Servicii veterinare și medicină animală de laborator, Universitatea Philipps Marburg, Germania

Departamentul de otorinolaringologie, chirurgia capului și gâtului, Spitalul Universitar Giessen și Marburg, Campus Marburg, Marburg, Germania

Departamentul de otorinolaringologie, chirurgia capului și gâtului, Spitalul Universitar Giessen și Marburg, Campus Marburg, Marburg, Germania

Departamentul de Radiologie Diagnostică, Spitalul Universitar Giessen și Marburg, Campus Marburg, Marburg, Germania

Departamentul de Hematologie, Oncologie și Imunologie, Spitalul Universitar Giessen și Marburg, Campus Marburg, Marburg, Germania

Departamentul de otorinolaringologie, chirurgia capului și gâtului, Spitalul Universitar Giessen și Marburg, Campus Marburg, Marburg, Germania

Departamentul de otorinolaringologie, chirurgia capului și gâtului, Spitalul Universitar Giessen și Marburg, Campus Marburg, Marburg, Germania

Departamentul de Neuroștiințe Moleculare, Institutul de Anatomie și Biologie Celulară, Universitatea Philipps Marburg, Germania

Departamentul de Neuroștiințe Moleculare, Institutul de Anatomie și Biologie Celulară, Universitatea Philipps Marburg, Germania

Department of Molecular Neuroscience, Institute of Anatomy and Cell Biology, Philipps University, Robert - Koch Street 8, 35032 Marburg, Germany Căutați mai multe lucrări ale acestui autor

Servicii veterinare și medicină animală de laborator, Universitatea Philipps Marburg, Germania

Departamentul de otorinolaringologie, chirurgia capului și gâtului, Spitalul Universitar Giessen și Marburg, Campus Marburg, Marburg, Germania

Departamentul de otorinolaringologie, chirurgia capului și gâtului, Spitalul Universitar Giessen și Marburg, Campus Marburg, Marburg, Germania

Departamentul de Radiologie Diagnostică, Spitalul Universitar Giessen și Marburg, Campus Marburg, Marburg, Germania

Departamentul de Hematologie, Oncologie și Imunologie, Spitalul Universitar Giessen și Marburg, Campus Marburg, Marburg, Germania

Departamentul de otorinolaringologie, chirurgia capului și gâtului, Spitalul Universitar Giessen și Marburg, Campus Marburg, Marburg, Germania

Departamentul de otorinolaringologie, chirurgia capului și gâtului, Spitalul Universitar Giessen și Marburg, Campus Marburg, Marburg, Germania

Departamentul de Neuroștiințe Moleculare, Institutul de Anatomie și Biologie Celulară, Universitatea Philipps Marburg, Germania

Departamentul de Neuroștiințe Moleculare, Institutul de Anatomie și Biologie Celulară, Universitatea Philipps Marburg, Germania

Department of Molecular Neuroscience, Institute of Anatomy and Cell Biology, Philipps University, Robert - Koch Street 8, 35032 Marburg, Germany Căutați mai multe lucrări ale acestui autor

Abstract

Carcinoamele cu celule scuamoase ale regiunii capului și gâtului (HNSCC) se metastazează frecvent și prezintă o rată ridicată a mortalității la om și animale. Fiind un model animal acceptat pentru studierea progresiei și răspândirii metastatice a HNSCC, modelul de carcinom auricular VX2 extrem de agresiv și letal al iepurelui White New Zealand (NZW) 1, 2 a fost aplicat în studiul nostru. Acest model tumoral s-a dovedit a fi extrem de potrivit pentru a investiga noi abordări terapeutice, deoarece atât carcinomul HNSCC, cât și carcinomul VX2 sunt similare în creștere, conducând la un ganglion limfatic regional precoce și la o răspândire ulterioară metastatică la distanță. 3-5

