Institutul și Departamentul de Endocrinologie și Metabolism

către

Spitalul al nouălea popor din Shanghai, Școala de Medicină a Universității JiaoTong din Shanghai

Shanghai, 200011 China

Articole similare pentru „”

  • Facebook
  • Stare de nervozitate
  • LinkedIn
  • E-mail

Abstract

Obiectiv: Pentru a investiga dacă berberina ar putea îmbunătăți sau nu starea metabolică a șobolanilor cu conținut ridicat de grăsimi prin modularea axei microbiote-intestin-creier. Metode: Berberina a fost administrată la șobolani Sprague-Dawley cu conținut ridicat de grăsimi. Hormonii cerebrali-intestinali au fost detectați și modificările microbiotei intestinale au fost analizate prin secvențierea genei 16S rRNA. Rezultate: Berberina ar putea reduce creșterea în greutate și lipoliza în grupul alimentat cu diete bogate în grăsimi. Mai mult, s-au observat tendințe de rezistență la insulină ameliorată și scăderea producției endogene de glucoză. În plus, sa constatat că axa microbiotă-intestin-creier a fost modulată, incluzând modificări structurale și de diversitate ale microbiotei, nivel crescut al peptidei serice de glucagon-1 și nivel neuropeptidic Y, scăderea nivelului orexinei A, peptidă asimilată a glucagonului Nivelul 1 al ARNm al receptorului, precum și îmbunătățirea ultra-structurală a hipotalamusului. Concluzie: Luate împreună, descoperirile noastre sugerează că berberina a îmbunătățit tulburările metabolice induse de dieta bogată în grăsimi prin modularea axei microbiota-intestin-creier.

Introducere

Prevalența obezității și a bolilor sale metabolice conexe, precum diabetul de tip 2 și bolile cardiovasculare, a crescut atât în ​​țările dezvoltate, cât și în țările în curs de dezvoltare [1]. În ultimele două decenii, prevalența combinată a supraponderalității și obezității în China a crescut de la 14,6% [2] la 32,3% [3]. Datorită prevalenței în creștere a bolilor metabolice și a impactului semnificativ al acestora asupra sănătății, interesele globale ale cercetării au fost atrase de etiologiile, prevențiile și terapiile lor.

Recent, sa constatat că tulburările axei microbiotă-intestin-creier sunt strâns asociate cu boli metabolice, inclusiv obezitatea, sindromul metabolic și diabetul [4]. Microbiota intestinală umană este considerată a fi un factor important de mediu intern care reglează echilibrul și stocarea energiei [5], care este asociat cu obezitatea și tulburările conexe [6]. Mai mult, disbioza microbiană intestinală poate juca un rol cauzal în obezitate, deoarece microbiota intestinală transferată de la șoareci obezi ar putea duce la o adipozitate semnificativ mai mare la primitorii fără germeni [7]. Calea de semnalizare hormonală este o parte a rețelei complexe de comunicare dintre microbiota intestinală și creier [4]. Hormonii intestinali, cum ar fi grelina, orexina, peptida-1 asemănătoare glucagonului (GLP-1) și leptina, modulează comportamentul de hrănire, homeostazia energetică, ritmul circadian etc. [8,9]. Agoniștii receptorilor GLP-1 au fost utilizați și în tratamentul diabetului și obezității [10]. Prin urmare, axa microbiota-intestin-creier este o țintă potențială pentru tratamentul bolilor metabolice.

Ca alcaloid izochinolinic, berberina este componenta farmacologică majoră a plantei chinezești numită rizom Coptidis (huanglian în chineză) [11]. A fost utilizat în principal pentru diareea intestinală a bacteriilor de mii de ani [11]. Recent s-a constatat că berberina este eficientă clinic în tratamentul diabetului și obezității [12]. Cu toate acestea, eficacitatea sa clinică este greu de explicat din cauza biodisponibilității sale orale extrem de scăzute. Doar o concentrație maximă de 0,4 ng/ml în plasmă a fost detectată după o singură doză orală de 400 mg de berberină la om [13]. Mai multe studii au arătat că berberina ar putea modula microbiota intestinală prin îmbogățirea bacteriilor producătoare de acid gras cu lanț scurt (SCFA) și reducerea diversității microbiene, care inhibă degradarea polizaharidelor dietetice și reduce aportul suplimentar de calorii în intestin, ceea ce poate avea efecte benefice asupra starea metabolică a gazdei [14,15,16].

