Abstract

Grăsimile trans sunt o formă de grăsimi nesaturate, care sunt relativ rare în natură, dar sunt prezente din abundență în „fast-food” și în multe alimente procesate care sunt consumate excesiv în țările dezvoltate. Grăsimile trans diferă de majoritatea acizilor grași nesaturați datorită unei duble legături întrans”Configurare în locul standardului”cis”Configurare. Această modificare structurală are ca rezultat o specie de acid gras care este mai dreaptă și seamănă mai mult cu structura unui acid gras saturat. Se consideră că această modificare structurală joacă un rol deosebit de important în toxicitatea grăsimilor trans (41). Sursa principală de grăsimi trans din dieta noastră este de la hidrogenarea parțială a uleiurilor vegetale, care este un proces industrial utilizat pentru a transforma uleiurile în grăsimi semisolide pentru a fi utilizate în produse de patiserie, fast-food-uri prăjite și margarine. Consumul de doar una sau două porții din aceste produse poate depăși adesea aportul zilnic recomandat de grăsimi trans. Grăsimile trans reprezintă aproximativ 2-3% din totalul caloriilor consumate de americani, dar s-a recomandat ca aportul să nu fie mai mare de 1% din consumul total de calorii (2, 35).

Consumul de grăsimi trans este asociat cu un risc crescut de boli coronariene (5, 36, 37). În plus, grăsimile trans pot exacerba diabetul, așa cum sugerează rezistența crescută la insulină la rozătoarele hrănite cu grăsimi trans, deși datele care leagă grăsimile trans de diabetul la oameni sunt contradictorii (16, 18, 34, 51). Rezistența la insulină și bolile vasculare se întâlnesc frecvent la persoanele cu NAFLD, iar aceste boli au factori de risc comuni. Mai multe studii recente au demonstrat o creștere a evenimentelor cardiovasculare la pacienții cu NAFLD, independent de factorii de risc convenționali (4, 13, 19, 49). Deși consumul unei diete bogate în grăsimi de către rozătoare duce la dezvoltarea unei boli hepatice grase experimentale, importanța specifică a grăsimilor trans fie asupra bolii hepatice grase, fie experimentale sau umane, nu a fost abordată anterior. Prin urmare, am căutat să comparăm efectul unei diete de grăsimi trans care constă în principal din trans-18: 1, n-6, specia găsită în cea mai mare abundență în grăsimile trans consumate din surse industriale, cu un standard caloric ridicat de grăsimi (trans fără grăsimi) dietă privind dezvoltarea bolilor hepatice grase experimentale.

Animale și protocol experimental.

Șoarecii masculi AKR/J au fost cumpărați de la Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME), iar șoarecii aveau vârsta de 9-10 săptămâni la începutul fiecărui experiment. Animalele au fost găzduite într-o cameră cu temperatură controlată (22 ° C) cu lumină de 14 ore: 10 ore ciclism întunecat și hrănite cu Harlan Teklad chow (Madison, WI) înainte de experimentare, cu acces gratuit la alimente și apă. Șoarecilor li s-a administrat fie o dietă standard cu conținut ridicat de grăsimi trans, fie o dietă de control (Research Diets, New Brunswick, NJ) timp de 10 zilen = 6-8 pe grup), 4 săptămânin = 5-6 pe grup), sau 8 săptămânin = 4-5 per grup). Au fost utilizate cohorte separate de șoareci pentru fiecare moment experimental.

tabelul 1. Compoziții dietetice

PUFA, acizi grași polinesaturați; SFA, acizi grași saturați.

Determinarea nivelului chimic și hormonal.

Nivelurile serice de alanină aminotransferază (ALT) au fost determinate folosind un kit spectrofotometric achiziționat de la Biotron Diagnostics (Hemet, CA). Nivelurile de trigliceride serice și hepatice au fost determinate folosind un kit de testare spectrofotometrică achiziționat de la Thermo Electron (Louisville, CO). Concentrația de proteine ​​a omogenatului hepatic a fost determinată cu un reactiv de testare Coomassie (Pierce, Rockford, IL) și BSA ca standard. Conținutul de trigliceride hepatice a fost normalizat la conținutul de proteine ​​al omogenatului. Nivelurile serice de insulină, leptină și interleukină-1β hepatică (IL-1β) au fost analizate cu plăci cu mai multe godeuri achiziționate de la Meso Scale Discovery (MSD) (Gaithersburg, MD), utilizând SECTOR Imager 2400 (MSD), conform instrucțiunilor producătorului. Ficatul a fost omogenizat în tampon de liză (pH 7,4, 50 mM Tris · HCI, 150 mM NaCI, 25 mM EDTA, 5 mM EGTA, 0,25% Na-deoxicolat, 1% Igepal-630, 0,5 mM DTT, 1% BSA) pentru determinare a nivelurilor hepatice de IL-1β. Nivelurile de glucoză în post au fost determinate folosind un glucometru cu reflectanță (One Touch II, Lifescan, CA). Indicele cantitativ de verificare a sensibilității la insulină (QUICKI) a fost calculat ca o măsură a sensibilității la insulină; QUICKI = 1/[log (insulină de post) + log (glucoză de post)].