Așa cum este adevărat pentru multe tipuri de cancer, celulele tumorale HNSCC evită cumva sistemul imunitar al organismului. Această scăpare imunitară poate fi explicată parțial prin reglarea descendentă sau pierderea frecventă a factorilor determinanți MHC de clasa I 6, 7 și o creștere a celulelor T reglatoare CD4 + CD25 + (Treg) care se găsesc responsabile pentru imunitatea antitumorală deprimată. 8-10 Prin urmare, posibilitatea de a activa imunosupravegherea către celulele tumorale HNSCC ar trebui să ajute la recunoașterea și eradicarea acestei entități tumorale. Îmbunătățirea capacității de imunosupraveghere este un concept emergent în imunoterapiile recente împotriva cancerului, 11-13 în special în cele care se concentrează pe imunomodulatori sau reglatori ascendenți ai răspunsului imun. 14 Pentru a spori răspunsul imun al gazdei împotriva celulelor canceroase, terapiile cu citokine recombinante, imunizarea cu celule dendritice și vaccinarea antigenelor tumorale, precum și imunoterapiile pe bază de celule T sunt în curs de investigare. 15-17

Ozonul, descoperit recent ca fiind produs endogen de granulocite, 18 este un gaz cu influență complexă asupra biologiei radicalilor liberi la om și animale. 19 Majoritatea cercetărilor asupra efectelor biologice ale ozonului s-au concentrat pe toxicitatea pulmonară a acestuia datorită inhalării ozonului ambiental. 20, 21 Prin urmare, aplicarea căilor respiratorii este limitată in vivo studii privind ozonul medical în bolile umane. Interesant este faptul că ozonul a prezentat efecte protectoare puternice asupra sepsisului letal indus de polimicrobieni fără nici o toxicitate pulmonară detectabilă atunci când este aplicat ca amestec de gaze O3/O2 în peritoneu. 22 În plus, dovezile privind formarea de ozon catalizat de anticorpi în uciderea bacteriană 23 sugerează efectele mediată de imunitate ale ozonului produs endogen sau aplicat exogen. Din timp in vitro studiile au descris ozonul ca un gaz radiomimetic, 24 capabil să inhibe în mod selectiv creșterea carcinoamelor alveolare umane, uterine, mamare și endometriale izolate. 25

Acest lucru ne-a determinat să facem ipoteza că aplicarea intraperitoneală a unui amestec medical de gaze O3/O2 stimulează imunosupravegherea antitumorală a organismului.

Material si metode

Animale

Studiul cuprinde 59 de iepuri adulți sănătoși Iffa Credo NZW într-o greutate corporală cuprinsă între 2,0 și 3,0 kg, achiziționate de la Charles River WIGA, Sulzfeld, Germania. Toate animalele au fost ținute în camere cu aer condiționat standardizat: la 20-22 ° C, 50-60% umiditate și un ritm artificial de 12 ore zi/noapte. Fiecare iepure a fost ținut într-o cușcă de oțel individuală, a fost hrănit cu 100 g de pelete dietetice complete pe zi și a avut acces gratuit la apă acidată (acid clorhidrat, pH 2,7) ad libitum. Animalele s-au putut aclima timp de cel puțin 5 zile înainte de începerea procedurii experimentale.

Proiectare experimentală și transplant de tumori

pneumoperitoneu

Este prezentat designul experimental al acestui studiu pentru (A) schema de tratament și (b) rata de reluare după suprimarea imună a iepurilor. * Punctele de timp ale retragerii sângelui

Suprimarea imunitară

Tomografie computerizata

Iepurii au fost premedicați cu 0,1 ml/kg greutate corporală glicopirolat subcutanat și anesteziați cu o combinație de 5 mg/kg xilazină și 30 mg/kg ketamină prin injecție intramusculară. Tomografia computerizată a toracelui a fost generată cu Siemens Somatom Plus 4 (Siemens, Erlangen, Germania).