Cu toate acestea, există doar câteva studii care explorează efectele berberinei asupra căii hormonale a axei microbiotă-intestin-creier. Am emis ipoteza că berberina ar putea ameliora metabolismul lipidelor și glucozei prin modularea axei microbiotă-intestin-creier, de exemplu, compoziția microbiotei intestinale și a hormonilor serici creier-intestin, precum și activitatea hipotalamusului. Pentru a înțelege mecanismele exacte, am folosit un model de șobolan alimentat cu diete bogate în grăsimi pentru a investiga aceste modificări.

Material si metode

Experimente pe animale

18 șobolani masculi Sprague-Dawley (SD) de 12 săptămâni au fost cumpărați de la SLAC Laboratories, SIBS, Shanghai, China. Animalele au fost adăpostite la o temperatură ambiantă de 22 ± 2 ° C, menținute într-un ciclu normal de lumină/întuneric de 12 ore și au permis accesul la hrană și apă ad libitum. După 2 săptămâni de aclimatizare, șobolanii au fost repartizați în mod aleatoriu la 3 grupuri (n = 6 per grup), cu unul alimentat în mod convențional cu diete normale de chow (NCD; conținând 10% grăsime) și celelalte două cu diete bogate în grăsimi (HFD; conținând 40% grăsime). Patru luni mai târziu, unul dintre grupurile HFD a fost administrat oral cu 150 mg/kg/zi de clorură de berberină (BBR; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA), în timp ce celălalt grup a fost continuat cu HFD exclusiv pentru alte 4 luni. BBR a fost suspendat în ser fiziologic normal (NS) înainte de utilizare. Șobolanii fără intervenții medicamentoase au fost tratați cu un volum egal de NS. Tratamentul animalelor a durat 8 luni; greutatea corporală și glicemia în repaus alimentar (FBG) au fost măsurate la fiecare 2 săptămâni în starea de repaus peste noapte. Nivelurile de glucoză din sânge au fost măsurate cu ajutorul unui glucometru electronic (Terumo, Tokyo, Japonia). Toate procedurile la animale au fost efectuate în conformitate cu principiile etice în cercetarea animalelor adoptate de Departamentul de Științe Animale de Laborator, Școala de Medicină a Universității JiaoTong, Shanghai, China.

Măsurarea insulinei, indicii biochimici și nivelurile peptidelor cerebrale

Sângele din coadă a fost colectat separat din vena caudală în urma postului peste noapte la lunile 0, 4 și 8 pentru detectarea insulinei, a profilurilor lipidice și a peptidelor cerebrale-intestinale. Nivelurile de trigliceride (TG), colesterol total (TC), acid gras gratuit (FFA) și colesterol lipoproteic cu densitate mică (LDL-C) au fost detectate cu Siemens Dimension MAX (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Tarrytown, NY, SUA); Insulina de post (FINS) a fost evaluată cu kituri ELISA (Shibayaji, Ishihara, Japonia); evaluarea homeostaziei indicelui de rezistență la insulină (HOMA-IR) a fost calculată conform formulei: HOMA-IR = FBG × FINS/22.5. Tuburile Eppendorf au fost adăugate imediat cu inhibitor de dipeptidil dipeptidază IV (Merck Millipore, Darmstadt, Germania) pentru evaluarea activă a GLP-1 și au fost adăugate imediat cu aprotinină (Sigma-Aldrich) pentru detectarea neuropeptidei Y (NPY) și a orexinei A. Toate peptidele creier-intestin au fost măsurate la temperatura camerei cu kituri ELISA (Phoenix Pharmaceuticals, Inc., Burlingame, CA, SUA).

Experiment de urmărire a izotopilor

Microscopie electronică de transmisie

Hipotalama a fost disecată și plasată imediat în glutaraldehidă 2% în tampon fosfat (pH 7,2) și menținută la 4 ° C timp de 2 ore. Probele au fost apoi post-fixate în 1% tetroxid de osmiu timp de 2 ore, deshidratate în concentrații crescânde de alcool (30% - 50% - 70%), imersate în oxid de propilenă și încorporate în rășină Araldite 502 la 60 ° C. Sectiuni groase de tesut au fost realizate si analizate prin microscopie optica pentru a confirma localizarea anatomica a hipotalamusului. Secțiunile ultra-subțiri au fost plasate pe rețele și colorate cu citrat de plumb și apoi observate la microscopul electronic cu transmisie (Philip, CM-120, Philips, Amsterdam, Olanda).

