Abstract

OBIECTIV-FFAR1/GPR40 este un receptor cuplat cu proteina G exprimat predominant în insulele pancreatice care mediază secreția de insulină indusă de acidul gras liber. Cu toate acestea, rolul fiziologic al FFAR1 rămâne controversat. S-a raportat anterior că șoarecii knockout FFAR1 (Ffar1 -/-) erau rezistenți la hiperinuslinemia, hiperglicemia, hipertrigliceridemia și steatoza hepatică indusă de dietă bogată în grăsimi. Un raport mai recent a sugerat că, deși FFAR1 a fost necesar pentru secreția de insulină indusă de acizi grași in vivo, ștergerea FFAR1 nu a protejat insulele pancreatice împotriva disfuncției insulelor induse de acidul gras. Acest studiu este conceput pentru a investiga funcția FFAR1 in vivo folosind o a treia linie de șoareci Ffar1 -/- generați independent în fundalul C57BL/6.

lipsa

PROIECTARE ȘI METODE DE CERCETARE—Am folosit CL-316,243, un agonist al receptorilor adrenergici β3, pentru a ridica acut acizii grași fără sânge și pentru a studia efectul acestuia asupra secreției de insulină in vivo. Șoarecii Ffar1 +/+ (de tip sălbatic) și Ffar1 -/- (knockout) au fost plasați pe două diete distincte bogate în grăsimi pentru a studia răspunsul lor la obezitatea indusă de dietă.

REZULTATE—Secreția de insulină a fost redusă cu -50% la șoarecii Ffar1 -/-, confirmând faptul că FFAR1 contribuie semnificativ la stimularea acizilor grași a secreției de insulină in vivo. Cu toate acestea, șoarecii Ffar1 +/+ și Ffar1 -/- au avut greutate, adipozitate și hiperinsulinemie similare la dietele bogate în grăsimi, iar șoarecii Ffar1 -/- nu au prezentat nicio îmbunătățire a testelor de toleranță la glucoză sau insulină. În plus, dieta bogată în grăsimi a indus niveluri comparabile de acumulare de lipide la ficatul șoarecilor Ffar1 +/+ și Ffar1 -/-.

CONCLUZII—FFAR1 este necesar pentru secreția normală de insulină ca răspuns la acizi grași; cu toate acestea, șoarecii Ffar1 -/- nu sunt protejați de rezistența la insulină indusă de dietă bogată în grăsimi sau steatoza hepatică.

Acizii grași sunt implicați într-o gamă diversă de funcții fiziologice într-o varietate de țesuturi. Se crede că multe dintre efectele acizilor grași sunt mediate de metaboliții intracelulari ai esterilor acil-CoA cu lanț lung. Cu toate acestea, în ultimii ani s-au acumulat dovezi că cel puțin unele dintre activitățile atribuite acizilor grași sunt mediate prin interacțiunea lor cu un număr de receptori cuplați cu proteine ​​G desemnați FFAR1 (GPR40), FFAR2 (GPR43), FFAR3 ( GPR41), GPR120 și GPR84. FFAR2 și FFAR3 sunt activate de acizii grași cu lanț scurt, în timp ce FFAR1, GPR84 și GPR120 sunt activate de acizii grași cu lanț mediu sau lung (1). Dintre acești receptori, FFAR1 și GPR120 au atras atenția pentru potențialul lor ca ținte terapeutice pentru bolile metabolice (2-4).

Aici, raportăm fenotipurile metabolice pe o a treia linie independentă de șoareci Ffar1 -/- generați în fundalul C57BL/6Ncrl (B6). Am constatat că FFAR1 contribuie la ~ 50% din eliberarea in vivo a insulinei mediată de acizi grași, în concordanță cu raportul anterior al Latour și colab. (7). Spre deosebire de observațiile anterioare ale lui Steneberg și colab. (5), totuși, șoarecii noștri Ffar1 -/- nu sunt protejați de efectele negative ale dietei bogate în grăsimi. Șoarecii Ffar1 -/- pe o dietă bogată în grăsimi au devenit obezi, au dezvoltat rezistență la insulină și au acumulat lipide hepatice într-o măsură similară, în comparație cu colegii Ffar1 +/+. Luate împreună, datele noastre confirmă faptul că FFAR1 este important pentru secreția de insulină mediată de acizi grași, dar pune sub semnul întrebării rolul său în medierea efectelor toxice ale acizilor grași liberi asupra bolilor metabolice.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Generarea șoarecilor Ffar1 -/- în fundalul C57BL/6NCrl (B6).

