Analiza Western blot a extractelor din celule THP-1, netratate sau tratate cu LPS (1 µg/ml, 24 ore), utilizând USP18 (D4E7) Rabbit mAb.

Imunoprecipitarea USP18 din extracte de THP-1 tratate cu TPA (12-O-Tetradecanoilforbol-13-Acetat) # 4174 (80nM peste noapte) și Lipopolizaharide (LPS) # 14011 (1μg/mL peste noapte). Banda 1 este 10% intrare, banda 2 este USP18 (D4E7) Rabbit mAb, iar banda 3 este Rabbit (DA1E) mAb IgG XP ® Isotype Control # 3900. Analiza Western blot a fost realizată utilizând USP18 (D4E7) Rabbit mAb. IgG anti-iepure, anticorpul legat de HRP # 7074 a fost utilizat ca anticorp secundar.

USP18 (D4E7) Rabbit mAb 4813

USP18 D4E7 Rabbit

Analiza Western blot a extractelor din celule THP-1, netratate sau tratate cu LPS (1 µg/ml, 24 ore), utilizând USP18 (D4E7) Rabbit mAb.

Imunoprecipitarea USP18 din extracte de THP-1 tratate cu TPA (12-O-Tetradecanoilforbol-13-Acetat) # 4174 (80nM peste noapte) și Lipopolizaharide (LPS) # 14011 (1μg/mL peste noapte). Banda 1 este 10% intrare, banda 2 este USP18 (D4E7) Rabbit mAb, iar banda 3 este Rabbit (DA1E) mAb IgG XP ® Isotype Control # 3900. Analiza Western blot a fost efectuată utilizând USP18 (D4E7) Rabbit mAb. IgG anti-iepure, anticorpul legat de HRP # 7074 a fost utilizat ca anticorp secundar.

  • Reprezentantul local
  • Informațiile dvs. locale de cumpărare
  • Garantează anticorpii
  • FAQ
  • Suport tehnic
  • Date suport
  • produse asemanatoare
  • Utilizarea produsului
  • Protocoale
  • fundal
  • Căi și proteine
  • Referințe și recenzii

Date suport

REACTIVITATE H
SENSIBILITATE Endogen
MW (kDa) 34, 39
Sursă/izotip Iepure IgG

Cheie de aplicare:

  • W-Occidental
  • IP-Imunoprecipitare
  • IHC-Imunohistochimie
  • CIP-Imunoprecipitarea cromatinei
  • DACĂ-Imunofluorescența
  • F-Citometrie în flux
  • E-P-ELISA-peptidă

Cheia de reactivitate încrucișată a speciilor:

  • H-Uman
  • M-Șoarece
  • R-Război
  • Hm-Hamster
  • Mk-Maimuţă
  • Noi-Nurcă
  • C-Pui
  • Dm-D. melanogaster
  • X-Xenopus
  • Z-Zebrafish
  • B-Bovin
  • Dg-Câine
  • Pag-Porc
  • Sc-S. cerevisiae
  • Ce-C. elegans
  • HR-Cal
  • Toate-Toate speciile așteptate
ISG15 Anticorp # 2743
Phospho-Stat1 (Tyr701) (58D6) Rabbit mAb # 9167
ISG15 (22D2) Rabbit mAb # 2758
Stat1 (9H2) Mouse mAb # 9176
Stat1 Anticorp # 9172
Stat2 (D9J7L) Rabbit mAb # 72604
Kitul ELISA FastScan ™ Phospho-Stat1 (Tyr701) # 40716
Phospho-Stat2 (Tyr690) (D3P2P) Rabbit mAb # 88410
Rig-I (D14G6) Rabbit mAb # 3743
Stat1 (D1K9Y) Rabbit mAb # 14994

Informații despre utilizarea produsului

Diluarea aplicației
Western Blotting 1: 1000
Imunoprecipitare 1:50

Depozitare

Livrat în 10 mM sodiu HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCI, 100 μg/ml BSA, 50% glicerol și mai puțin de 0,02% azidă de sodiu. A se păstra la –20 ° C. Nu alicotați anticorpul.

Protocol

Protocolul Western Blotting

Pentru Western blots, incubați membrana cu anticorp primar diluat în 5% greutate/volum BSA, 1X TBS, 0,1% Tween ® 20 la 4 ° C cu agitare ușoară, peste noapte.

NOTĂ: Vă rugăm să consultați pagina web a produsului anticorp primar pentru diluarea recomandată a anticorpilor.