Cromatografie lichidă cu proteine ​​rapide și colesterol seric.

Lipoproteinele serice au fost fracționate cu un sistem de cromatografie lichidă rapidă cu proteine ​​AKTA (FPLC) utilizând volume egale de plasmă reunită din cohorte de șoareci pe coloanele tandem Superose 6 FPLC (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Coloanele au fost apoi eluate cu 200 mmol/l fosfat de sodiu (pH 7,4), 50 mmol/l NaCI, 0,03% (greutate/vol) EDTA și 0,02% (greutate/vol) azidă de sodiu la un debit de 0,4 ml/min. Conținutul de colesterol din fracțiunile eluate a fost măsurat cu o tehnică de testare a microplăcilor. Colesterolul serului și al fracțiilor eluate a fost determinat cu un kit de reactivi de testare enzimatică (Sigma, St. Louis, MO). Nivelurile Apo B-100 ale fracțiilor LDL grupate au fost determinate folosind anticorpi policlonali de iepure (1: 500) direcționați împotriva apoB-100 de șoarece (Biodesign International, Saco, ME) așa cum s-a descris anterior (40).

PCR cantitativ în timp real.

ARN-ul a fost izolat din ficat utilizând reactivul Trizol cumpărat de la Invitrogen (Carlsbad, CA). Prima sinteză a ADNc-catenă a fost realizată prin transcriere inversă a 2 μg de ARN total cu un kit de sinteză ADNc iScript de la Bio-Rad (Hercules, CA). PCR în timp real a fost efectuată folosind 2 μl din ADNc total într-o reacție de 25 μl care conține QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen, Valencia, CA) (secvențe de exemplu enumerate în Tabelul 2). Amplificarea a fost efectuată în duplicat pentru fiecare probă într-un Detector de Secvență Aplicat Biosystems 7300 (Foster City, CA) și cantitatea de ARNm a fost normalizată cu GAPDH utilizat ca control endogen.

masa 2. Grunduri pentru PCR cantitativă în timp real

analize statistice.

Datele sunt prezentate ca mijloace ± SE. Comparațiile între grupuri au fost efectuate cu ANOVA unidirecțională și metoda Holm-Sidak pentru comparații multiple în perechi. SigmaStat 3.0 a fost utilizat pentru a calcula rezultatele, iar semnificația a fost definită ca P

grăsimi

FIG. 1.Valorile serice ale alaninei aminotransferazei (ALT). La 10 zile și 4 săptămâni nu a existat nicio diferență semnificativă în valorile ALT între grupuri. La 8 săptămâni, grupul de grăsimi trans a avut valori mai mari ale ALT comparativ cu grupul standard cu conținut ridicat de grăsimi și cel de control (*P

Șoarecii trans hrăniți cu grăsime au câștigat mai puțină greutate după 8 săptămâni, comparativ cu șoarecii standard hrăniți cu grăsimi, dar au avut o creștere similară a steatozei hepatice.

După 10 zile, 4 săptămâni și 8 săptămâni în dietele lor respective, șoarecii standard cu conținut ridicat de grăsimi și trans-hrăniți cu grăsimi au avut o creștere în greutate crescută comparativ cu șoarecii care au primit dieta de control. Cu toate acestea, până la 8 săptămâni șoarecii cu conținut ridicat de grăsimi au câștigat mai multă greutate decât șoarecii trans-hrăniți cu grăsimi (Fig. 2A). După 8 săptămâni, grupurile cu conținut ridicat de grăsimi și grăsimi trans au avut o creștere similară a conținutului de trigliceride hepatice și ambele grupuri au avut un conținut de trigliceride hepatice semnificativ mai mare decât grupul de control (Fig. 2B).