Șoarecii Ffar1 -/- au fost generați personalizat de DeltaGen (Palo Alto, CA). Pe scurt, un vector de direcționare a fost conceput pentru a șterge un fragment de 152 bp corespunzător poziției 143-294 a cadrului de citire deschis al genei Ffar1 (NM_194057). Acest segment a fost înlocuit cu o casetă Neomycin (neo). Vectorul a fost electroporat în celule stem embrionare derivate de 129/OlaHsd (ES), iar coloniile de celule ES rezistente la G418 au fost apoi selectate și extinse pentru analiza ADN. Celulele ES vizate corect au fost injectate în blastocisti pentru a genera șoareci himerici care au fost apoi împerecheați cu femele B6. Descendenții heterozigoți Ffar1 (Ffar1 +/-) au fost identificați printr-o strategie de screening bazată pe PCR. Primerii PCR au fost proiectați pentru a detecta atât alelele de tip sălbatic (234-bp), cât și alelele knockout (399-bp). Secvențele oligonucleotidice au fost după cum urmează: Ffar1 în amonte de regiunea eliminată înainte, 5'-cccagcttggtctacactctccatc-3 '; Ffar1 în aval de regiunea ștearsă inversă, 5′-gatggcttggtacccgaaggggaag-3 ′; și neo înainte, 5′-gggtgggattagataaatgcctgctct-3 ′. Șoarecii Ffar1 +/− au fost apoi încrucișați pentru a genera șoareci Ffar1 -/-. Șoarecii Ffar1 -/- au fost încrucișați la șoareci C57BL/6NCrl timp de> 10 generații pentru a genera șoareci într-un fundal B6.

Secreția de insulină in vivo ca răspuns la acizi grași liberi acut crescuți.

Șoarecii Ffar1 +/+ și Ffar1 -/- nedeclarați, în funcție de vârstă și sex, au primit injecție intraperitoneală fie cu soluție salină, fie cu agonistul β3 CL-316,243 (Sigma-Aldrich) la 1 mg/kg (8). La cincisprezece minute după injectare, s-au colectat ~ 700 μl de sânge de la fiecare șoarece prin puncție cardiacă imediat după asfixierea CO2. Pentru a păstra peptida 1 asemănătoare glucagonului (GLP-1), s-a adăugat inhibitor DPP-IV (Linco) la tuburile pre-răcite de colectare a sângelui (BD Microtainer 365974; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) și plasmă izolată prin centrifugare la 5.000 rpm timp de 10 min, menținând o temperatură de 4 ° C. Alicote de probe de plasmă au fost depozitate la -80 ° C până la analiză. Nivelurile plasmatice de insulină și GLP-1 (7-36) amidă au fost estimate folosind kituri de la Meso Scale Discovery (Gaithersburg, MD). Nivelurile de leptină, amilină și glucagon au fost măsurate folosind trusele Lincoplex Luminex (Linco Research, St. Charles, MO). Glucoza, acizii grași liberi și trigliceridele au fost măsurate folosind truse comerciale de la Wako Diagnostics (Richmond, VA).

Dieta bogată în grăsimi - studii de hrănire.

Toți șoarecii studiați au fost înțărcați pe Lab Rodent Diet 20 (4,5% grăsime; PMI Nutrition International) și, dacă nu se specifică, au fost adăpostiți în cuști din policarbonat într-un mediu specific fără patogeni pe un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore la o temperatură de 22 ° C. Într-un studiu, șoarecii de la generația N6 de reîncrucișare în fundal B6 au fost hrăniți timp de 8 săptămâni cu o dietă diabetogenă Surwit (58% din calorii din untură) sau o dietă semipurificată cu conținut scăzut de grăsimi (D12450B; 10% din caloriile din grăsimi; Research Diets, New Brunswick, NJ) ad libitum. Într-un studiu separat, șoarecii la ≥N10 de încrucișare în fundal B6 au fost hrăniți cu o dietă semipurificată cu 60% calorii din grăsimi (Research Diets). Compoziția corpului a fost evaluată prin spectroscopie de rezonanță a magnetului nuclear. Șoarecii au fost uciși prin asfixiere cu CO2 pentru colectarea de sânge și țesuturi după 4 ore de post. Nivelurile de glucoză plasmatică, acid gras și trigliceride au fost măsurate așa cum s-a descris mai sus. Lipidele hepatice neutre (esterul colesterolului, colesterolul liber și trigliceridele) au fost analizate prin cromatografie lichidă de înaltă performanță așa cum s-a descris anterior (9). Toate studiile au fost efectuate într-o asociație americană pentru îngrijirea animalelor de laborator - unitate acreditată, în conformitate cu protocoalele aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor Schering-Plough Research Institute.

Test de toleranță la glucoză și insulină.

