Pescuit marin, acvacultură și resurse vii

Acest articol face parte din subiectul de cercetare

Nutriția, metabolismul și fiziologia peștilor Vizualizați toate cele 14 articole

Editat de
Kang-le Lu

Colegiul de pescuit, Universitatea Jimei, China

Revizuite de
Min Jin

Universitatea Ningbo, China

Dizhi Xie

South China Agricultural University, China

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

clonarea

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Institutul de cercetare în domeniul pescuitului în Marea Galbenă, Academia Chineză de Științe a Pescuitului, Qingdao, China
  • 2 Laborator pentru știința pescuitului marin și procesele de producție a alimentelor, Laboratorul național Qingdao pentru știința și tehnologia marină, Qingdao, China

Introducere

Enzima colesterol 25-hidroxilază (Ch25h) asociată membranei catalizează formarea 25-hidroxicolesterolului (25HC, oxisterol) din colesterol și, prin urmare, joacă un rol important în metabolismul colesterolului și al lipidelor (Lund și colab., 1998; Horton și colab., 2002; Joseph și colab., 2002). S-a raportat că 25HC este un co-represor care blochează procesarea proteinelor care leagă elementul de reglare a sterolului (SREBP) și duce în cele din urmă la inhibarea transcripției genelor (Lund și colab., 1998). 25HC acționează, de asemenea, ca un ligand al receptorului ficatului X (LXR). Reglarea căii de semnalizare LXR/SREBP cu 25HC reduce sinteza colesterolului și crește efluxul și eliminarea acestuia (Janowski și colab., 1996; Accad și Farese, 1998; Radhakrishnan și colab., 2007). Reglarea căii de semnalizare LXR/SREBP cu 25HC afectează, de asemenea, metabolismul lipidic în alte moduri, în funcție de rolurile SREBP și LXR în metabolismul lipidelor (Shimano, 2001; Oosterveer și colab., 2010; DeBose-Boyd și Ye, 2018). În plus față de rolul metabolic bine cunoscut al oxisterolilor, unele publicații au raportat și funcția 25HC în reglarea imunității și rezistența la viruși (Yi și colab., 2012; Shrivastava-Ranjan și colab., 2016; Cagno și colab., 2017; Doms și colab., 2018; Shawli și colab., 2019; Zhang și colab., 2019).

În comparație cu mamiferele, funcțiile Ch25h sau 25HC la pești au fost slab înțelese. Doar la peștele zebră, rolul antiviral independent de interferon al 25HC a fost validat (Pereiro și colab., 2017). În limbajul limbii chineze, un studiu recent al nostru cu proces de hrănire urmat de analize transcriptomice a arătat acest lucru ch25h transcrierea în creier a fost afectată semnificativ de acidul arahidonic dietetic (ARA), care joacă un rol important în reproducerea peștilor (Izquierdo și colab., 2001; Norberg și colab., 2017), iar acest efect a fost diferit între peștii masculi și femele (Xu și colab., 2019). Studiile noastre anterioare au arătat, de asemenea, că ARA dietetică reglează diferențial steroidogeneza gonadică în talpa limbii chinezești, în funcție de sexul peștilor (Xu și colab., 2017a). Talpa limbii chinezești are caracteristici tipice ale dimorfismului sexual. Răspunsul diferit al metabolismului colesterolului la ARA dietetică la talpa limbii chinezești masculine și feminine pare interesant și merită investigații suplimentare. Ca studiu de urmărire, studiul de față a urmărit clonarea și caracterizarea mARN-ului de lungime completă al tălpii limbii chinezești ch25h, precum și pentru a investiga transcrierea acestuia ca răspuns la ARA dietetică în diferite țesuturi ale peștilor masculi și feminini. Rezultatele vor contribui la cunoașterea generală a fiziologiei Ch25h la pești.

