• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: [email protected]

ABSTRACT

Țesutul adipos este un regulator cheie al homeostaziei energiei sistemice. Starea fiziologică a țesutului adipos este condusă de procese autonome celulare din interiorul adipocitului. În plus, adipocitul în sine este supus unor modificări majore ale altor tipuri de celule care se infiltrează în țesutul adipos, cum ar fi macrofagele și celulele vasculare; în plus, adipocitele pot fi influențate semnificativ de mai mulți hormoni și citokine care circulă sistemic.

Deși toate aceste interacțiuni celulare au făcut obiectul unor studii ample în numeroase laboratoare, matricea extracelulară a țesutului adipos a primit o atenție limitată până în prezent, în ciuda dovezilor care sugerează că este un component relevant din punct de vedere funcțional al fiziologiei țesutului adipos.

În prezent, nu se știe ce efecte consecințe exercită stresul metabolic asupra matricei extracelulare și invers. Cu alte cuvinte, care este impactul dereglării constituenților extracelulari ai țesutului adipos asupra stării metabolice sistemice? Aici, abordăm acest subiect din două perspective diferite. Am evaluat mai întâi nivelul general al componentelor matricei extracelulare în diferite condiții metabolice și am stabilit că constituenții extracelulari sunt reglementați la nivel global în condiții de provocare metabolică. Am selectat apoi un membru specific al familiei de colagen, colagenul VI (care prezintă o expresie predominantă în țesutul adipos) și am utilizat un model genetic de perturbare a colagenului VI pentru a investiga efectele perturbării matricei extracelulare a țesutului adipos. În mod remarcabil, studiile noastre au demonstrat că o astfel de slăbire a matricei extracelulare a țesutului adipos are ca rezultat o îmbunătățire considerabilă a fenotipului metabolic atât în ​​contextul unei diete bogate în grăsimi, cât și într-o provocare cu mutația ob/ob.

Observațiile noastre evidențiază matricea extracelulară a țesutului adipos ca un sit important și nou de modulare a metabolismului sistemic. Țesutul adipos obez prezintă caracteristici similare cu alte țesuturi fibroase, cum ar fi ficatul; acest lucru sugerează că constituenții specifici ai acestui mediu matricial extracelular normal, destul de rigid, pot oferi ținte posibile pentru intervenția farmacologică pentru tratamentul tulburărilor metabolice.

MATERIALE ȘI METODE

Subiecți umani. Acest studiu a fost aprobat de Consiliul de revizuire instituțională al UT Southwestern Medical Center (Dallas, TX). A fost obținut un consimțământ informat în scris de la fiecare participant. Participanții au fost recrutați prin reclame publice (fluturași) plasate în colegii, biserici, temple și magazine alimentare din Asia de Sud în metroplexul Dallas-Fort Worth. Înălțimea și greutatea au fost măsurate prin proceduri standard. Un chestionar general de sănătate a fost administrat de tehnicieni instruiți. Diabetul a fost exclus prin măsurarea glicemiei în plasmă și a nivelurilor de glucoză în repaus în timpul unui test standard de toleranță la glucoză pe cale orală. Biopsia țesutului adipos a fost obținută după repaus peste noapte, folosind un ac de biopsie Dark II de 9 cm (Allegiance) de 9 cm, pentru prelevarea probelor din zone abdominale și gluteale (periferice) subcutanate. După pregătirea pielii cu betadină, a fost făcută o mică incizie a pielii pe peretele abdominal cu un bisturiu cu lame cu numărul 11. Acest lucru a facilitat ghidarea acului de biopsie în spațiul subcutanat care conține grăsime. Grăsimea a fost colectată din peretele abdominal în cadranul inferior drept cu 2 cm deasupra și medial până la tuberozitatea iliacă anterioară și din zona gluteală.