Sângele a fost colectat după 16 ore de post, iar nivelurile bazale de glucoză au fost măsurate folosind o metodă de glucoză oxidază (Glucometer Elite; Bayer, Elkhart, IN). După această măsură, glucoza (3 g/kg corp greutate) sau insulina (0,75 mU/g corp greutate) au fost administrate prin injecție intraperitoneală, iar sângele a fost colectat din vena cozii la 20, 40, 60, 90 și 120 de minute după doza pentru determinarea glucozei.

Analiza datelor.

Datele sunt raportate ca mijloace ± SE. Analizele statistice au fost efectuate cu GraphPad Prism (versiunea 4.00; Software GraphPad) folosind teste t ale Studentului, ANOVA unidirecțională sau ANOVA bidirecțională, în funcție de structurile de date. Metodele specifice utilizate sunt indicate în text. Valorile P -/- șoareci, un segment al genei care codifică o parte a celui de-al doilea domeniu transmembranar, toate primele domenii extracelulare și o parte a celui de-al treilea domeniu transmembranar al proteinei FFAR1 au fost vizate prin recombinare omoloagă (Fig. 1A) . Celulele ES vizate au fost examinate mai întâi prin PCR, iar clonele pozitive au fost identificate prin Southern blot folosind sonde care hibridizează în afara și adiacente brațelor de construcție vizate. Șoarecii Ffar1 -/- au fost derivați dintr-o clonă ES pozitivă (ES 1315) (Fig. 1B). Exemple de genotipuri PCR de la șoareci individuali Ffar1 +/+ (de tip sălbatic), Ffar1 +/− (Het) și Ffar1 -/- (knockout) sunt prezentate în Fig. 1C. După cum a fost evaluat prin RT-PCR cantitativă în timp real, șoarecilor Ffar1 -/- le lipsește expresia ARNm Ffar1 în insulele pancreatice sau în splină (Fig. 1D). Șoarecii Ffar1 -/- s-au născut la raportul mendelian 1: 2: 1 așteptat și au apărut sănătoși și fertili și nu au fost detectate anomalii la examinarea brută. În condiții de hrănire chow, nu am observat nicio diferență evidentă în fenotipurile metabolice între șoarecii Ffar1 +/+ și Ffar1 -/-.

Secreția de insulină stimulată de acid gras a fost atenuată la șoareci Ffar1 -/- in vivo.

DISCUŢIE

Acizii grași liberi reprezintă ceva Jekyll și Hyde în ceea ce privește bolile metabolice. Deși o creștere a acidului gras plasmatic servește drept unul dintre indicii nutriționali care duc la creșterea secreției de insulină postprandială, creșterea pe termen lung a acizilor grași liberi de plasmă observată în obezitate este considerată a contribui la reducerea secreției de insulină și, în cele din urmă, a disfuncției insulelor și a dezvoltării diabet de tip 2. În acest context, înțelegerea funcției FFAR1 ca receptor de suprafață celulară pentru acizi grași devine foarte importantă. În acest scop, am generat o linie de șoareci Ffar1 -/- de utilizat ca instrument în studierea acestui receptor.

În concluzie, prezentul studiu demonstrează că FFAR1 contribuie la menținerea metabolismului bazal și că ștergerea FFAR1 nu protejează șoarecii de boala metabolică indusă de dietă bogată în grăsimi. Rezultatele noastre, împreună cu cele din studiile recent publicate (7,12-14), susțin în comun că antagoniștii FFAR1 nu pot oferi beneficii semnificative pentru diabetul de tip 2 asociat obezității.

Generația de șoareci Ffar1 -/-. A: Vedere schematică a regiunilor epuizate în gena Ffar1. Un fragment de 152 bp corespunzător poziției 143–294 a cadrului de citire deschis al genei Ffar1 (NM_194057) a fost înlocuit cu o casetă neo. Cele două bare negre de sub panoul inferior reprezintă pozițiile sondelor de 5 ′ și 3 ′ utilizate pentru sudarea sudică. B: Blotarea sudică a clonelor celulare ES. Sunt prezentate probe de ADN de la două clone ES nedestinate și o clonă țintită (ES 1315) digerată de EcoRV și sondată cu o sondă de 5 ′ și de HindIII și respectiv sondată cu o sondă de 3 ′. C: genotiparea PCR reprezentativă a probelor de ADN de la cleme de coadă a șoarecilor Ffar1 +/+ (WT) și Ffar1 -/- (KO). Alela WT are 234 bp, iar alela KO are 399 bp. D: Exprimarea ARNm Ffar1 în insulele pancreatice și splina șoarecilor Ffar1 +/+ (WT) și Ffar1 -/- (KO) accesate prin PCR cantitativă în timp real.