Materiale și metode

Încercare de hrănire

Trei diete experimentale care conțin diferite niveluri de ARA au fost utilizate în studiul de hrănire (Tabelul 1). În dieta de control (dieta C), tristearina a fost utilizată ca sursă principală de lipide suplimentate. Dietele cu niveluri scăzute (Diet ARA-L) și ridicate (Diet ARA-H) au fost preparate prin înlocuirea tristearinei din dieta C cu ulei îmbogățit cu ARA. Conținutul ARA în cele trei diete experimentale a fost de 0,34, 2,53 și, respectiv, 9,63% din totalul acizilor grași (TFA), respectiv (Tabelul 2). Nivelurile constante de ulei îmbogățit cu LC-PUFA și lecitină de soia au fost suplimentate tuturor dietelor pentru a îndeplini cerința. Dietele experimentale au fost pregătite urmând procedurile de rutină din laboratorul nostru (Xu și colab., 2016).

tabelul 1. Formularea și compoziția dietelor experimentale (g kg –1 substanță uscată) a .

masa 2. Compoziția acizilor grași din dietele experimentale (% acizi grași totali).

A fost efectuat un studiu de hrănire de 10 săptămâni pentru a investiga efectele ARA dietetice asupra ch25h expresii genetice în limbă chineză. Talpa limbii chinezești eclozată în toamna trecută a fost utilizată în procesul de hrănire. Peștii au fost hrăniți cu o dietă comercială înainte de experiment. Cincisprezece pești masculi cu o greutate corporală inițială medie de 20,3 g și opt pești femele cu o greutate medie inițială de 72,0 g au fost crescuți în fiecare rezervor de polietilenă (200 L). La începutul studiului de hrănire, peștii au fost hrăniți cu dieta de control timp de 7 zile pentru a se acomoda cu condițiile experimentale. Testul de hrănire a fost efectuat într-un sistem de curgere a apei de mare în Huanghai Aquaculture Co., Ltd., (Haiyang, China). Fiecare dietă a fost repartizată aleatoriu în tancuri triplate. Peștii au fost hrăniți manual până la satisfacție aparentă de două ori pe zi (9:00 și 17:00). Rezervoarele au fost curățate zilnic prin sifonarea furajelor reziduale și a fecalelor.

La sfârșitul studiului de hrănire (toamna târziu), după ce a fost anesteziat cu eugenol (1: 10.000), starea de dezvoltare a gonadelor de pește a fost determinată înainte de prelevare. Majoritatea peștilor masculi erau maturi. Maturitatea peștilor masculi a fost confirmată de eliberarea laptelui la manipulare. Cu toate acestea, din păcate, observarea vizuală și examinarea microscopică a morfologiei ovocitelor au arătat că majoritatea peștilor de sex feminin erau imaturi, iar ovarele nu se dezvoltaseră deloc. Au fost disecați cinci pești masculi maturi și cinci pești femele imature pe tanc și s-au recoltat probe întregi de creier, gonadă și ficat. Toate probele de țesut au fost imediat înghețate cu azot lichid și depozitate la -86 ° C înainte de analiză. Toate protocoalele de prelevare a probelor, precum și practicile de creștere a peștilor, au fost revizuite și aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor din cadrul Institutului de cercetare în domeniul pescuitului în Marea Galbenă.

Extracția ARN și sinteza ADNc

ARN-ul total din ficat a fost extras folosind RNAiso Plus [TaKaRa Biotechnology (Dalian) Co., Ltd., Dalian, China] și apoi electroforizat pe 1,5% gel de agaroză pentru a testa calitatea și integritatea. Concentrația a fost determinată cu spectrometrul Colibri Microvolume (Titertek-Berthold, Germania). ARN-ul a fost apoi transcris invers cu kitul de reactivi PrimeScript TM RT cu gDNA Eraser (Perfect Real Time) (TaKaRa) conform manualului de utilizare.