A. Soluții și reactivi

De la pregătirea eșantionului până la detectare, reactivii de care aveți nevoie pentru Western Blot sunt acum într-un singur kit convenabil: # 12957 Western Blotting Application Solutions Kit

NOTĂ: Pregătiți soluții cu osmoză inversă deionizată (RODI) sau apă de calitate echivalentă.

B. Blotarea proteinelor

Un protocol general pentru prepararea probei.

  1. Tratați celulele prin adăugarea de medii noi care conțin regulator pentru timpul dorit.
  2. Aspirați mass-media din culturi; spălați celulele cu 1X PBS; aspirat.
  3. Lizați celulele adăugând 1X tampon de probă SDS (100 perl per godeu de placă cu 6 godeuri sau 500 (l pentru o placă de 10 cm diametru). Îndepărtați imediat celulele de pe placă și transferați extractul într-un tub de microcentrifugă. Păstrați pe gheață.
  4. Sonicați timp de 10-15 secunde pentru a finaliza liza celulară și tăiați ADN-ul (pentru a reduce vâscozitatea probei).
  5. Se încălzește un eșantion de 20 de probe la 95-100 ° C timp de 5 minute; rece pe gheață.
  6. Microcentrifuga timp de 5 min.

Încărcați 20 de ontol pe gelul SDS-PAGE (10 cm x 10 cm).

NOTĂ: Se recomandă încărcarea markerilor de greutate moleculară preconizați (# 13953, 5 µl/bandă) pentru a verifica electrotransferul și scara de proteine ​​biotinilate (# 7727, 10 µl/bandă) pentru a determina greutățile moleculare.

  • Electrotransfer la membrana de nitroceluloză (# 12369).

    • C. Blocarea membranei și incubațiile de anticorpi

    NOTĂ: Volumele sunt pentru membrană de 10 cm x 10 cm (100 cm 2); pentru membrane de dimensiuni diferite, reglați volumele în mod corespunzător.

    I. Blocarea membranei

    1. (Opțional) După transfer, spălați membrana de nitroceluloză cu 25 ml TBS timp de 5 minute la temperatura camerei.
    2. Se incubează membrana în 25 ml de tampon de blocare timp de 1 oră la temperatura camerei.
    3. Se spală de trei ori timp de 5 min fiecare cu 15 ml TBST.

    II. Incubația primară a anticorpilor

    1. Incubați membrana și anticorpul primar (la diluarea și diluantul adecvat, așa cum se recomandă în pagina web a produsului) în 10 ml tampon de diluare a anticorpului primar cu agitare ușoară peste noapte la 4 ° C.
    2. Se spală de trei ori timp de 5 min fiecare cu 15 ml TBST.
    3. Incubați membrana cu IgG anti-iepure, anticorp legat de HRP (# 7074 la 1: 2000) și anti-biotină, anticorp legat de HRP (# 7075 la 1: 1000–1: 3000) pentru a detecta markeri de proteine ​​biotinilate în 10 ml de tampon de blocare cu agitare ușoară timp de 1 oră la temperatura camerei.
    4. Se spală de trei ori timp de 5 min fiecare cu 15 ml TBST.
    5. Continuați cu detectarea (secțiunea D).

    D. Detectarea proteinelor

    Instrucțiunile de utilizare:

    1. Se spală HRP legat de membrană (anticorp conjugat) de trei ori timp de 5 minute în TBST.
    2. Pregătiți 1X Reactiv ECL SignalFire ™ (# 6883) prin diluarea unei părți Reactiv 2X A și o parte Reactiv B 2X (de exemplu, pentru 10 ml, adăugați 5 ml Reactiv A și 5 ml Reactiv B). Amesteca bine.
    3. Se incubează substratul cu membrană timp de 1 minut, se îndepărtează soluția în exces (membrana rămâne umedă), se înfășoară în plastic și se expune la film cu raze X.

    * Evitați expunerea repetată la piele.

    postat în iunie 2005

    revizuit în iunie 2020

    Imunoprecipitare pentru proteine ​​native

    Acest protocol este destinat imunoprecipitării proteinelor native pentru analiză prin imunoblot occidental sau activitate kinazică utilizând separarea magnetică a proteinei A.

    A. Soluții și reactivi

    NOTĂ: Pregătiți soluții cu osmoză inversă deionizată (RODI) sau apă de calitate echivalentă.

      20X soluție salină tamponată cu fosfat (PBS): (# 9808) Pentru a prepara 1 L de 1X PBS, adăugați 50 ml 20X PBS la 950 ml dH2O, amestecați.

