Fiziologia nevertebratelor

Editat de
Bin Tang

Universitatea normală din Hangzhou, China

Revizuite de
Dong Wei

Southwest University, China

Adriana Alvarez

Facultatea de Științe ale Naturii, Universitatea Națională din Salta, Argentina

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

piersic

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • Laboratorul cheie de stat pentru biologia stresului culturilor pentru zonele aride și Laboratorul cheie de gestionare integrată a dăunătorilor pe culturi în platoul Loess din nord-vest, Ministerul Agriculturii, Universitatea A&F din nord-vest, Yangling, China

Introducere

Pentru a determina mecanismul molecular potențial care stă la baza adaptării la restricția dietetică a aminoacizilor, am examinat performanța și răspunsurile transcripționale ale M. persicae alimentate cu diete artificiale definite chimic cu două profiluri diferite de aminoacizi dietetici. Am măsurat, de asemenea, conținutul de aminoacizi și zahăr în M. persicae prin cromatografie lichidă - spectrometrie de masă (LC-MS). În mod specific, prezentul studiu a avut ca scop determinarea modului în care restricția aminoacizilor din dietă afectează: (1) performanța M. persicae; (2) grupul de aminoacizi liberi și expresia genelor metabolice; și (3) expresia genelor în căile de semnalizare hormonală. Descoperirile obținute aici oferă informații despre mecanismele moleculare de adaptare la restricția dietetică a aminoacizilor din M. persicae și alți dăunători care hrănesc floema.

Materiale și metode

Afidele și dieta artificială

Coloniile de laborator ale M. persicae au fost colectate din varză (Brassica oleracea; CV. „Qingan 70”) în sera de la Universitatea A&F Northwest (Yangling, Shaanxi, China) la temperaturi cuprinse între 18 și 28 ° C și în condiții naturale în 2016. Afidele partenogenetice apterice au fost menținute pe varză într-o cameră de mediu controlat la Temperatura de 24 ± 2 ° C cu o fotoperioadă de 16/8 h ca colonie de laborator. Dieta standard (dieta de control) utilizată a fost descrisă anterior (Febvay și colab., 1988).

Pentru a detecta modificările fiziologice și mecanismele moleculare necesare adaptării la restricția dietetică a aminoacizilor din M. persicae, le-am manipulat dieta. Am furnizat fie o dietă artificială standard (control), fie o dietă restricționată (jumătate). Controlul și jumătatea dietelor au fost pregătite ambele cu soluții stoc de 2 × (aminoacizi), 10 × (vitamine) și 10 × (metale urme) și stocate la -80 ° C dacă nu au fost utilizate simultan. Componentele dietei sunt prezentate în tabelul suplimentar S1. Nivelurile de zaharoză, minerale și vitamine din dieta Half au fost identice cu dieta Control, dar concentrațiile tuturor aminoacizilor au fost reduse cu 50%. Nu s-au făcut alte modificări în dietele celor două grupuri.

Bioanalize de încercare pentru hrănirea dietei artificiale

Aminoacizi, zaharuri și analiza proteinelor totale

Pentru a detecta efectul restricției dietetice de aminoacizi asupra profilurilor de metaboliți ai afidelor, am măsurat abundența de aminoacizi, zaharuri și proteine ​​totale în afide care se hrănesc fie cu dietă de control, fie cu jumătate de dietă timp de 6 zile. Aminoacizii și zaharurile din afide au fost extrase cu 50 mM HCI prin măcinare cu un pistil de sticlă și mortar pe gheață. Aminoacizii și zaharurile extrase din întregul corp de afide au fost analizate așa cum s-a descris anterior (Cao și colab., 2016). Fiecare grup de dietă a cuprins opt subgrupuri. Un subgrup conținea 10 mg greutate proaspătă Afidele din ziua 6 (nimfe de a patra etapă) au fost hrănite cu regim Half sau Control. Concentrația medie de aminoacizi și zaharuri din opt subgrupuri a fost utilizată pentru analiza datelor și datele au fost analizate folosind Student’s t-Test. Conținutul total de proteine ​​în afide care se hrănesc cu dietele de control și jumătate timp de 6 zile au fost măsurate folosind un kit de testare a proteinelor BCA (Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China). Fiecare grup de dietă a cuprins șapte subgrupuri. Un subgrup conținea 5 mg greutate proaspătă Ziua 6 afide au fost hrănite cu dieta Half sau Control. Concentrația medie totală de proteine ​​din șapte subgrupuri a fost utilizată pentru analiza datelor, iar datele au fost analizate folosind Student’s t-Test.

