Efectele dietei „sănătoase” și inhibarea aldozei reductazei

  1. Irina G. Obrosova 1,
  2. Olga Ilnytska 1,
  3. Valeriy V. Lyzogubov 1,
  4. Ivan A. Pavlov 1,
  5. Nazar Mashtalir 1,
  6. Jerry L. Nadler 2 și
  7. Viktor R. Drel 1
  1. 1 Centrul de cercetare biomedicală Pennington, Universitatea de Stat din Louisiana, Baton Rouge, Louisiana
  2. 2 Divizia de endocrinologie și metabolizare, Universitatea din Virginia Health Science System, Charlottesville, Virginia
  1. Adresați cererile de corespondență și retipărire către Irina G. Obrosova, dr., Pennington Biomedical Research Center, Louisiana State University, 6400 Perkins Rd., Baton Rouge, LA 70808. E-mail: obrosoigpbrc.edu

Efectele dietei „sănătoase” și inhibarea aldozei reductazei

Abstract

OBIECTIV-Subiecții cu obezitate alimentară și pre-diabet au un risc crescut de a dezvolta atât încetinirea conducerii nervoase, cât și neuropatie mică a fibrelor senzoriale. Modelele animale ale acestui tip de neuropatie nu au fost descrise. Acest studiu a evaluat modificările neuropatice și adaptabilitatea lor la intervenții dietetice și farmacologice la șoareci hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (HFD), un model de pre-diabet și obezitate alimentară.

neuropatia

PROIECTARE ȘI METODE DE CERCETARE—Șoarecii C57BL6/J femele au fost hrăniți cu diete normale sau HFD timp de 16 săptămâni.

REZULTATE—Șoarecii hrăniți cu HFD au dezvoltat obezitate, au crescut concentrațiile plasmatice de FFA și insulină și au afectat toleranța la glucoză. Au avut, de asemenea, deficite de conducere nervoasă și senzorială, alodinie tactilă și hipoalgezie termică, în absența pierderii fibrelor nervoase intraepidermice sau a atrofiei axonale. În ciuda absenței hiperglicemiei evidente, șoarecii au prezentat o activitate crescută a căii sorbitolului în nervul periferic, precum și 4-hidroxinonenal adduct nitrotirozină și poli (ADP-riboză) și supraexpresie 12/15-lipoxigenază în nervii periferici și neuronii ganglionului rădăcinii dorsale . O hrănire de 6 săptămâni cu chow normal după 16 săptămâni cu HFD a atenuat alodinia tactilă și, în esență, a corectat hipoalgezia termică și deficitul de conducere senzorială a nervului, fără a afecta încetinirea conducerii nervului motor. Chow normal care conține fidarestat inhibitor de aldoză reductază (16 mg · kg -1 -1 zi -1) a corectat toate modificările funcționale ale neuropatiei induse de HFD.

CONCLUZII—Similar cu subiecții umani cu pre-diabet și obezitate, șoarecii hrăniți cu HFD dezvoltă anomalii funcționale ale nervilor periferici, dar nu structurali, și, prin urmare, sunt un model adecvat pentru evaluarea abordărilor dietetice și farmacologice pentru a opri progresia și a inversa neuropatia diabetică în stadiul incipient a bolii.

  • DRG, ganglion rădăcină dorsală
  • HFD, dietă bogată în grăsimi
  • HNE, hidroxinonenal
  • IGT, toleranță la glucoză afectată
  • MNCV, viteza de conducere a nervului motor
  • NEFA, acid gras neesterificat
  • NT, nitrotirozină
  • PARP, poli (ADP-riboză) polimerază
  • PDN, neuropatie diabetică periferică
  • SNCV, viteza de conducere nervoasă a senzorului
  • TBS, soluție salină tamponată cu Tris

Documentația clinică a neuropatiei obezității și pre-diabetului dictează necesitatea dezvoltării unor modele animale adecvate pentru studierea mecanismelor patogenetice și a tratamentelor potențiale. Un studiu recent (11) la șobolanii grași Zucker a caracterizat neuropatia pre-diabetului și obezitatea cauzată de o combinație de factori ereditari și nutriționali. Nu a fost descris un model animal cu fond genetic normal și PDN indus de obezitate alimentară, care s-ar potrivi în mod ideal studiilor de intervenție dietetică și de stil de viață. Aici, oferim dovezi că, asemănător cu subiecții umani cu obezitate alimentară și IGT, șoarecii alimentați cu dietă bogată în grăsimi (HFD) dezvoltă anomalii funcționale ale nervului periferic, dar nu structurale și, prin urmare, reprezintă un model adecvat pentru evaluarea abordărilor dietetice și farmacologice ale stopează progresia și inversează neuropatia diabetică în stadiul incipient al bolii. Anomaliile metabolice cheie arătate anterior contribuind la PDN [creșterea activității căii sorbitolului, stresul oxidativ-nitrozativ, activarea poli (ADP-riboză) polimerazei [PARP] și supraexprimarea 12/15-lipoxigenazei] sunt identificabile în stadiul IGT, înainte dezvoltarea hiperglicemiei de post.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Reactivi.