Test de toleranță orală la glucoză și test de toleranță la insulină. Pentru testul de toleranță la glucoză pe cale orală, șoarecii au postit 2 ore înainte de administrarea de glucoză (2,5 g/kg greutate corporală [BW]) prin gavaj oral. Sângele venos din coadă a fost colectat și testat pentru glucoză și insulină. Glucoza a fost măsurată printr-un test oxidază-peroxidază (Sigma-Aldrich), iar insulina a fost măsurată cu un kit de testare imunosorbent legat de enzimă insulină (Millipore, Billerica, MA). Șoarecilor li s-a refuzat accesul la alimente în timpul studiului. Pentru testul de toleranță la insulină, șoarecii au postit 2 ore înainte de administrarea a 1 U de insulină umană (Novo Nordisk)/kg de BW prin injecție intraperitoneală. Sângele venos din coadă a fost colectat și testat pentru glucoză.

Clearance-ul trigliceridelor. Șoarecii au fost posti timp de 2 ore și li s-au administrat 15 μl de ulei de măsline pe gram de greutate corporală prin gavaj oral. Aproximativ 20 μl de sânge au fost colectate în fiecare moment și testate pentru trigliceride (set de trigliceride Infinity; Thermo Electron Corp.) și acizi grași liberi (FFA) (NEFA C; Wako). Șoarecilor li s-a refuzat accesul la alimente în timpul studiului.

Provocare LPS. Șoarecii masculi în vârstă de zece săptămâni au fost injectați intraperitoneal cu lipopolizaharidă (LPS; Sigma-Aldrich) la o doză de 0,1 mg/kg de BW. Pentru cursul timpului de provocare LPS, sângele a fost colectat la 0, 3, 6 și 24 de ore și a fost testat pentru interleukina-6 (IL-6) și proteina chimiotratantă monocită 1 (MCP-1; Sisteme de cercetare și dezvoltare), după cum sa indicat. Pentru examinarea inflamației specifice adipozei ca răspuns la LPS, șoarecii au fost sacrificați la 90 de minute după injecția cu LPS și țesuturile au fost imediat congelate rapid în azot lichid.

PPARγ agonist gavage. Acidul receptor 2- (2- [4-fenoxi-2-propilfenoxi] etil) indol-5-acetic (COOH) al receptorului activat cu proliferatorul peroxizomului (PPARγ) a fost un fel de cadou de la Merck Research Laboratories (Rahway, NJ) . COOH a fost administrat șoarecilor FVB masculi în vârstă de 10 săptămâni prin gavaj oral zilnic la ora 12 la prânz timp de 14 zile la o doză de 10 mg/kg BW. Șoarecii au fost sacrificați la 6 ore după ultimul gol și țesuturile au fost imediat congelate rapid în azot lichid.

Semnalizarea in vivo a insulinei. Șoarecii au fost în post timp de 2 ore și injectați intraperitoneal cu insulină umană la o doză de 1 U/kg BW. Șoarecii au fost sacrificați la 0, 5 sau 10 minute postinjecție și țesuturile au fost imediat congelate în azot lichid. Țesuturile au fost omogenizate în tampon de test radioimunoprecipitare completat cu un cocktail complet de inhibitor de protează și un cocktail de inhibitor de fosfatază (Roche). Proteina lizat a fost analizată direct prin Western blot cu anti-fosfo-AKT (Cell Signaling Technology Inc.) și anti-Akt-1 (Santa Cruz Biotechnology Inc.). Analiza Western blot a fost făcută utilizând sistemul de imagistică cu infraroșu Odyssey (LI-COR Biotechnology).

