepG2 și MEF au fost cotransfectate cu pISRE sau pPRDIII-I luciferază reporter plasmidă și vectori de expresie corespunzători. Pentru a normaliza eficiența transfecției, celulele au fost cotransfectate cu pRL-CMV. La 48 h posttransfectare, s-a efectuat un test dual de luciferază (Promega). Pentru stimulare, celulele au fost tratate cu poli (I: C) (10 μg/ml) sau NDV (10 5 50% doze infectante cu ou/ml) la 42 până la 48 h posttransfecție pentru timpii indicați în figuri.

Generarea de linii celulare stabile. Celulele HEK293 au fost transfectate cu vectori de expresie pcDNA3.1/Hygro sau pcDNA3.1/Hygro-Flag-RIG-I și transfectanții stabili au fost selectați în 0,2 mg de higromicină (Invitrogen)/ml timp de 3 săptămâni.

Izolarea și analiza ARN-ului. ARN-ul total a fost extras din celulele HepG2 sau MEF utilizând reactivul TRIzol (Invitrogen) și supus RT-PCR în timp real sau convențional. ARN-ul total (1 μg) a fost transcris invers utilizând sistemul de transcripție inversă Improm-II (Promega). Exemplele de secvențe utilizate pentru RT-PCR au fost după cum urmează: mouse UbelL, 5'-CGGATGCAGCTTC TGAGGATG și 5'-CGTCCAGGGTTTCCTGCAGTT; mouse RIG-I, 5'-CGGTCGCTGATGAAGGCA și 5'-TACGGACATTTCTGCAGG; mouse ISG15, 5'-CCGGAATTCGCAGCAATGGCCTGGGAC; LGP2 uman, 5'-GATCCTGTGGTCATCATCAACA și 5'-TCAGTCCAGGGAGAGGTC-3 '; și șoarecele IFN-β, 5'-CAGCTCCAGCTCCAAG și 5'-CTGAAGATCTCTGCTC-3 '. Exemple de secvențe pentru PCR în timp real au fost după cum urmează: RIG-I, 5'-GCCATTACACTGTGCTTGGAGA și 5'-CCAGTTGCAATATCCTCCACCA; IFN-β, 5'-TGCTCTCCTGTTGTGCTTCTCC și 5'-CATCTCATAGATGGTCAATGCGG; gena oligoadenilat sintetazei (OAS), 5'-GCAGCGCCCAACCAAGCT și 5'-CCAGTTCCAAGACGGTCC; ISG15, 5′-CCTCTGAGCATCCTGGT și 5′-AGGCCGTACTCCCCCAG; MxA, 5'-CCTGGAAGAGTCTGCTGTG și 5'-AACCTGGTCCTGGCAGTAG; șoarece IFN-β1, 5'-GGAATGAGACTATTGTT și 5'-CTGAAGATCTCTGCTC; mouse RIG-I, 5′-TCCCAGCAATGAGAATCCT și 5′-GTCAATGCCTTCATCAGC; mouse Ube1L, 5′-CGGATGCAGCTTCTGAGGATG și 5′-CACGCCACACAGTCTTGCCAG; LGP2, 5'-GATCCTGTGGTCATCAACA și 5'-TCAGTCCAGGGAGAGGTC; și gena actinei, 5'-TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGT și 5'-CCTAGAAGCATTTGCGGTGCACGATG.

Experiment de pulsare-urmărire. Pentru marcarea metabolică 35 S, celulele transfectate cu Flag-RIG-I au fost preincubate în mediul Eagle modificat de Dulbecco (conținând 10% FBS) lipsit de metionină (Sigma) timp de 1 oră la 37 ° C. Celulele au fost marcate cu puls cu [35 S] metionină (PerkinElmer) timp de 90 de minute și au fost urmărite cu mediu de cultură complet pentru perioadele indicate mai jos. Poli (I: C) a fost adăugat numai în perioada de urmărire. După timpii indicați, celulele au fost lizate în tampon de liză cu test de radioimunoprecipitare și supuse imunoprecipitării. Proteina RIG-I marcată metabolic a fost analizată utilizând autoradiografie.

Analiza replicării NDV. După infecția cu NDV (10 5 50% doze infecțioase de ou/ml) de diferite ori, ARN-ul total a fost preparat din celule MEF infectate folosind reactiv TRIzol. ARN-ul total (5 μg) a fost transcris invers utilizând primerul specific NDV (5'-GCTGATCATGAGGTTACCTC-3 ') (21), iar prezența genomului NDV a fost evaluată prin PCR utilizând primerii specifici genei NDV F 5'-TTGATGGCAGGCCTCTTGC -3 ′ și 5′-GGAGGATGTTGGCAGCATT-3 ′ (36). Pentru controlul nivelurilor egale de încărcare, ARN-ul total (1 μg) a fost transcris invers utilizând oligo (dT) și supus PCR utilizând primeri ai genei actinei în același timp.