Anestezie, eutanasie și prelevare de țesuturi.

Animalele au fost sedate cu CO2 (12) și ucise imediat prin luxația colului uterin. Un nerv sciatic de la fiecare șoarece (punct de timp de 16 săptămâni) a fost disecat rapid și înghețat în azot lichid pentru evaluarea ulterioară a concentrațiilor intermediare ale căii sorbitolului și a expresiei 12/15-lipoxigenazei. Un alt nerv sciatic, ganglionii rădăcinii dorsale (DRG) și tampoanele piciorului au fost fixați în formalină tamponată normală cu 4%. Nervul sciatic și DRG au fost utilizate pentru a evalua aductele NT, 4-HNE, poli (ADP-riboză) și 12/15-lipoxigenaza prin histochimie imunofluorescentă. Aductele NT și HNE sunt variabile general acceptate ale leziunii induse de peroxinitrit și peroxidarea lipidelor (o amprentă a stresului oxidativ), respectiv. Picioarele au fost utilizate pentru a evalua densitatea fibrelor nervoase intraepidermice. Nervii tibiali au fost fixați (vezi mai jos) și ulterior utilizați pentru evaluarea diametrului fibrei mielinizate și a grosimii mielinei. Nervii sciatici de la șobolani în vârstă de 22 de săptămâni au fost tratați în mod similar și utilizați pentru evaluarea variabilelor descrise mai sus.

Testele fiziologice.

MNCV sciatic și SNCV digital al membrelor posterioare au fost măsurate așa cum s-a descris anterior în altă parte (13). În toate măsurătorile, temperatura corpului a fost monitorizată de o sondă rectală și menținută la 37 ° C cu un tampon de încălzire. Temperatura pielii membrelor posterioare a fost, de asemenea, monitorizată de un termistor și menținută între 36 și 38 ° C prin căldură radiantă.

Teste comportamentale

Răspunsuri tactile.

Algezia termică.

Pentru a determina sensibilitatea la căldură nocivă, șobolanii au fost așezați într-o cameră de plexiglas pe o suprafață de sticlă transparentă și au fost lăsați să se aclimatizeze timp de cel puțin 20 de minute. S-a folosit un contor de stimulare termică (IITC model 336 TG Combination Tail Flick & Paw algesia meter). Dispozitivul a fost activat după plasarea stimulatorului direct sub suprafața plantară a labei posterioare. S-a înregistrat latența de retragere a labei ca răspuns la căldura radiantă (intensitate de 15% care a produs o rată de încălzire de ± 1,3 ° C pe s, timp de întrerupere 30 s). Temperatura podelei a fost setată la ∼32–33 ° C (setarea producătorului). Măsurătorile individuale au fost repetate de patru până la cinci ori și valoarea medie calculată.

Studii imunohistochimice.

Toate secțiunile au fost procesate de un singur investigator și evaluate orbește. Anticorpii primari au fost omiși în controalele negative. Observații cu putere redusă a secțiunilor de piele colorate pentru PGP 9.5 au fost făcute folosind un microscop Zeiss Axioskop. Imaginile color au fost capturate cu o cameră cu dispozitiv cuplat încărcat Zeiss Axiocam HRc la o rezoluție de 1.300 × 1.030. Imaginile cu putere redusă au fost generate cu un obiectiv de 40 × acroplan folosind funcția de captare automată a software-ului Zeiss Axiovision (versiunea 3.1.2.1). Observații cu putere redusă a secțiunilor nervului sciatic și DRG colorate pentru aductele HNE, NT și poli (ADP-riboză) au fost făcute folosind un microscop de imagistică Zeiss Axioplan 2. Imaginile color au fost capturate cu un aparat foto-fotografic CoolSNAPHQ cuplat încărcat cu o rezoluție de 1.392 × 1.040. Imaginile cu putere redusă au fost generate cu un obiectiv acroplan de 40 × folosind software-ul RS Image 1.9.2.

NT, HNE aduct și 12/15-lipoxigenază imunoreactivități în nervul sciatic și neuroni DRG.

Imunoreactivitate poli (ADP-riboză).