Clonarea și secvențierea ch25h

CD-urile complete ale ch25h poate fi obținut de la GenBank (nr. de acces: XM_008315046.3). Secvența prezisă de la GenBank a fost validată cu PCR specifică și secvențierea produsului. ADNc de lungime completă a ch25h a fost clonat cu amplificare rapidă a capetelor ADNc (RACE). Grunduri specifice pentru ch25h au fost proiectate pe baza celor cunoscute ch25h secvență pentru a clona capătul 5 ′ și respectiv 3 ′. Kit-ul de amplificare SMARTer ™ RACE cDNA (Clontech, Mountain View, CA, Statele Unite) a fost utilizat pentru a efectua clonarea RACE, iar șabloanele de ADNc de capăt 3 și 5 au fost sintetizate conform manualului utilizatorului. Primerii au fost sintetizați de TsingKe Biological Technology, Co., Ltd., (Qingdao, China). Amplificările PCR au fost efectuate pe peqSTAR (PEQLAB, Erlangen, Germania). Toate produsele PCR au fost rulate pe un gel de agaroză de 1,5% și apoi purificate cu Zymoclean Gel DNA Recovery Kit (ZYMO RESEARCH, Irvine, CA, Statele Unite). Produsele PCR au fost clonate în vectorul de clonare simplu pEASY-T1 (TransGen, Beijing, China) și secvențiate în TsingKe (Qingdao, China). Alte detalii despre amplificarea PCR au fost similare studiilor noastre anterioare (Xu și colab., 2014).

Analiza reacției în lanț cantitative a polimerazei în timp real (qRT-PCR)

Tabelul 3. Secvențe ale grundurilor utilizate în această lucrare.

Analize statistice

Căutări similare ale ADNc secvențiat al ch25hs au fost făcute de blastn 1. Alinierile cu secvențe multiple ale aminoacizilor au fost efectuate folosind BioEdit. Secvențele de aminoacizi deduse au fost analizate cu DNAman și ExPASy Compute pI/MW 2. Programul SMART 3 și programul PROSITE 4 au fost utilizate pentru a prezice siturile funcționale sau domeniile din secvența de aminoacizi. Analizele filogenetice bazate pe secvențe de aminoacizi au fost efectuate folosind metoda de îmbinare vecină, iar copacii au fost construiți folosind MEGA 4.1.

Toate datele privind expresia genei au fost supuse unei analize unidirecționale a varianței în SPSS 16.0 pentru Windows. Diferențele dintre mijloace au fost testate prin testul cu raza multiplă a lui Tukey. Nivelul de semnificație a fost ales la P –ΔΔCT metodă. Metode 25, 402-408. doi: 10.1006/meth.2001

Lu, K.-L., Wang, L.-N., Zhang, D.-D., Liu, W.-B. și Xu, W.-N. (2017). Berberina atenuează stresul oxidativ și apoptoza hepatocitelor prin protejarea mitocondriilor în dorul botului Megalobrama amblycephala hrănite cu diete bogate în grăsimi. Fiziol de pește. Biochimie. 43 65–76. doi: 10.1007/s10695-016-0268-5

Lukyanenko, Y., Chen, J. J. și Hutson, J. C. (2002). Testosteronul reglează producția de 25-hidroxicolesterol în macrofagele testiculare. Biol. Reprod. 67, 1435–1438. doi: 10.1095/biolreprod.102.007575

Lukyanenko, Y. O., Chen, J. J. și Hutson, J. C. (2001). Producerea de 25-hidroxicolesterol prin macrofage testiculare și efectele sale asupra celulelor Leydig. Biol Reprod. 64, 790–796. doi: 10.1095/biolreprod64.3.790

Lund, E. G., Kerr, T. A., Sakai, J., Li, W. P. și Russell, D. W. (1998). clonarea ADNc a colesterolului 25-hidroxilaze al șoarecelui și al colesterolului uman, proteine ​​din membrană politice care sintetizează un puternic regulator al oxisterolului metabolismului lipidic. J. Biol. Chem. 273, 34316–34327. doi: 10.1074/jbc.273.51.34316

McDonald, J. G. și Russell, D. W. (2010). Editorial: 25-hidroxicolesterol: o viață nouă în imunologie. J. Leukoc. Biol. 88, 1071-1072. doi: 10.1189/jlb.0710418

Nayak, S., Koven, W., Meiri, I., Khozin-Goldberg, I., Isakov, N., Zibdeh, M., și colab. (2017). Acidul arahidonic din dietă afectează funcția imunitară și compoziția acizilor grași la peștii iepure de cultură, Siganus rivulatus. Pește-scoici Immunol. 68, 46-53. doi: 10.1016/j.fsi.2017.07.003