FIG. 2.Creșterea în greutate și steatoza hepatică. A: după 10 zile, 4 săptămâni și 8 săptămâni de hrănire atât a grăsimilor trans, cât și a grupurilor standard cu conținut ridicat de grăsimi au avut o creștere a greutății mai mare comparativ cu grupul de control. La 8 săptămâni, grupul cu conținut ridicat de grăsimi a câștigat mai multă greutate decât grupul cu grăsimi trans (*P

Nivelul colesterolului seric și al trigliceridelor la șoarecii hrăniți cu grăsimi trans și la șoarecii standard hrăniți cu conținut ridicat de grăsimi.

Nivelurile colesterolului seric ale șoarecilor hrăniți cu grăsimi au fost mai mari decât șoarecii hrăniți cu grăsimi trans după 10 zile, dar nu au fost statistic diferite de grupul martor (Tabelul 3). După 4 săptămâni și 8 săptămâni de hrănire, nivelurile de colesterol au fost mai mari la șoarecii standard cu conținut ridicat de grăsimi comparativ cu martorul, dar nu a existat nicio diferență semnificativă în grupul hrănit cu grăsimi trans comparativ cu grupul cu conținut ridicat de grăsimi sau de control. Analiza lipoproteinelor a fost efectuată cu FPLC și majoritatea colesterolului din toate grupurile a fost lipoproteina cu densitate mare (HDL). Nivelurile de colesterol cu ​​lipoproteine ​​cu densitate mică (LDL) au fost foarte scăzute și similare în toate grupurile și nu pare să existe nicio diferență în cantitatea de apoB-100 din fracția LDL, sugerând nicio modificare substanțială a densității particulelor LDL ( Fig. Suplimentară S1). Nivelurile serice ale trigliceridelor au fost similare între grupul cu grăsimi trans și cu conținut ridicat de grăsimi la fiecare moment (Tabelul 3).

Tabelul 3. Colesterol seric și trigliceride

Valorile sunt mijloace ± SE (P * trans-grăsime vs. standard bogat în grăsimi,

† standard bogat în grăsimi vs. dieta de control.

Șoarecii hrăniți cu grăsimi trans demonstrează o rezistență mai mare la insulină decât șoarecii cu hrană bogată în grăsimi.

Nivelurile de insulină de post ale șoarecilor hrăniți cu grăsimi trans au fost mai mari decât cele ale șoarecilor hrăniți cu dietă de control la fiecare moment și după 8 săptămâni de hrănire șoarecii standard hrăniți cu grăsimi au avut, de asemenea, niveluri de insulină semnificativ mai mari decât grupul de control. La 4 săptămâni și 8 săptămâni, hrănirea cu grăsimi trans a condus la niveluri semnificativ mai ridicate de insulină la post comparativ cu hrănirea standard cu conținut ridicat de grăsimi (4 săptămâni: 5,3 ± 1,2 vs. 1,4 ± 0,2 ng/ml, P

FIG. 3.Nivelurile serice ale insulinei și valorile cantitative ale indicelui de verificare a sensibilității la insulină (QUICKI). A: nivelurile de insulină în post ale grupului de grăsimi trans au fost semnificativ mai mari decât grupul standard cu conținut ridicat de grăsimi la 4 săptămâni și 8 săptămâni. Ambele grupuri au avut niveluri mai ridicate de insulină decât grupul de dietă martor la 10 zile și 8 săptămâni (*P

Șoarecii hrăniți cu grăsimi trans prezintă niveluri modificate de leptină la 8 săptămâni.

Nivelurile serice de leptină au fost determinate la fiecare moment (Fig. 4). Atât hrănirea standard cu conținut ridicat de grăsimi, cât și hrănirea trans cu grăsimi au condus la niveluri mai ridicate de leptină în fiecare moment comparativ cu hrana pentru dieta de control; cu toate acestea, acest lucru a atins semnificație doar la 8 săptămâni. În plus, la 8 săptămâni, leptina serică a fost semnificativ mai mică la șoarecii hrăniți cu grăsimi trans comparativ cu șoarecii cu hrana bogată în grăsimi (24,8 ± 3,7 față de 41,0 ± 4,5 ng/ml, P

FIG. 4.Nivelurile serice de leptină. Nivelurile de leptină au fost mai mari în grupurile cu grăsimi trans și standard cu conținut ridicat de grăsimi, comparativ cu martorul la 8 săptămâni. La 8 săptămâni, grupul de grăsimi trans a demonstrat, de asemenea, niveluri mai mici de leptină decât grupul cu conținut ridicat de grăsimi (*P

Șoarecii trans hrăniți cu grăsime demonstrează o creștere semnificativă a expresiei genei IL-1β hepatice, precum și niveluri crescute de IL-1β hepatice.