Imunoreactivitatea poli (ADP-riboză) a fost evaluată așa cum s-a descris anterior (13) cu modificări minore. Pe scurt, secțiunile au fost deparafinizate în xilen, hidratate în concentrații scăzute de etanol și spălate în apă. Legarea nespecifică a fost blocată cu reactivul de blocare IG al mouse-ului furnizat cu Vector M.O.M. Kit de bază pentru imunodetecție. Apoi anticorpul monoclonal anti-poli (ADP-riboză) de șoarece a fost diluat 1: 100 în 1% BSA în soluție salină tamponată Tris (TBS) și aplicat peste noapte la 4 ° C în camera de umiditate. Anticorpul anti-șoarece secundar Alexa Fluor 488 de capră a fost diluat 1: 200 în TBS și aplicat timp de 2 ore la temperatura camerei. Secțiunile au fost montate în reactiv antifade auriu prelungit. Cel puțin 10 câmpuri din fiecare secțiune au fost examinate pentru a selecta o imagine reprezentativă. Imaginile reprezentative au fost microfotografiate, iar numărul de nuclei poli (ADP-riboză) pozitivi în nervii sciatici și DRG a fost calculat pentru fiecare microfotografie. Pentru evaluarea imunofluorescenței poli (ADP-riboză) în neuronii DRG, intensitatea colorării neuronale a fost clasificată de la 1 la 3. Numărul de neuroni DRG cu slab (grad 1), moderat (grad 2) și intens (grad 3) imunofluorescența poli (ADP-riboză) a fost calculată ca procent din numărul total de neuroni DRG care prezintă imunofluorescența poli (ADP-riboză).

Densitatea fibrelor nervoase intraepidermice.

Morfometria nervului tibial.

Morfometria nervului tibial a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (18). Nervii tibiali au fost fixați peste noapte la 4 ° C în 2,5% glutaraldehidă tamponată cu 0,05 mmol/l cacodilat de sodiu (pH 7,3). Probele fixe au fost postfixate în 1% tetroxid de osmiu și deshidratate printr-o serie crescătoare de concentrații de etanol. Nervii fixați au fost încorporați în epon și polimerizați. Secțiunile nervoase transversale cu semitină groasă de un micron - au fost colorate cu albastru de toluidină. Pentru analiza morfometrică, diametrul fibrelor nervoase mielinizate și grosimea mielinei au fost măsurate la o mărire de × 1.600 printr-un sistem de analiză a imaginii asistat de computer (NIH Image și scaner Agfa Arcus conectat la Macintosh Quadra 700, Cupertino, CA), așa cum s-a descris anterior ( 18).

Studii biochimice

Calea Sorbitol intermediari.

Concentrațiile de glucoză, sorbitol și fructoză din nervul sciatic au fost evaluate spectrofluorometric prin proceduri enzimatice cu hexokinază/glucoză-6-fosfat dehidrogenază, sorbitol dehidrogenază și fructoză dehidrogenază, așa cum s-a descris anterior (12).

Analiza Western blot a expresiei proteinei 12/15-lipoxigenazei.

analize statistice.

Rezultatele sunt exprimate ca medii ± SE. Datele au fost supuse testului egalității de varianță F și apoi la transformarea jurnalului, dacă este necesar, înainte de ANOVA unidirecțională. În cazul în care semnificația generală (P 0,45 și P> 0,09 vs. șoareci hrăniți cu șoareci standard, respectiv); cu toate acestea, concentrațiile de glucoză din sânge nu au revenit la nivelurile bazale în niciuna dintre aceste două grupuri (Fig. 1D și E). Concentrațiile serice de NEFA au fost cu 98% mai mari la șoarecii hrăniți cu HFD comparativ cu cei hrăniți cu șoareci standard (1,14 ± 0,275 și 0,576 ± 0,031 meq/l, șoareci P -/- sau șoareci diabetici de tip sălbatic tratați cu un inhibitor de 12/15-lipoxigenază decât la șoarecii diabetici de tip sălbatic netratați (50). Prin urmare, este destul de plauzibil ca supraexprimarea 12/15-lipoxigenază, cel puțin parțial, să explice stresul oxidativ-nitrozativ crescut și activarea PARP în nervii periferici și neuronii DRG la șoarecii hrăniți cu HFD.

În concluzie, șoarecele hrănit cu HFD este un model animal de pre-diabet și obezitate care dezvoltă modificări funcționale, dar nu structurale, ale fibrelor nervoase motorii și senzoriale mari și ale fibrelor nervoase senzoriale mici PDN și afișează dovezi ale activității crescute a căii sorbitolului, oxidativ -stresul nitrozativ, activarea PARP și activarea 12/15-lipoxigenazei care se dezvoltă în absența hiperglicemiei evidente. La fel ca alte modele animale de boală umană, modelul de șoarece hrănit cu HFD poate avea limitări care pot fi identificate în mod corespunzător numai după obținerea unui consens asupra manifestărilor de neuropatie la subiecții umani cu afecțiuni (IGT, obezitate și sindrom metabolic) care preced și conduc adesea la dezvoltarea diabetului evident. O intervenție pe termen scurt, cu o dietă sănătoasă cu grăsimi normale și o dietă normală cu grăsimi plus fidarestat, a dus la dispariția esențială a modificărilor funcționale asociate fie neuropatiei senzoriale (numai dietetice), fie ambelor senzoriale și motorii (dieta plus ARI). Aceste constatări subliniază rațiunea dezvoltării abordărilor nutriționale pentru tratamentul precoce al neuropatiei și altor complicații asociate diabetului la subiecții umani cu IGT, obezitate și sindrom metabolic care includ două dintre tulburările menționate anterior.