Analiza PCR cantitativă în timp real. Șoarecii au fost sacrificați și țesutul a fost imediat recoltat și înghețat în azot lichid. ARN-ul a fost extras din țesut folosind reactiv TRIzol (Invitrogen), urmat de izolarea ARN-ului cu trusa de țesut Qiagen RNeasy. ARN total (1 μg) a fost transcris invers cu transcriptaza inversă SuperScript III și oligo (dT) 20 (Invitrogen). PCR cantitativă în timp real (qRT-PCR) a fost realizată utilizând masterul master Sybr Green I și a fost efectuată în Roche Lightcycler 480. Grundurile au fost proiectate pentru a acoperi un intron pentru a preveni amplificarea oricărui ADN genomic contaminant, dacă este prezent. Toate PCR-urile au fost normalizate la ARNr 18S, cu excepția cazului în care se indică altfel, iar nivelurile relative de expresie au fost determinate prin metoda ΔΔCt cu eficiența tuturor primerilor fiind ∼2 (35), ceea ce ne-a permis să facem comparații cu abundența relativă a diferitelor colagene. Seturile de exemple utilizate sunt listate în Tabelul S2 al materialului suplimentar.

Imunohistochimie și proceduri de colorare. Țesutul adipos proaspăt a fost fixat în formalină 10% tamponată cu fosfat peste noapte. Secțiuni de ceară de parafină de 5 μm au fost prelucrate pentru imunocolorare. Pentru colorarea imunohistochimică, secțiunile au fost tratate cu tampon de inactivare a peroxidazei timp de 10 minute la temperatura camerei pentru a stinge activitatea endogenă a peroxidazei (Dako) și au fost incubate cu anticorpi primari timp de 24 ore la 4 ° C. După spălare, secțiunile au fost incubate cu anticorpi secundari biotinilați timp de 1 oră la temperatura camerei și reacția a fost dezvoltată cu reactiv ABC (Vector Laboratories). Toate lamele au fost contracolorate cu hematoxilină (Sigma-Aldrich). Colorarea F4/80 s-a făcut cu un anticorp monoclonal de șobolan (Invitrogen) și anticorp secundar anti-șobolan biotinilat de iepure (Vector Laboratories). Metode de colorare suplimentare au inclus secțiuni cutanate subcutanate care au fost colorate cu colorare Trichrome Masson și hematoxilină și eozină (H&E). Colorarea terminală a deoxinucleotidiltransferazei dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) a fost efectuată în conformitate cu protocolul producătorului (Chemicon). Toate imaginile au fost obținute cu o cameră cu dispozitiv cuplat încărcat răcită Censys (Photometrics, Tucson, AZ) pe un axiofot Zeiss (Zeiss, Jena, Germania).

Cuantificarea dimensiunii adipocitelor. Secțiunile de țesut de la țesutul adipos epididimal și mezenteric de la șoareci de 10 săptămâni au fost colorate cu H&E. Software-ul Image J a fost folosit pentru a măsura suprafața adipocitelor, care este reprezentată ca suprafața medie a adipocitelor (în μm 2) sau, alternativ, ca procent de adipocite în fiecare zonă de 100 μm 2. Mărimea adipocitelor a fost măsurată de la patru șoareci/genotip (> 500 celule/genotip).

Colorarea imunofluorescenței insulinei/glucagonului și cuantificarea dimensiunii insulelor. Țesutul pancreasului a fost fixat în fixatorul Bouin (acid picric saturat-formaldehidă-acid acetic glacial la un raport de 15: 5: 1) timp de 5 ore. Secțiunile de parafină (5 μm) au fost incubate cu imunoglobulină G de măgărui de control (1: 500; Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.) timp de 1 oră pentru a bloca legarea nespecifică. Secțiunile au fost apoi incubate cu anticorpi anti-insulină pentru șobolan (1: 500; un cadou bun de la Regina Kuliawat, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY) și anticorp anti-glucagon anti-iepure (1: 500; Invitrogen) peste noapte la 4 ° C. După ce s-au spălat de trei ori cu 1 × soluție salină tamponată cu fosfat, secțiunile au fost incubate cu anticorp anti-cobai de măgar conjugat cu izotiocianat de fluoresceină și anticorp anti-iepure de măgar conjugat cu roșu Texas (1: 250; Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.) timp de 1 oră la temperatura camerei. Secțiunile colorate cu H & E ale întregului pancreas au fost tăiate astfel încât fața completă a țesutului să fie vizibilă și au fost utilizate pentru cuantificarea dimensiunii insulelor. Insulele au fost vizualizate la mărire de 10 ×; aria insulei a fost măsurată cu imaginea J și este exprimată ca aria relativă a insulei/aria totală a secțiunii pancreasului, așa cum este descris în referința 47. Secțiunile au fost analizate cu un microscop Olympus IX81.