Exprimarea genei hepatice a mai multor citokine pro și antiinflamatoare a fost determinată prin PCR cantitativă în timp real. Expresia genei IL-1β a crescut cu timpul în fiecare grup experimental. La 4 săptămâni și 8 săptămâni a existat o creștere semnificativă a expresiei genei IL-1β hepatice la șoarecii hrăniți cu grăsimi trans, atât față de șoarecii cu hrană bogată în grăsimi, cât și de la șoarecii care au alimentat dieta de control (Fig. 5A). Exprimarea genei hepatice IL-1β a șoarecilor hrăniți cu grăsimi trans a fost de 3,6 ori mai mare la 4 săptămâni (P

FIG. 5.Expresia și nivelurile genei IL-1β hepatice. A: Expresia genei IL-1β a crescut în fiecare grup în timp. La 4 săptămâni și 8 săptămâni, expresia IL-1β a fost semnificativ mai mare în grupul de grăsimi trans (**P

Tabelul 4. Expresia genei citokinelor hepatice

Valorile sunt medii ± SE (P a trans-grăsime vs. standard ridicat de grăsimi,

b trans-grăsime vs. dieta de control,

c standard bogat în grăsimi vs. dieta de control,

d 4 săptămâni vs. 10 zile,

e 8 săptămâni vs. 10 zile,

Deși grăsimile trans au fost corelate cu bolile coronariene, dislipidemia și rezistența la insulină, impactul specific al grăsimilor trans asupra ficatului nu a fost bine studiat (5, 16, 18, 34, 36, 37, 51). Aceste experimente demonstrează că șoarecii hrăniți cu o dietă trans cu grăsimi au rezistență crescută la insulină și niveluri mai ridicate de ALT comparativ cu șoarecii hrăniți cu o dietă experimentală standard cu conținut ridicat de grăsimi. Acest lucru se întâmplă în ciuda dezvoltării unui grad similar de obezitate și steatoză hepatică. Aceste observații sunt însoțite de o creștere substanțială a expresiei genei IL-1β și a nivelurilor de citokine IL-1β în ficat. Rezistența crescută la insulină și creșterea ALT mai dramatică observată la șoarecii hrăniți cu grăsimi trans sugerează că acest model se poate traduce mai bine în boala ficatului gras uman decât dieta standard bogată în grăsimi.

Rezistența la insulină este esențială pentru dezvoltarea NAFLD, iar severitatea rezistenței la insulină se corelează cu o boală hepatică mai avansată (12, 15, 47). O dietă bogată în grăsimi saturate și săracă în grăsimi polinesaturate a fost asociată cu o rezistență crescută la insulină. Cu toate acestea, există dovezi contradictorii cu privire la influența grăsimilor trans dietetice asupra dezvoltării rezistenței la insulină și dacă acestea conduc la o rezistență mai mare la insulină în comparație cu grăsimile saturate (16, 17). Ibrahim și colab. (18) au demonstrat că înlocuirea a 2% din energie din acizi grași saturați și 1% din cis-acizii grași mononesaturați cu 3% grăsimi trans au condus la niveluri mai ridicate de insulină cu post de ~ 17% și la sensibilitate redusă la insulină adipocite la șobolani. De asemenea, au arătat că grăsimile trans au redus fluiditatea membranei adipocite și au sugerat acest lucru ca un posibil mecanism de rezistență crescută la insulină în modelul lor. Alstrup și colab. (3) a arătat, de asemenea, că trans-conformații ale acizilor grași 18: 1delta-9 și 18: 1delta-11 au dus la o producție de insulină semnificativ mai mare din celulele izolate ale insulelor de șoarece comparativ cu cis-configurații.