Caracterizări metabolice ale șoarecilor Ffar1 +/+ și Ffar1 -/- după 8 săptămâni pe o dietă cu conținut scăzut de grăsimi și dietă cu conținut ridicat de grăsimi. Șoarecii Ffar1 +/+ și Ffar1 -/- la generația N6 de încrucișare în fundal B6 au fost hrăniți timp de 8 săptămâni pe o dietă diabetogenă Surwit (58% din caloriile din untură) sau o dietă semipurificată cu conținut scăzut de grăsimi (10% din caloriile din grăsimi) ) ad libitum. n = 5 șoareci per grup. Greutatea corporală și grăsimea corporală au fost monitorizate săptămânal. Aportul alimentar a fost măsurat săptămânal. Testele de toleranță la glucoză (GTT) au fost efectuate înainte ca șoarecii să fie uciși pentru probe de sânge și colectare de țesuturi. A: Greutatea corporală a dietei cu conținut scăzut de grăsimi - șoareci hrăniți. B: Greutatea corporală a dietei bogate în grăsimi - șoareci hrăniți. C: Aportul alimentar acumulat al dietei cu conținut scăzut de grăsimi - șoareci hrăniți. D: Aport acumulat de alimente cu diete bogate în grăsimi - șoareci hrăniți. E: Grăsime corporală a dietei cu conținut scăzut de grăsimi - șoareci hrăniți. F: Grăsime corporală a dietei cu conținut scăzut de grăsimi - șoareci hrăniți. G: Test de toleranță la glucoză pentru o dietă săracă în grăsimi - șoareci hrăniți. H: Test de toleranță la glucoză pentru o dietă cu conținut scăzut de grăsimi - șoareci hrăniți. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SE. * P +/+ și Ffar1 -/- șoareci la fiecare moment.

Caracterizări metabolice ale șoarecilor Ffar1 +/+ și Ffar1 -/- după 10 săptămâni pe 60% dietă bogată în grăsimi (HFD). Șoarecii Ffar1 +/+ și Ffar1 -/- după 10 generații de reîncrucișare în fundal B6 au fost hrăniți timp de 10 săptămâni pe dietă semipurificată bogată în grăsimi (60% calorii din grăsimi). n = 11, Ffar1 +/+ mascul; n = 9, Ffar1 -/- mascul; n = 10, Ffar1 +/+ feminin; n = 10, Ffar1 -/- feminin. Greutatea corporală a fost monitorizată săptămânal, iar grăsimea corporală a fost evaluată la fiecare 4 săptămâni. Testele de toleranță la glucoză (GTT) și testele de toleranță la insulină (ITT) au fost efectuate la sfârșitul studiului. A: Greutatea corporală a șoarecilor masculi. B: Greutatea corporală a șoarecilor femele. C: Grăsime corporală a șoarecilor masculi. D: Grăsime corporală a șoarecilor femele. E: GTT de șoareci masculi. F: ITT la șoareci masculi. Datele sunt prezentate ca mijloace ± SE.

Parametrii plasmatici și hepatici ai șoarecilor Ffar1 +/+ și Ffar1 -/- după 8 săptămâni cu o dietă cu 10% cu conținut scăzut de grăsimi și 58% cu o dietă cu conținut ridicat de grăsimi

Lipide hepatice ale șoarecilor Ffar1 +/+ și Ffar1 -/- după 10 săptămâni pe o dietă bogată în grăsimi de 60%

Mulțumiri

Institutul de cercetare Schering-Plough este finanțat integral de Schering-Plough Corporation.

Suntem recunoscători pentru sprijinul tehnic oferit de Andrei Golovko cu privire la expresia genelor și de la Ling Pang cu privire la analiza insulinei. Mulțumim doctorilor. Timothy Kowalski și Ruth Duffy pentru discuții critice și doctorii. Marvin Bayne și Michael Graziano pentru sprijin administrativ.

Note de subsol

Publicat înainte de tipărire la http://diabetes.diabetesjournals.org pe 4 august 2008.

Cititorii pot folosi acest articol atâta timp cât lucrarea este citată în mod corespunzător, utilizarea este educativă și nu are scop lucrativ, iar lucrarea nu este modificată. Consultați http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ pentru detalii.

Costurile de publicare a acestui articol au fost suportate parțial prin plata taxelor de pagină. Prin urmare, acest articol trebuie marcat „publicitate” în conformitate cu 18 U.S.C. Secțiunea 1734 doar pentru a indica acest fapt.

    • Acceptat la 18 iulie 2008.
    • Primit la 1 mai 2008.
  • DIABET