Parametrii sângelui

Probele de sânge arterial din artera auriculară centrală a urechii libere a tumorii stângi au fost prelevate în ziua 14 post inoculare (direct înainte de prima insuflație de gaze/tratament fals) și în ziua 19 după inoculare (24 de ore după ultima insuflație de gaze/tratament simul) . Au fost prelevate probe de sânge suplimentare în ziua 90 de la animalele O3/O2 - rem (Fig. 1A). Pentru investigații hematologice am folosit un autoanalizator (Vet abc ™ Animal Blood Counter, ABX Diagnostics, Goettingen, Germania), care a fost atent ajustat și validat pentru analiza sângelui de iepure. Pentru numărul de sânge diferențiat, numărul RBC a fost determinat împreună cu hematocritul (HCT) și hemoglobina (HGB). Celulele albe din sânge au fost diferențiate în continuare în granulocite, limfocite și monocite. Datele au fost exprimate ca valori medii ± SEM. Pentru investigațiile de chimie clinică, valorile creatininei, GOT și GPT au fost măsurate cu sistemul Reflovet® Plus (Roche Diagnostics, Mannheim, Germania) pentru a monitoriza funcțiile renale și hepatice.

Statistici

Pentru compararea ratelor de supraviețuire a celor 3 grupuri experimentale, s-a efectuat testul log rank p

Rezultate

Ploturi Kaplan - Meier care arată probabilitatea de supraviețuire (A) și timpul până la probabilitatea de eliminare a tumorii [TTC, (b)] de iepuri (n = 41) care au dezvoltat o tumoare VX2 auriculară solidă în ziua 14 după inocularea tumorii VX2. (A) Probabilitatea de supraviețuire a iepurilor care au primit tratament O3/O2 a fost superioară iepurilor tratați fals (p = 0,0006), dar nu a fost semnificativ diferit de cel al grupului tratat cu O2 (p = 0,0559) calculat prin testul de rang log. Probabilitatea de supraviețuire a iepurilor tratați cu O2 nu a diferit semnificativ de cea a iepurilor tratați fals (p = 0,2448). (b) Probabilitatea TTC a variat semnificativ între iepurii tratați cu O3/O2 și cei tratați cu fals (p = 0,0243) dar nu între iepuri tratați cu O3/O2‐ și O2 (p = 0,0665). De asemenea, nu a existat nicio diferență semnificativă în probabilitatea TTC între grupurile O2 și grupuri simulate (p = 0,5781). Modificările semnificative statistic au fost marcate cu p

Figura 3 prezintă o secvență reprezentativă a diferitelor etape tumorale care demonstrează regresia tumorii primare a tumorii auriculare după tratamentul cu O3/O2 până la remisia completă (Fig. 3A) sau progresia tumorii către stadiul final, care se caracterizează prin ulcerații puternice și sângerări masive cu puțin timp înainte de moarte (Fig. 3b).

Creșterea și dezvoltarea celulelor tumorale VX2 în urechea dreaptă a iepurilor NZW după inoculare. Panou (A) prezintă vederi macroscopice reprezentative ale unei tumori VX2 auriculare solide în urechea dreaptă a unui iepure în ziua 14 după inocularea celulelor tumorale și diferite etape de remisie după terapia O3/O2 (O3/O2 - pneumoperitoneu). Remisiunea spontană a tumorii observată la un iepure tratat fals și cele 2 remisii după insuflarea gazului cu O2 au fost similare (punctele de vedere macroscopice nu sunt prezentate). Rețineți că doar o mică cicatrice a tumorii auriculare remise a rămas în Ziua 90, punctul final al perioadei noastre de observare. În contrast puternic, la iepurii care au cedat la progresia tumorii, tumora auriculară a continuat să crească, rezultând ulcerații severe asociate cu sângerări masive și debutul infecțiilor locale introducând stadiul final al acestei boli tumorale (b, sunt prezentate etapele reprezentative ale aceluiași iepure). Sunt descrise etapele tumorale în zilele 14, 27, 35 și la sfârșitul perioadei de observare (90 de zile sau 42 de zile în caz de deces).

Pentru a analiza dacă tratamentul are ca rezultat o regresie și/sau prevenire a metastazelor pulmonare la distanță în torace, care este tipică pentru boala tumorală avansată VX2 la iepuri, 4, 29 am scanat toracele complet al animalelor cu regresia tumorii primare pentru prezența metastazelor utilizând tomografie computerizată (CT). În toate cele 3 grupuri experimentale, metastazele pulmonare au fost absente la iepuri cu remisie a tumorii auriculare primare (Fig. 4A). Contrar iepurilor cu remisie tumorală, toate animalele cu tumori auriculare persistente în ziua 90 au prezentat în mod regulat numeroase metastaze pulmonare (Fig. 4b).