Norberg, B., Kleppe, L., Andersson, E., Thorsen, A., Rosenlund, G. și Hamre, K. (2017). Efectele acidului arahidonic dietetic asupra fiziologiei reproducerii codului feminin din Atlantic (Gadus morhua L.). Gen. Comp. Endocrinol. 250, 21-35. doi: 10.1016/j.ygcen.2017.05.020

Oosterveer, M. H., Grefhorst, A., Groen, A. K. și Kuipers, F. (2010). Receptorul ficatului X: controlul homeostaziei lipidelor celulare și nu numai: implicații pentru proiectarea medicamentelor. Prog. Lipid Res. 49, 343–352. doi: 10.1016/j.plipres.2010.03.002

Pereiro, P., Forn-Cuní, G., Dios, S., Coll, J., Figueras, A. și Novoa, B. (2017). Activitate antivirală independentă de interferon a 25-hidroxicolesterolului la un pește teleostic. Antivirale. Rez. 145, 146–159. doi: 10.1016/j.antiviral.2017.08.003

Radhakrishnan, A., Ikeda, Y., Kwon, H. J., Brown, M. S. și Goldstein, J. L. (2007). Transportul steroleglat al SREBP-urilor de la reticulul endoplasmatic la golgi: oxesterolii blochează transportul prin legarea la Insig. Proc. Natl. Acad. Știință. STATELE UNITE ALE AMERICII. 104, 6511-6518. doi: 10.1073/pnas.0700899104

Shahkar, E., Yun, H., Lee, S., Kim, D.-J., Kim, S.-K., Lee, B., și colab. (2016). Evaluarea nivelului optim de acid arahidonic dietetic și a esențialității acestuia pe baza creșterii și a răspunsurilor imune nespecifice la anghila japoneză. Anguilla japonica. Acvacultură 452, 209–216. doi: 10.1016/j.aquaculture.2015.10.034

Shankar, D. S. și Kulkarni, R. S. (2005). Modificări ale nivelului colesterolului tisular și al cortizolului seric în timpul celor patru faze de reproducere ale peștilor de apă dulce masculi, Notopterus notopterus. J. Environ. Biol. 26, 701-704.

Shankar, D. S. și Kulkarni, R. S. (2007). Nivelul colesterolului tisular și al cortizolului seric în timpul diferitelor faze de reproducere ale peștelui de apă dulce femelă Notopterus notopterus (Pallas). J. Environ. Biol. 2, 137–139.

Shawli, G. T., Adeyemi, O. O., Stonehouse, N. J. și Herod, M. R. (2019). 25-hidroxicolesterolul oxesterol inhibă replicarea norovirusului murin. Viruși 11: E97. doi: 10.3390/v11020097

Shimano, H. (2001). Proteine ​​de legare a elementelor de reglare a sterolului (SREBP): regulatori transcripționali ai genelor sintetice lipidice. Prog. Lipid Res. 40, 439-452. doi: 10.1016/s0163-7827 (01) 00010-8

Shrivastava-Ranjan, P., Bergeron, É, Chakrabarti, A. K., Albariño, C. G., Flint, M., Nichol, S. T., și colab. (2016). Inhibarea 25-hidroxicolesterolului a infecției cu virusul Lassa prin glicozilare GP1 aberantă. MBio 7: e1808-16. doi: 10.1128/mBio.01808-16

Vandesompele, J., De Preter, K., Pattyn, F., Poppe, B., Van Roy, N., De Paepe, A., și colab. (2002). Normalizarea precisă a datelor RT-PCR cantitative în timp real prin media geometrică a mai multor gene de control intern. Genomul Biol. 3, 0034.1–0034.11. doi: 10.1186/gb-2002-3-7-research0034

Wu, T., Ma, F., Ma, X., Jia, W., Pan, E., Cheng, G., și colab. (2018). Reglarea imunității înnăscute și adaptive pentru controlul infecției SIV cu 25-hidroxicolesterol. Față. Immunol. 9: 2686. doi: 10.3389/film.2018.02686

Xu, H., Ai, Q., Mai, K., Xu, W., Wang, J., Ma, H., și colab. (2010). Efectele acidului arahidonic dietetic asupra performanței de creștere, supraviețuirii, răspunsului imun și compoziției de acizi grași tisulari a tufei japoneze, Lateolabrax japonicus. Acvacultură 307, 75-82. doi: 10.1016/j.aquaculture.2010.07.001

