Abstract

fundal

Diabetul zaharat de tip 1 (T1D) este o boală autoimună cronică cauzată de distrugerea selectivă a celulelor β pancreatice, urmată de hiperglicemie, stres oxidativ și afectarea extinsă ulterioară a funcțiilor celulelor imune, fenomen responsabil de dezvoltarea complicațiilor diabetice cronice. Propolisul, un produs apicol natural care este utilizat pe scară largă în alimente și băuturi, aduce beneficii semnificative sănătății umane. Mai exact, propolisul exercită efecte antioxidante, antiinflamatorii și analgezice care pot îmbunătăți complicațiile diabetice. Pentru a elucida în continuare beneficiile potențiale ale propolisului, studiul de față a investigat efectul suplimentării dietetice cu propolis asupra profilurilor citokinelor plasmatice, nivelurilor de radicali liberi, profilului lipidic și proliferării limfocitelor și chemotaxiei într-un model de șoarece diabetic indus de streptozotocină (STZ).

Metode

Treizeci de șoareci masculi au fost distribuiți în mod egal în 3 grupuri experimentale: grupul 1, șoareci martor non-diabetici; grupa 2, șoareci diabetici; și grupul 3, șoareci diabetici suplimentați zilnic cu un derivat solubil din etanol al propolisului (100 mg/kg greutate corporală) timp de 1 lună.

Rezultate

În primul rând, inducerea diabetului la șoareci a fost asociată cu hiperglicemie și scăderi semnificative ale nivelului de insulină și al numărului de limfocite. În acest context, șoarecii diabetici au prezentat complicații diabetice severe, după cum a demonstrat o scădere semnificativă a nivelurilor de IL-2, IL-4 și IL-7, creșterea prelungită a nivelurilor de citokine pro-inflamatorii (IL-1β, IL- 6 și TNF-α) și specii reactive de oxigen (ROS) și profiluri lipidice modificate comparativ cu controlul șoarecilor non-diabetici. Mai mult, stimularea antigenică a limfocitelor B și T a redus semnificativ capacitatea proliferativă și chimiotaxia acestor celule către CCL21 și CXCL12 la șoarecii diabetici, comparativ cu șoarecii martor. Interesant, comparativ cu inducerea diabetului în monoterapie, tratamentul șoarecilor diabetici cu propolis a restabilit semnificativ nivelul citokinei plasmatice și al nivelului ROS și profilul lipidic la niveluri aproape normale. Cel mai important, comparativ cu șoarecii diabetici netratați, șoarecii diabetici tratați cu propolis au prezentat o proliferare limfocitară semnificativ îmbunătățită și chimiotaxie către CCL21 și CXCL12.

Concluzie

Descoperirile noastre dezvăluie efectele imuno-modulatorii potențiale ale propolisului, care acționează ca un antioxidant natural pentru a spori funcția celulelor imune în timpul diabetului.

fundal

Diabetul zaharat de tip 1 (T1D) este o boală autoimună mediată de celule T cronice care are ca rezultat distrugerea celulelor β secretoare de insulină [1]. Diabetul este asociat cu tulburări metabolice multiple care se caracterizează prin hiperglicemie, care este însoțită de mai multe complicații [2] care rezultă dintr-un deficit absolut sau relativ în secreția sau acțiunea insulinei [3]. Dislipidemia este o caracteristică comună a diabetului, care se caracterizează prin niveluri crescute de trigliceride și lipoproteine ​​cu densitate scăzută (LDL) colesterol (LDL-C) [4]. Hiperglicemia sau dislipidemia induc cu ușurință un stres oxidativ extins care provoacă disfuncții celulare grave la pacienții diabetici [5, 6]. Hiperglicemia persistentă crește producția de radicali liberi, în special specii reactive de oxigen (ROS), în mai multe țesuturi [7]. Creșterea peroxidării lipidelor, caracterizată prin creșterea nivelurilor de malondialdehidă (MDA), are ca rezultat formarea de legături încrucișate între molecule unice din proteine ​​și oxidarea particulelor LDL; LDL oxidat servește drept cel mai comun marker al stresului oxidativ [8, 9].