TEM și SEM. Pentru transmiterea microscopiei electronice (TEM), țesutul adipos proaspăt a fost tăiat în 1-μm 2 bucăți și fixat peste noapte în paraformaldehidă 2%, glutaraldehidă 2,5% în tampon de cacodilat de sodiu 0,1 M. Au fost postfixate cu 1% tetroxid de osmiu urmat de 1% acetat de uranil, deshidratate printr-o serie gradată de etanol și încorporate în rășină LX112 (LADD Research Industries, Burlington, VT). Secțiunile ultra-subțiri (80 nm) au fost tăiate pe un Reichert Ultracut UCT, colorate cu acetat de uranil urmat de citrat de plumb și vizualizate pe un microscop electronic cu transmisie JEOL 1200EX la 80 kV. Pentru microscopia electronică cu scanare (SEM), țesutul adipos proaspăt a fost tăiat în blocuri mici și analizat așa cum este descris în referința 7. Pe scurt, țesutul a fost fixat peste noapte în fixator Karnovsky 1: 1, urmat de metoda OTOTO. Probele au fost deshidratate într-o serie gradată de etanol și infiltrate cu hexametildisilazan. Probele au fost montate pe butuci de aluminiu și examinate într-un microscop electronic cu scanare JEOL JSM6400 (Peabody, MA) folosind o tensiune de accelerare de 10 kV. Colorarea falsă a fost adăugată imaginilor folosind Adobe Photoshop.

Conținut de colagen. Conținutul de colagen tisular a fost determinat prin colorarea secțiunilor de parafină fixate în formalină din țesutul adipos epididimal în roșu picro-sirius (Sigma-Aldrich). Măsurarea hidroxiprolinei s-a făcut utilizând un protocol modificat al celui descris în altă parte (55). Pe scurt, 100 mg de grăsime congelată au fost încălzite în HCI 6 N la 110 ° C peste noapte în tuburi sigilate. Probele au fost apoi încălzite la 110 ° C timp de 48 de ore până la uscare. Fiecare probă a fost incubată cu cloramină-T (Sigma-Aldrich) la temperatura camerei timp de exact 20 min și apoi cu p-dimetilaminobenzaldehidă (Fisher Scientific) la 60 ° C timp de 15 min. Absorbanța a fost citită la 540 nm și concentrația a fost determinată de curba standard creată de cis-4-hidroxi-l -prolină (Sigma-Aldrich).

Măsurători ale trigliceridelor hepatice. Trigliceridele au fost extrase din țesuturi hepatice înghețate (200 mg) așa cum este descris de Carr și colab. (6a). Trigliceridele au fost măsurate printr-un test colorimetric folosind trigliceride Infinity (Thermo Scientific).

Compoziția corpului și măsurători de calorimetrie indirectă. Compoziția corpului a fost măsurată prin imagistică prin rezonanță magnetică (RMN) utilizând un aparat RMN Echo (Echo Medical Systems, Houston, TX). Pentru măsurători de calorimetrie indirectă, animalele au fost adăpostite individual în camere metabolice menținute la 20 până la 22 ° C pe un ciclu de lumină-întuneric de 12 ore/12 ore cu luminile aprinse la 0700. Măsurători metabolice (consum de oxigen, raport de schimb respirator și locomotor) activitate) au fost obținute continuu utilizând un sistem de calorimetrie indirectă cu circuit deschis CLAMS (Columbus Instruments, Columbus, OH). Șoarecilor li s-a oferit dieta standard de chow menționată mai sus și apă de la robinet ad libitum. Rezultatele prezentate conțin date colectate pentru o perioadă de 8 zile după 3 zile de adaptare la cuștile metabolice. Pentru măsurători ale consumului de alimente, șoarecii au fost adăpostiți individual și alimentele au fost cântărite în fiecare zi la prânz timp de 7 zile. Aportul alimentar este exprimat ca grame de alimente ingerate/gram de greutate corporală.