Secvențierea ARN

Şaizeci M. persicae nimfele care s-au hrănit cu dietă de control și jumătate timp de 6 zile (nimfele de instar), respectiv, au fost colectate, congelate imediat în azot lichid și depozitate la -80 ° C pentru extracția ARN. Au fost efectuate trei replici biologice independente pentru analiza secvențierii ARN. ARN-ul total a fost extras din întregul corp de afide folosind RNAiso Plus (Takara Biotechnology Co., Ltd., Dalian, Liaoning, China) urmând instrucțiunile producătorului. Probele au fost apoi cuantificate cu fluorometru Qubit2.0 ® (Life Technologies, New York, NY, Statele Unite) și calificate de Agilent 2100 (AgilentTechnologies, Palo Alto, CA, Statele Unite). ARN de înaltă calitate a fost utilizat pentru sinteza ADNc și generarea bibliotecii Illumina care au fost finalizate la Novogene Bioinformatics Technology Co., Ltd. (Beijing, China). Proporția medie de citiri curate în fiecare eșantion a fost de 97,99–98,18%. Citirile curate filtrate din fiecare probă au fost aliniate la referință M. persicae genomul software-ului HISAT (versiunea 2.0.4) cu o rată totală de cartografiere 95,33-95,79% (Kim și colab., 2015).

Adnotarea funcțională și căile îmbogățite ale genelor exprimate diferențial (DEG)

Am folosit HTSeq (0.6.1) pentru a număra numerele citite mapate la fiecare genă. Apoi, numărul așteptat de fragmente pe kilobază de secvență de transcriere pe milioane de perechi de baze secvențiate (FPKM) calculat pe baza lungimii genei și a numărului de citiri mapate la această genă, iar nivelurile de expresie genică au fost estimate așa cum s-a descris anterior (Trapnell și colab. ., 2010). Analiza expresiei diferențiale a două grupuri de dietă a fost efectuată folosind pachetul DESeq R (1.10.1) (Anders și Huber, 2010). Gene cu un ajustat p-value TM RT Reagent Kit cu gDNA Eraser (Perfect Real Time, TaKaRa, Dalian, Liaoning, China). Pentru a valida datele transcriptomului, am selectat aleatoriu 15 DEG și am cuantificat nivelul de expresie al acestor gene folosind metoda RT-qPCR.

Proteina ribozomală L7 (RPL7) a fost selectată ca genă de referință pentru RT-qPCR așa cum a fost descris anterior (Tzin și colab., 2015). Volumul total de reacție (20 μL) cuprindea 10 μL 2 × SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus, Takara), 1 μL amestec de primer (concentrația finală a 150 nM a fiecărui primer) și 9 μL ADNc diluat. RT-qPCR a fost efectuat pe un sistem LightCycler ® 480 (Roche, Basel, Elveția) cu condiții de ciclism cuprinzând: 5 min la 95 ° C, 40 de cicluri de 95 ° C timp de 10 s, 60 ° C timp de 30 s. Rezultatele RT-qPCR au fost normalizate la nivelul de expresie al RPL7 și calculate prin metoda 2 –ΔΔ Ct (Livak și Schmittgen, 2001).

Analize statistice

Analizele statistice au fost efectuate cu software-ul SPSS, versiunea 20 (Armonk, NY, Statele Unite: IBM Corp.). Două comparații de grup au fost analizate de Student t-Test. Ne-am gândit p Cuvinte cheie: restricție de aminoacizi, ARN-seq, plasticitate transcripțională, metabolism al aminoacizilor, glicoliză, afid de piersic verde

Citație: Wu J, Lan H, Zhang Z-F, Cao H-H și Liu T-X (2020) Performanță și răspuns transcripțional al afidului de piersic verde Myzus persicae la restricționarea aminoacizilor dietetici. Față. Fiziol. 11: 487. doi: 10.3389/fphys.2020.00487

Primit: 20 ianuarie 2020; Acceptat: 21 aprilie 2020;
Publicat: 25 mai 2020.

Bin Tang, Universitatea Normală Hangzhou, China

Adriana Alvarez, Universitatea Națională din Salta, Argentina
Dong Wei, Universitatea Southwest, China