Inflamația în bolile autoimune se caracterizează printr-un dezechilibru între citokinele pro și antiinflamatoare. Citokinele pro-inflamatorii influențează în mod dăunător sensibilitatea la insulină și funcția celulelor β [10]. Interesant este faptul că nivelurile modificate de citokine afectează secreția de insulină în celulele β [11], iar acumularea de dovezi susține că diabetul este o boală a sistemului imunitar înnăscut [11, 12]. Mai mult, diabetul crește producția de citokine pro-inflamatorii, inclusiv IL-1α, IL-1β, IL-6 și CXCL10 [13, 14]. Cu toate acestea, principalele citokine implicate în patogeneza diabetului sunt IL-1, TNF-α și IL-6 [15]. Producția afectată de IL-1, IL-6, TNF-α și IFN-γ și producția crescută de IL-10 în culturile de celule mononucleare diabetice de tip 1 din sânge periferic (PBMC) pot indica deficiențe în activarea celulelor mononucleare și adaptive imune celulare răspunsuri [16].

Complicațiile diabetice și afectarea răspunsului imun sunt provocări în tratamentul clinic al T1D; astfel, este necesară dezvoltarea unor strategii de tratament mai eficiente. Propolisul este un material natural rășinos produs de albine din exudatele colectate și mugurii plantelor amestecate cu ceară și enzime de albine [26]. Propolisul are mai multe proprietăți biologice și farmacologice, cum ar fi imuno-modulatori, antitumorale, antiinflamatorii, antioxidante, antibacteriene și antivirale [27-30]. Cu toate acestea, mecanismele prin care propolisul modulează sistemul imunitar în timpul diabetului rămân slab înțelese. Prin urmare, studiul actual a fost realizat pentru a investiga efectul direct al suplimentării cu propolis asupra funcției afectate a limfocitelor B și T în timpul T1D.

Materiale și metode

Pregătirea propolisului

Produse chimice

Streptozotocina (STZ) a fost obținută de la Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO, SUA). STZ s-a dizolvat în tampon citrat 0,01 M rece (pH 4,50), care a fost proaspăt preparat (în decurs de 5 minute) după cum este necesar.

Animale și inducerea diabetului

Colectie de mostre

Sângele întreg a fost colectat din aorta abdominală și transferat imediat în tuburile heparinizate. Sângele a fost apoi centrifugat la 4.000 × g timp de 10 min folosind o centrifugă de bancă (MSE Minor, Anglia) pentru a îndepărta celulele roșii din sânge și pentru a recupera plasma. Probele de plasmă au fost separate, colectate folosind pipete Pasteur uscate și depozitate la -80 ° C până la utilizare. După izolarea plasmatică, PBMC au fost izolate utilizând metoda gradientului Ficoll. PBMC proaspăt izolate au fost cultivate în mediu RPMI 1640 suplimentat cu 10% ser fetal de vițel (FCS) și HEPES (mediu R-10) timp de cel puțin 4 ore înainte de începerea experimentelor.

Analiza sângelui

Nivelurile de glucoză din sânge au fost determinate folosind un senzor AccuTrend (Roche Biochemicals; Mannheim, Germania). Luminex (Biotrend; Düsseldorf, Germania) a fost utilizat pentru a analiza nivelurile serice de insulină conform instrucțiunilor producătorului.

Măsurarea nivelurilor de radicali liberi

Nivelurile ROS au fost determinate în aspiratul măduvei osoase, lizatul țesutului splinei, lizatul sângelui și ficatului folosind diacetat de 2,7-diclorodihidrofluoresceină (H2DCF-DA) (Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, China). Oxidarea diclorofluoresceinei 2’-7 ’(H2DCF) la diclorofluoresceina 2’-7’ (DCF) a fost utilizată destul de mult pentru cuantificarea H2O2. Forma de diacetat, H2DCFDA și esterul său acetometilic H2DCFDA-AM sunt preluate de celule unde esterazele celulare nespecifice acționează asupra ei pentru a scinda grupurile lipofile, rezultând un compus încărcat care se crede că este prins în interiorul celulei. Oxidarea H2DCF de către ROS transformă molecula în diclorodihidrofluoresceină (DCF) 2 ’, 7’, care este foarte fluorescentă. Lungimile de undă raportate pentru măsurarea fluorescenței DCF sunt de 498 nm pentru excitație și 522 nm pentru emisie.

Analiza profilului lipidic

Profilurile lipidice au fost determinate folosind kituri BioMerieux printr-o metodă de testare standard. Nivelurile de colesterol au fost evaluate folosind metoda colesterol esterazei. Lipoproteinele de înaltă densitate HDL, LDL-C și chilomicroni au fost precipitate cu acid fosfotungstic. Cantitatea de colesterol legat de HDL a fost determinată folosind metoda colesterol oxidazei și metoda sării de magneziu fosfotungstat folosind un kit de testare a colesterolului E (Wako, Osaka, Japonia).