Profilarea expresiei genice a grăsimii epididimale de la șoarecii ob/ob și db/db a demonstrat niveluri semnificativ crescute de col6a3 în timpul stărilor de stres metabolic, cu reglare ascendentă de 1,3 ori respectiv 1,4 ori. În contrast, tratamentul cu agonist PPARγ al șoarecilor de tip sălbatic a redus semnificativ nivelurile de col6a3 de 1,6 până la 1,9 ori (Fig. 1D, panoul superior vedeți și Tabelul S1 în materialul suplimentar). Examinarea mai multor tampoane individuale de grăsime prin qRT-PCR a relevat că un tratament cu agonist PPARγ de 14 zile a redus nivelurile tuturor celor trei lanțuri alfa de colagen VI cu 1,4 până la 1,5 ori în grăsimea epididimală (Fig. 1D, panoul central) și De la 1,6 la 2,1 ori în grăsime mezenterică (Fig. 1D, panoul inferior).

Pentru a stabili dacă acest fenomen al nivelurilor crescute de colagen VI în perioadele de provocare metabolică este limitat la rozătoare sau dacă este relevant și în contextul bolilor umane, am examinat nivelurile de col6a3 într-o populație de subiecți indieni din Asia și le-am comparat cu o grup de control asortat de caucazieni. În ciuda indicilor de masă corporală similari, populația indiană asiatică are un nivel mai mare de susceptibilitate la rezistența la insulină decât populația caucaziană (10). Acest lucru se datorează parțial țesutului adipos disfuncțional care tinde să fie mai inflamat, chiar și după ajustarea țesutului adipos subcutanat între indienii asiatici și caucazieni (9). Prin urmare, aceasta a reprezentat o oportunitate unică de a disocia obezitatea de disfuncția metabolică. În concordanță cu observațiile din modelele preclinice cu provocări metabolice, expresia col6a3 a fost semnificativ crescută atât în ​​depozitele adipoase subcutanate abdominale, cât și în cele gluteale din această cohortă indiană asiatică (Fig. 1E). Acest lucru sugerează că reglarea în sus a colagenului VI este, de asemenea, un semn distinctiv al țesutului adipos uman neregulat.

Constrângerile reduse sunt, de asemenea, evidente atunci când privim alți markeri de stres. Un astfel de marker este Xbp1, care este un indicator de măsurare a stresului în reticulul endoplasmatic. Se găsește în forma sa constitutivă în condiții normale, în timp ce în timpul stresului, este alternativ îmbinat și migrează către nucleu. șoarecii col6KOob/ob prezintă o reducere extrem de semnificativă a formei Xbp1s îmbinată comparativ cu colegii ob/ob potrivite în funcție de vârstă, reflectând un nivel redus de stres celular (Fig. 6H).

Studii în cușcă metabolică la șoareci col6KOob/ob și colegii lor de ob/ob. (A) A fost măsurat aportul de alimente și este exprimat ca aport de alimente/gram de greutate corporală (înseamnă ± erori standard; n = patru șoareci/grup). (B până la D) Locomoția totală (ambulatorie și de creștere) (B), consumul de oxigen (VO2) (C) și RER (D) au fost măsurate pe parcursul zilei (înseamnă ± erori standard; n = patru șoareci/grup ). Toți șoarecii utilizați în acest experiment aveau vârsta de 12 săptămâni. *, P Primit la 15 august 2008.

  • Returnat pentru modificare 29 octombrie 2008.
  • Acceptat la 22 decembrie 2008.
  • Manuscris acceptat postat online 29 decembrie 2008.

    • fibroză