Xu, H., Cao, L., Zhang, Y., Johnson, R. B., Wei, Y., Zheng, K., și colab. (2017a). Acidul arahidonic dietetic reglează diferențial steroidogeneza gonadică în teleostul marin, talpa limbii (Cynoglossus semilaevis), în funcție de sexul peștilor și stadiul de maturare. Acvacultură 468, 378–385. doi: 10.1016/j.aquaculture.2016.11.002

Xu, H., Cao, L., Wei, Y., Zhang, Y., Zheng, K. și Liang, M. (2017b). Efectele diferitelor rapoarte DHA: EPA dietetice asupra steroidogenezei gonadice în teleostul marin, talpa limbii (Cynoglossus semilaevis). Fr. J. Nutr. 118, 179–188. doi: 10.1017/S0007114517001891

Xu, H., Dong, X., Ai, Q., Mai, K., Xu, W., Zhang, Y., și colab. (2014). Reglarea conținutului de țesut LC-PUFA, expresia genei yl6 acil desaturazei grase (FADS2) și metilarea promotorului genetic genativ FADS2 de către diferite profiluri dietetice de acizi grași din marinele japoneze (Lateolabrax japonicus). Plus unu 9: e87726. doi: 10.1371/journal.pone.0087726

Xu, H., Mu, Y., Zhang, Y., Li, J., Liang, M., Zheng, K., și colab. (2016). Niveluri gradate de hidrolizat de proteine ​​din pește în dietele bogate în plante pentru calcan (Scophthalmus maximus): efecte asupra performanței de creștere și a acumulării de lipide. Acvacultură 454, 140-147. doi: 10.1016/j.aquaculture.2015.12.006

Xu, H., Sun, B., Liao, Z., Pribytkova, E., Zhang, Q., Wei, Y., și colab. (2019). Implicarea posibilă a căii PKC/MAPK în reglarea GnRH de acid arahidonic dietetic în creierul talpii limbii masculine Cynoglossus semilaevis. Acvacult. Rez. 50, 3528–3538. doi: 10.1111/are.14307

Yi, T., Wang, X., Kelly, L. M., An, J., Xu, Y., Sailer, A. W., și colab. (2012). Generarea gradientului de oxisterol de către celulele stromale limfoide ghidează mișcarea celulelor B activate în timpul răspunsurilor umorale. Imunitate 37, 535-548. doi: 10.1016/j.immuni.2012.06.015

Zerbinati, C., Caponecchia, L., Puca, R., Ciacciarelli, M., Salacone, P., Sebastianelli, A., și colab. (2017). Profilarea prin spectrometrie de masă a oxisterolilor în sperma umană identifică 25-hidroxicolesterolul ca un marker al funcției spermei. Redox Biol. 11, 111-117. doi: 10.1016/j.redox.2016.11.008

Zhang, Y., Wang, L., Huang, X., Wang, S., Huang, Y. și Qin, Q. (2019). 25-hidroxilaza colesterolului din pește inhibă replicarea virusului prin reglarea răspunsului imun al interferonului sau prin afectarea intrării virusului. Față. Immunol. 10: 322. doi: 10.3389/film.2019.00322

Cuvinte cheie: Cynoglossus semilaevis, Ch25h, clonare, caracterizare, expresie genică, acid arahidonic

Citare: Xu H, Sun B, Jia L, Wei Y, Liao Z și Liang M (2020) Clonarea și caracterizarea colesterolului 25-hidroxilază (ch25h) De la un teleost marin, talpa limbii chinezești (Cynoglossus semilaevis), și expresiile sale genetice ca răspuns la acidul arahidonic dietetic. Față. Mar. Știință. 6: 800. doi: 10.3389/fmars.2019.00800

Primit: 19 noiembrie 2019; Acceptat: 12 decembrie 2019;
Publicat: 14 ianuarie 2020.

Kang-le Lu, Universitatea Jimei, China

Dizhi Xie, South China Agricultural University, China
Min Jin, Universitatea Ningbo, China