Determinarea GLP-1R în hipotalamus cu analiză PCR cantitativă în timp real

Hipotalamusul a fost separat așa cum s-a menționat mai sus. ARN-ul total a fost izolat folosind un reactiv TRIzol (TIANGEN, Shanghai, China) conform instrucțiunilor producătorului. Cantitatea și puritatea ARN au fost evaluate de un aparat model ND-2000 (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA). Integritatea ARN-ului a fost confirmată prin electroforeză pe gel de agaroză-formaldehidă. În primul rând, ADNc catenă a fost sintetizat din probe individuale din 2.000 ng de ARN total cu un kit de transcripție inversă ADNc (Promega Corporation, Madison, WI, SUA) urmând instrucțiunile producătorului. PCR în timp real a fost realizat de LightCycler 96 (Roche Applied Science, Penzberg, Germania) folosind SYBR Green I ca colorant de legare specific dsDNA pentru monitorizarea continuă a fluorescenței. Protocolul PCR a cuprins 5 minute la 95 ° C; 45 de cicluri de 15 s la 95 ° C, 15 s la 60 ° C și 15 s la 72 ° C. Secvențele primerilor GLP-1R au fost 5’-AGT AGT GTG CTC CAA GGG CAT-3 ’, 5’-AAG AAA GTG CGT ACC CCA CCG-3’ și cele ale β-actinei 5’-GCC CCT CTG AAC CCT AAG-3 ′, invers 5′-CAT CAC AAT GCC AGT GGT A-3 ′. Genele receptorului GLP-1 au fost normalizate la expresia β-actinei.

Extracția ADN-ului fecal și secvențierea genei ARNr 16S

Probele proaspete de scaun au fost colectate în luna a 8-a și depozitate imediat la -80 ° C pentru analiză ulterioară. Mărimile eșantionului au fost 5 în grupul martor, 5 în grupul HFD și 4 în grupul HFD + BBR. Nu există nicio diferență în eșantionarea între grupurile studiate. ADN-ul genomic al microbiotei a fost extras dintr-o probă fecală prin kituri de ADN pentru scaun TIANamp (TIANGEN). ADN-ul a fost cuantificat prin Nanodrop 2000. ADN-ul extras din fiecare probă a fost utilizat ca șablon pentru a amplifica regiunile hipervariabile V3 și V4 ale genelor rRNA 16S ribozomale. Pe scurt, 1 μg de ADN genomic purificat au fost fragmentate la o dimensiune medie de 300-400 bp și ligate cu adaptoare. PCR a fost efectuat folosind un cocktail de grund care se recoace la capetele adaptorilor pentru a îmbogăți fragmente de ADN care au molecule de adaptor la ambele capete și urmate de curățare și cuantificare. Secvențierea a fost efectuată utilizând un protocol de secvențiere de 300 bp asociat cu capăt pe platforma Illumina MiSeq (Illumina, San Diego, CA, SUA) la Oebiotech Company, Shanghai, China. Citirile brute cu perechi au fost supuse filtrării de calitate folosind software-ul Trimmomatic înainte de asamblarea citirilor cu capăt asociat cu software-ul FLASH. Toate himerele secvențelor de asamblare au fost eliminate pentru a ajunge la secvențe de înaltă calitate.

Analize statistice

Toate secvențele de microbiote au fost atribuite unităților taxonomice operaționale (OTU) utilizând algoritmul UCLUST în CD-HIT cu prag de 97% identitate pereche, iar cea mai abundentă secvență a fiecărei OTU a fost selectată ca secvență reprezentativă și a fost supusă clasificatorului RDP pentru atribuire taxonomică cu o limită de bootstrap de 50%. Estimările rare de satisfacție și indicele Shannon-Wiener au fost calculate utilizând QIIME. Secvențele reprezentative ale OTU-urilor au fost utilizate pentru a genera un arbore filogenetic folosind FasTree. Arborele filogenetic a fost apoi utilizat pentru analiza coordonatelor principale UniFrac neponderate (PCoA). Abundențele relative ale microbiotei intestinale în fiecare probă și alte date de măsurare au fost exprimate ca medie ± SEM și evaluate cu o analiză unidirecțională a varianței (ANOVA) cu testul post hoc al diferenței cele mai puțin semnificative (LSD) Fisher. Semnificația statistică a fost acceptată ca p # p & p