Tumora VX2 a derivat metastaze pulmonare îndepărtate. Scanarea CT a toracelui care nu prezintă metastaze pulmonare detectabile la un iepure din grupul O3/O2 - rem (A) la sfârșitul perioadei de observare, dar dezvăluie o imensă metastază în plămânul unui iepure în ziua 32 (b, asterisc) care a cedat ulterior tumorii VX2. (sunt reprezentate scanări CT reprezentative ale plămânilor care se ridică la vena pulmonalis) Imaginile inferioare prezintă vederi macroscopice ale plămânilor complet ai unui iepure sănătos (c) și a unui animal cu metastaze pulmonare derivate din carcinomul multiplu VX2 la pleura viscerală (d).

Observația că celulele tumorale VX2 reimplantate au fost respinse la iepuri cu remisie tumorală după tratamentul perilezional cu IL-2 30 ne-a determinat să testăm dacă reimplantarea celulelor carcinomului VX2 va eșua și la iepurii cu remisie tumorală după tratamentul cu O3/O2. Pentru a testa acest lucru, am împărțit cele 6 animale O3/O2 - rem din experimentul prezent în 2 grupuri. Fiecare animal a primit o injecție bi - auriculară a suspensiei de celule tumorale VX2 pentru a crește numărul de tumori posibile. Un grup a fost imun suprimat de Dex și CSA (n = 3), celălalt grup a fost tratat fals, așa cum s-a descris anterior (n = 3). Așa cum era de așteptat, toate animalele tratate fals au fost protejate pentru recucerirea tumorilor VX2, deoarece nu s-au dezvoltat tumori auriculare în perioada de observație de 90 de zile (Tabelul I). În contrast puternic, animalele suprimate cu imunitate au dezvoltat tumori în 4 din 6 reinoculări ale celulelor tumorale (Tabelul I). Creșterea și dimensiunea tumorilor la aceste animale nu au arătat nicio diferență față de tumorile auriculare măsurate anterior la iepurii imuni competenți din grupul fals.

  • Reimplantarea bi-auriculară a celulelor tumorale VX2 la iepuri cu regresie tumorală completă (O3/O2 - rem) și tratament ulterior cu (O3/O2 - rem + Dex/CSA) sau fără (O3/O2 - rem + sham) dexametazonă și ciclosporină A. Rata de preluare a tumorilor măsurate la 2 iepuri a servit drept control de bază: 1 iepure (control + Dex/CSA) a primit suspensia tumorii pentru prima dată și a fost în plus suprimat imun, în timp ce al doilea iepure (control + fals) a fost nu imunitar suprimat.
  • 1 Datorită transplantului bi-auricular de suspensie de celule VX2, sunt posibile 2 tumori per animal.
  • 2 Valoarea medie mai mică de 200 mm 3 reprezintă umflarea bazală care apare după implantarea suspensiei de celule tumorale VX2. Prin urmare, volumele care măsoară mai puțin de 200 mm 3 sunt considerate VX2 tumorale negative.

Pentru a testa dacă terapia cu O3/O2 are efecte adverse, am măsurat presiunea intraabdominală (IAP) în timpul procesului de insuflare și am analizat dezvoltarea greutății și unii dintre parametrii principali ai sângelui care servesc frecvent ca indicatori ai efectelor adverse prin criteriile comune de toxicitate. 28 Măsurarea IAP la iepuri nu a arătat nicio presiune peste 5 mbar în niciun moment. Analiza greutății corporale a relevat o scădere maximă de aproximativ 8,1% (p