    10X tampon de liză celulară: (# 9803) Pentru a prepara 10 ml de tampon de liză celulară 1X, adăugați 1 ml tampon de liză celulară la 9 ml dH2O, amestecați.

    NOTĂ: Adăugați 1 mM PMSF (# 8553) imediat înainte de utilizare.

  • 3X SDS Sample Buffer: Pachet de încărcare albastru (# 7722) sau pachet de încărcare roșu (# 7723) Pregătiți un tampon de încărcare redus de 3X, adăugând 1/10 volum 30X DTT la 1 volum de tampon de încărcare SDS 3X.
  • Mărgele magnetice ale proteinei A: (# 73778).
  • Rack de separare magnetică: (# 7017) sau (# 14654).
  • 10X Kinase Buffer (pentru teste kinazice): (# 9802) Pentru a pregăti 1 ml de tampon kinază 1X, adăugați 100 10l 10X tampon kinază la 900 dl dH2O, amestecați.
  • ATP (10 mM) (pentru teste kinazice): (# 9804) Pentru a prepara 0,5 ml de ATP (200 µM), adăugați 10 µl ATP (10 mM) la 490 µl tampon kinază 1X.

    • B. Pregătirea lizatelor celulare

    1. Aspirați mass-media. Tratați celulele prin adăugarea de medii noi care conțin regulator pentru timpul dorit.
    2. Pentru recoltarea celulelor în condiții nedenaturante, îndepărtați mediul și clătiți celulele o dată cu PBS 1X rece ca gheața.
    3. Îndepărtați PBS și adăugați 0,5 ml tampon de liză celular 1X rece cu gheață pe fiecare placă (10 cm) și incubați pe gheață timp de 5 minute.
    4. Răsturnați celulele de pe placă și transferați-le în tuburile de microcentrifugă. Păstrați pe gheață.
    5. Sonicați pe gheață de trei ori timp de 5 secunde fiecare.
    6. Microcentrifugați timp de 10 minute la 4 ° C, 14.000 x g și transferați supernatantul într-un tub nou. Supernatantul este lizatul celular. Dacă este necesar, lizatul poate fi depozitat la -80 ° C.

    C. Imunoprecipitarea

    Pre-compensare a lizatului celular (opțional)

    O etapă de pre-curățare a lizatului celular este foarte recomandată pentru a reduce legarea nespecifică a proteinelor de granulele magnetice ale proteinei A. Pre-curățați suficient lizatul pentru probele de testare și controalele izotipului.

      Agitați scurt tubul de stoc pentru a resuspendă granulele magnetice.

    IMPORTANT: Pre-spălare margele magnetice # 73778 chiar înainte de utilizare:

    Transferați 20 μl de suspensie de margele într-un tub curat. Așezați tubul într-un raft de separare magnetic timp de 10-15 secunde.

    Scoateți cu atenție tamponul odată ce soluția este limpede. Adăugați 500 μl de tampon de liză celulară 1X la peleta de margele magnetice, rotiți scurt timp pentru a spăla margele. Așezați tubul înapoi în suportul de separare magnetică. Eliminați tamponul odată ce soluția este limpede. Repetați încă o dată pasul de spălare.

    Adăugați 200 μl de lizat celular la 20 μl de margele magnetice pre-spălate.

    IMPORTANT: Concentrația optimă de lizat va depinde de nivelul de exprimare al proteinei de interes. Se recomandă o concentrație inițială între 250 μg/ml-1,0 mg/ml.

  • Se incubează cu rotație timp de 20 de minute la temperatura camerei.
  • Separați mărgelele de lizat folosind un raft de separare magnetic, transferați lizatul pre-curățat într-un tub curat și aruncați peleta de margele magnetice.
  • Continuați cu secțiunea de imunoprecipitare.

    • Imunoprecipitare

    IMPORTANT: Se recomandă un control adecvat al izotipului pentru a arăta legarea specifică în imunoprecipitarea primară a anticorpilor. Utilizați Normal Rabbit IgG # 2729 pentru anticorpi policlonali primari de iepure, Rabbit (DA1E) mAb IgG XP ® Isotype Control # 3900 pentru iepuri monoclonali primari anticorpi și Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control # 5415 pentru mouse anticorpi monoclonali primari. Controalele izotipului trebuie să fie potrivite cu concentrația și să se desfășoare alături de probele primare de anticorpi

    1. Adăugați anticorp primar (la diluarea adecvată, așa cum se recomandă în foaia tehnică a produsului) la 200 de celulat lizat de celule. Se incubează cu rotație peste noapte la 4 ° C. pentru a forma imunocomplexul.
    2. Pre-spălați margele magnetice (consultați secțiunea Pre-curățare a lizatului celular, pașii 1 și 2).
    3. Transferați soluția de lizat și anticorp (imunocomplex) în tubul care conține peleta magnetică de mărgele pre-spălată.
    4. Se incubează cu rotație timp de 20 de minute la temperatura camerei.
    5. Margele de pelete folosind suport de separare magnetic. Se spală peletele de cinci ori cu 500 μl de tampon de liză celulară 1X. Păstrați pe gheață între spălări.
    6. Procedați la analiză prin imunoblotarea occidentală sau activitatea kinazei (secțiunea D).