REZULTATE

Nivelurile de proteină RIG-I ISGylated au fost ușor reduse odată cu creșterea expresiei HA-Ub în absența (datele neprezentate) sau prezența (Fig. 2D) a tratamentului cu IFN, indicând faptul că ubiquitina și ISG15 pot concura pentru proteina RIG-I. Deoarece o mutație K172R în domeniul de recrutare caspază a proteinei RIG-I determină pierderea aproape completă a ubiquitinării proteinei (9), am construit o proteină mutantă RIG-I K172R pentru a testa dacă ISG15 folosește același site ca ubiquitina pentru conjugare (Fig. 2E). Cu toate acestea, în prezența sistemului de conjugare ISGylation, nivelurile celulare ale formei mutante K172R neconjugate au scăzut la niveluri comparabile cu cele de tip sălbatic, indicând faptul că K172 nu este un loc pentru ISGylation. În cele din urmă, am examinat efectul UBP43. UBP43 este o izopeptidază care este capabilă să deconjugeze ISG15 din proteinele țintă. Când celulele au fost cotransfectate cu o plasmidă de expresie UBP43, conjugarea ISG15 cu proteina RIG-I a fost redusă și nivelurile globale de ISGilare celulară au scăzut. Cu toate acestea, nivelurile de proteină RIG-I neconjugată nu s-au recuperat atunci când UBP43 a fost supraexprimat (Fig. 2F).

Atât nivelurile bazale, cât și cele induse de LPS ale transcrierilor IRF7 și ISG15 în macrofagele Ube1L -/- și Ube1L +/+ au fost similare (20). Deoarece am observat că nivelurile bazale ale unor proteine ​​ISG au fost îmbunătățite în Ube1L -/- MEF, am examinat dacă celulele au fost stresate în condițiile de cultură pe care le-am folosit, ducând eventual la rezultate artificiale. Am transfectat celule MEF cu o plasmidă de expresie Ube1L și am examinat dacă fenotipul Ube1L -/- ar putea fi abolit. În prezența supraexprimării Ube1L, nivelurile bazale de proteină RIG-I în celulele Ube1L -/- MEF au fost reduse în mod clar (Fig. 6A). Mai mult, nivelurile bazale ale transcrierilor genei ISG15 și OAS1A în celulele Ube1L -/- MEF care supraexprimă HA-Ube1L au fost scăzute (Fig. 6B), confirmând faptul că nivelurile îmbunătățite ale proteinei RIG-I în celulele cu deficit de Ube1L s-au datorat lipsei. de ISGilare.

Supraexprimarea Ube1L a restabilit fenotipul de tip sălbatic la Ube1L -/- MEF. (A) Ube1L +/+ și Ube1L -/- celulele MEF au fost transfectate cu o plasmidă de expresie HA-Ube1L. După 48 de ore, extractele totale au fost imunotestate pentru proteina endogenă RIG-I și expresia HA-Ube1L. Experimentul a fost repetat de mai mult de trei ori, cu rezultate similare. IB, imunoblot; -, absent; +, prezent. (B) Ube1L +/+ și Ube1L -/- celulele MEF au fost transfectate cu o plasmidă de expresie HA-Ube1L. După 48 de ore, nivelurile transcrierilor genei ISG15, OAS1A și Ube1L au fost cuantificate prin RT-PCR în timp real. Se arată gradul de inducție (n-ori) în comparație cu nivelul la MEF de tip sălbatic netratat. (C) Calea de semnalizare RIG-I propusă reglementată de mai multe bucle de feedback pozitive și negative.

DISCUŢIE

Pe scurt, constatările noastre dezvăluie un nou mecanism de reglementare a producției de IFN prin controlul negativ al răspunsurilor antivirale mediate de RIG-I prin ISGilare indusă de IFN. O înțelegere completă a acestei reglementări va necesita elucidarea relației dintre ubiquitinare și ISGilarea proteinei RIG-I și interacțiunile funcționale ale acestor procese în timpul răspunsurilor antivirale.

MULȚUMIRI

Mulțumim lui K. I. Kim pentru discuții valoroase și lui T. Fujita, D.-E. Zhang și C. H. Chung pentru plasmide și MEF Ube1L -/-.

Această lucrare a fost susținută de subvenții din cadrul proiectului coreean de sănătate 21 R&D al Ministerului Sănătății și Bunăstării (0412-BM01-716-0001) și din Fondul de cercetare POSCO.