Relațiile dintre citokinele inflamatorii IL-1β, IL-6, TNF-α și IL-10 și SOCS-1 și SOCS-3 cu rezistență la insulină sunt bine descrise (9, 21, 22, 24, 44, 45, 50 ). S-a demonstrat că IL-1β administrat sistemic crește gluconeogeneza hepatică; cu toate acestea, legătura dintre IL-1β și rezistența la insulină a fost caracterizată în principal în adipocite și celule beta ale insulelor pancreatice (20, 23, 26, 30). În experimentele noastre, creșterea marcată a expresiei genei IL-1β hepatice la 4 săptămâni și 8 săptămâni, în plus față de nivelurile semnificativ mai mari de IL-1β hepatice la 8 săptămâni în grupul alimentat cu grăsimi trans, sugerează un rol pentru IL-1β în ALT mai mare și rezistență crescută la insulină observată. La om, s-a raportat că polimorfismele genetice din IL-1β sunt asociate cu un risc crescut de diabet de tip 2 la indienii de Nord și, de asemenea, asociate cu un risc crescut de sindrom metabolic la cei cu aport scăzut de grăsimi polinesaturate (1, 46). TNF-α, IL-6, IL-10, SOCS-1 și SOCS-3 au fost, de asemenea, implicați ca legături între inflamație și rezistența la insulină, dar nu au existat diferențe semnificative la șoarecii care au alimentat dieta cu grăsimi trans.

Diferențele în colesterolul seric par a fi în primul rând legate de o fracțiune crescută de HDL în grupul bogat în grăsimi, comparativ cu grupurile de grăsimi trans și dietele de control. Deși este posibil ca alimentarea cu grăsimi trans să conducă la niveluri mai scăzute de HDL în comparație cu alimentarea standard cu conținut ridicat de grăsimi, diferența mică în conținutul de colesterol din diete limitează concluziile pe care le putem trage din această constatare. Conținutul de colesterol a fost scăzut în toate dietele și nu a fost adăugat colesterol suplimentar la diete, dar a existat o cantitate ușor mai mare de colesterol în dieta standard bogată în grăsimi, comparativ cu dietele de grăsimi trans și de control. Această diferență s-a datorat sursei de grăsime folosită în diete: untură de porc (adică animală) pentru un conținut ridicat de grăsimi comparativ cu legumele pentru grăsimile trans.

Una dintre limitările cunoscute ale modelului standard de dietă bogată în grăsimi al NAFLD este lipsa dovezilor histologice ale inflamației sau fibrozei la șoareci, în ciuda dezvoltării steatozei și a rezistenței la insulină. De asemenea, am efectuat un experiment de hrănire a șoarecilor grăsimi trans și o dietă standard bogată în grăsimi timp de până la 6 luni, care nu a dus la nici o fibroză hepatică. Scopul experimentului nostru a fost să comparăm efectul grăsimilor trans cu cel al grăsimilor saturate asupra ficatului. Deși hrănirea șoarecilor cu o dietă trans grasă timp de 8 săptămâni nu invocă steatohepatită progresivă, aceasta are ca rezultat o creștere mai pronunțată a ALT și a rezistenței la insulină, condiții sine qua non ale bolii hepatice grase umane.

NAFLD este un predictor independent al bolilor cardiovasculare, chiar și după controlul altor caracteristici ale sindromului metabolic (13, 48, 49). Mai multe studii corelează consumul de grăsimi trans cu evenimentele cardiovasculare, iar grăsimile trans au fost, de asemenea, implicate ca factor de risc independent pentru disfuncția endotelială, inflamația sistemică și dislipidemia, afecțiuni comorbide frecvente la pacienții cu NAFLD (11, 27, 33, 35). Nu s-au efectuat studii dietetice privind aportul de grăsimi trans și NAFLD și există doar câteva studii care au implicat un număr mic de pacienți care examinează aportul de grăsimi dietetice, în legătură cu NAFLD (32). Aceste date indică faptul că șoarecii hrăniți cu o dietă trans cu grăsimi prezintă valori ALT serice mai ridicate, rezistența crescută la insulină și creșterea IL-1β în comparație cu șoarecii hrăniți cu o dietă standard bogată în grăsimi, în ciuda unor cantități similare de steatoză hepatică. Sunt necesare lucrări suplimentare pentru a înțelege mecanismele moleculare prin care grăsimile trans pot fi mai hepatotoxice.

Cercetare susținută de Asociația Americană de Gastroenterologie (AGA) Research Scholar Award (S. W. P. Koppe) și Institutul Național de Diabet și Boli Digestive și Boli Renale RO1DK059580 (R. M. Green).