    D. Analiza eșantionului

    Continuați cu unul dintre următorii pași specifici.

    Pentru analiza prin imunoblotarea occidentală

    1. Resuspendați peleta cu 20-40 3l 3X SDS tampon de probă, scurtați vortexul pentru a amesteca și microcentrifugați scurt pentru a peleta proba.
    2. Se încălzește proba la 95-100 ° C timp de 5 min.
    3. Margele de pelete folosind suport de separare magnetic. Transferați supernatantul într-un tub nou. Supernatantul este proba.
    4. Analizați eșantionul prin western blot (a se vedea Protocolul Western Immunoblotting).

    NOTĂ: Pentru a minimiza mascarea cauzată de lanțurile grele IgG denaturate (

    50 kDa), vă recomandăm să utilizați mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (# 45262) ​​sau Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (# 3678) (sau HRP conjugat # 5127). Pentru a minimiza mascarea cauzată de lanțurile ușoare IgG denaturate (

    25 kDa), vă recomandăm să utilizați mouse anti-iepure IgG (Conformitate specifică) (L27A9) mAb (# 3678) (sau conjugat HRP # 5127).

    Pentru analiza prin testul Kinase

    1. Se spală peleta de două ori cu 500 1 1 1x tampon kinază. Păstrați pe gheață.
    2. Se suspendă peleta în 40 1 1 1x tampon kinază suplimentat cu 200 µM ATP și substrat adecvat.
    3. Se incubează 30 de minute la 30 ° C.
    4. Terminați reacția cu 20 3L 3X tampon de probă SDS. Vortex, apoi microcentrifugă timp de 30 sec.
    5. Se transferă supernatantul care conține substrat fosforilat într-un alt tub.
    6. Se încălzește proba la 95-100 ° C timp de 2-5 min și microcentrifugă timp de 1 min la 14.000 x g.
    7. Încărcați proba (15-30 µl) pe gel SDS-PAGE.

    postat în decembrie 2008

    revizuit în aprilie 2018

    ID protocol: 410

    Specificitate/Sensibilitate

    USP18 (D4E7) mAb de iepure detectează niveluri endogene de proteină totală USP18. Banda de dublet detectată prin western blot reprezintă lungimea completă (39 kDa) și derivatul șters amino-terminal al USP18 (8).

    Reactivitatea speciilor:

    Sursă/purificare

    Anticorpul monoclonal este produs prin imunizarea animalelor cu o peptidă sintetică corespunzătoare reziduurilor care înconjoară Pro45 de proteină USP18 umană.

    fundal

    Enzimele ubiquitinante (UBE) catalizează ubiquitinarea proteinelor, un proces reversibil contracarat prin acțiunea enzimei deubiquitinatoare (DUB). Sunt recunoscute cinci subfamilii DUB, inclusiv enzimele USP, UCH, OTU, MJD și JAMM (1,2). USP18 (cunoscut și sub denumirea de UBP43) este o deubiquitinază cunoscută cel mai bine pentru catalizarea îndepărtării ISG15, o proteină asemănătoare ubibiquitinei reglată de interferon, din proteinele conjugate (3). Îndepărtarea ISG15 din proteinele țintă de către peptidaza USP18 menține echilibrul celular critic al proteinelor conjugate cu ISG15 importante pentru dezvoltarea normală și funcția creierului (4,5). După inducerea prin IFN sau LPS (6), USP18 leagă subunitatea receptorului INF IFNAR2 și inhibă transducția semnalului prin calea JAK-STAT (7). Reglarea USP18 a semnalizării IFN inhibă apoptoza mediată de IFN și nu se bazează neapărat pe activitatea peptidazei USP18 (8). Deoarece utilizarea terapeutică a IFN recombinant poate duce la semnalizarea IFN refractară și la un răspuns mai puțin eficient, combinația tratamentului cu IFN și reglarea expresiei USP18 poate produce un rezultat mai pozitiv (9).

    Căi și proteine

    Explorează căi + proteine ​​legate de acest produs.