(A) Cursul greutății corporale medii din ziua 0 (la care a fost inoculată suspensia celulară VX2) până în ziua 42. În ziua 0 greutatea corporală inițială a fiecărui iepure a fost setată la 100%; modificările au fost exprimate în procente din greutatea corporală inițială. Perioada de insuflare terapeutică a amestecului de gaze O3/O2 este marcată de o cutie gri. Modificările greutății corporale în cadrul unui grup experimental au fost calculate pentru fiecare zi de către Student t Test. Pierderea semnificativă a greutății corporale a fost găsită în grupul tratat cu O3/O2 (*p # p Au fost prelevate 31 de probe de sânge arterial în ziua 14 postinoculare (direct înainte de prima insuflație cu O3/O2, insuflație cu O2 sau tratament fals) și în ziua 19 după inoculare (24 de ore după ultima insuflare cu gaz sau tratament fals). Pentru a lua în considerare posibilele efecte pe termen lung ale O3/O2-pneumoperitoneului, parametrii sanguini ai tuturor animalelor O3/O2-rem au fost măsurați și în Ziua 90 reprezentând sfârșitul perioadei de observare. Diferențele statistice între Ziua 14 și Ziua 19 în fiecare grup experimental au fost calculate cu Studentul asociat t test și modificările semnificative statistic au fost marcate cu p

Măsurarea parametrilor sângelui în ziua 19 (24 de ore după ultima insuflare cu gaz O3/O2 sau tratamentul fals) a prezentat o ușoară creștere a numărului de globule roșii (Fig. 5b). Alte valori, cum ar fi numărul RBC, HGB, HCT, GOT și GPT au rămas în intervalul fiziologic (Fig. 5b).

Discuţie

Dezvoltarea toleranței împotriva reimplantării tumorii VX2 indică o implicare a sistemului imunitar în eliminarea tumorii, în special a sistemului imunitar adaptativ. Această ipoteză este susținută și de observația că injecția perilezională a IL-2 a dus la regresia tumorilor auriculare VX2 la iepuri, deși la o eficiență mai mică (25,0%) 30 decât cea găsită în grupul O3/O2 - pneumoperitoneu (42,9%). Pierderea toleranței împotriva reimplantării tumorilor VX2 după suprimarea imunitară indică în continuare că imunosurvegherea este un jucător cheie în eradicarea celulelor tumorale VX2.

Deoarece O3/O2 - pneumoperitoneul este o nouă abordare terapeutică, este foarte important să analizăm posibilele efecte secundare adverse. Efectele secundare acute datorate IAP ridicate care ar putea apărea în timpul perioadei de insuflare sunt improbabile, deoarece presiunea maximă măsurată a fost sub 5 mbar, clasificată ca IAP scăzută în chirurgia laparoscopică. 43 Reducerea ușoară și tranzitorie a greutății corporale în timpul și la scurt timp după tratamentul terapeutic ar putea reprezenta un efect advers ușor (scădere în greutate 5-10%, gradul I) comparabil cu cel observat la șoareci (scădere în greutate de până la 14%, gradul II) care inhalase ozon. 44 Deoarece nu s-au observat efecte secundare severe, cum ar fi reducerea susținută a greutății corporale și embolie gazoasă, febră, diaree sau peritonită, se pare că terapia cu O3/O2 este relativ sigură. Efectele adverse tardive ale tratamentului cu O3/O2 - pneumoperitoneu sunt destul de improbabile, deoarece 2 iepuri dintr-un studiu pilot anterior nu au dezvoltat semne clinice după mai mult de 5 ani de remisie a tumorii (neprezentat).

Luată împreună, insuflarea amestecului de gaze medicale O3/O2 în cavitatea peritoneală pare a fi un instrument nou foarte promițător în tratamentul cancerului. Mecanismele exacte care stau la baza îmbunătățirii propuse a O3/O2 - pneumoperitoneului în imunosupraveghere sunt încă necunoscute. În mod clar, este nevoie de mai multă muncă pentru a clarifica mecanismele bazale biochimice, fiziologice și imunologice care stau la baza efectului antitumorigenic și antimetastatic al O3/O2 - pneumoperitoneul asupra tumorilor VX2. Cu siguranță, eficacitatea acestei noi abordări terapeutice - inclusiv posibilele efecte secundare necunoscute - trebuie să fie dovedită pe alte modele de animale tumorale cu diferite tipuri de tumori înainte de a intra în cele din urmă în studiile clinice la oameni.