Determinarea nivelului de citokine plasmatice

Profilurile de citokine plasmatice au fost evaluate în triplicat folosind probe care au fost depozitate la -80 ° C. Nivelul plasmatic IFN-α a fost măsurat folosind un ELISA comercial (PBL, Piscataway, NJ) conform instrucțiunilor producătorului. Nivelurile plasmatice de IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10 și TNF-α au fost măsurate prin ELISA folosind kitul de testare a citokinelor Bio-Plex de șobolan -Rad, Hercules, CA) conform instrucțiunilor producătorului.

Citometrie în flux

Expresia antigenelor de suprafață celulară pe PBMC-uri izolate a fost determinată prin analiza de sortare a celulelor cu fluorescență activată cu un singur parametru (FACS) utilizând următorii anticorpi monoclonali (mAbs): (i) anti-CD45R/B220 și isotip conjugat PE-conjugat -mAb de control egal (toate achiziționate de la R&D Systems, Franța) și (ii) ester carboxifluorescein succinimidilic (CFSE, Invitrogen). Pentru citirea și analiza datelor a fost utilizat un citometru de flux FACSCalibur (BD-Pharmingen). După ce porțile au fost setate să includă numai celule viabile, au fost colectate și analizate 10 4 evenimente pe probă. Pentru fiecare marker, pragul pentru pozitivitate a fost definit în raport cu legarea nespecifică observată în prezența mAb de control al izotipului adecvat.

Testul proliferării CFSE

PBMC izolate din diferitele grupuri de șoareci au fost recoltate, spălate de două ori în PBS și colorate cu 0,63 μM CFSE (Molecular Probes, Eugene, OR) timp de 8 minute la RT. CFSE rezidual a fost îndepărtat prin trei spălări cu PBS. Celulele marcate cu CFSE au fost însămânțate în plăci cu 6 godeuri și stimulate fie cu IL-4 și CD40L (pentru stimularea celulelor B), fie cu 10 ng/ml enterotoxină stafilococică B (SEB) (pentru stimularea celulelor T); celulele martor nu au fost stimulate. Celulele au fost apoi crescute timp de 4 zile în mediu de cultură celulară. După 4 zile în cultură, celulele au fost colectate, colorate cu anti-CD45R/B220 mAb conjugat cu PE și fixate în 300 μL de 1x PBS conținând 1% formaldehidă. Intensitatea fluorescenței CFSE a fost măsurată prin citometrie de flux folosind un citometru de flux FACSCalibur (BD-Pharmingen).

In vitro testul migrației

Migrația dependentă de chemokine a PBMC-urilor izolate din diferite grupuri de șoareci a fost măsurată folosind un in vitro test de migrare cu două camere (folosind plăci Transwell achiziționate de la Costar, Cambridge, MA) urmat de analiza citometrică în flux. Pe scurt, 600 μL de tampon de migrare singur sau suplimentat cu CCL21 și CXCL12 (ambele la 500 ng/ml; sisteme de cercetare și dezvoltare) au fost adăugate în camera inferioară și au fost adăugate 10 4 celule suspendate în tamponul de migrare în camera superioară. Plăcile au fost apoi incubate timp de 3 ore la 37 ° C, iar celulele de intrare și celulele transmigrate au fost centrifugate, colorate cu anti-CD45R/B220 mAb conjugat PE, fixate în 300 μL de 1x PBS conținând 1% formaldehidă și numărate timp de 60 de secunde prin citometrie de flux folosind un citometru de flux FACSCalibur (BD-Pharmingen). Procentul de migrare a fost calculat ca procentul de celule de intrare care au migrat în camera inferioară. Pentru a calcula modificarea procentului de migrație indus de chemokine, procentul de celule care au migrat doar către mediu a fost scăzut din procentul de celule care au migrat către mediul care conține chemokinele.

analize statistice

Datele au fost testate pentru normalitate (folosind un test Anderson-Darling) și omogenitatea varianței înainte de alte analize statistice. Datele au fost distribuite în mod normal și au fost exprimate ca medie ± eroare standard a mediei (SEM). Diferențele semnificative între grupuri au fost analizate utilizând o analiză unidirecțională a varianței (pentru mai mult de două grupuri), urmată de post-testul lui Tukey folosind versiunea software SPSS 17. * P + P # P

Rezultate

Caracteristicile modelului animal diabetic și ale complicațiilor diabetului înainte și după suplimentarea orală cu propolis

În primul rând, am monitorizat schimbările în greutatea corporală, parametrii biochimici din sânge și numărul de leucocite în toate grupele de animale pe parcursul perioadei experimentale. Tratamentul șoarecilor cu STZ a dus la scăderea marcată a nivelului de insulină și la severitatea hiperglicemiei, care a fost încă detectabilă pe toată durata experimentului. La două săptămâni după injecția STZ și înainte de suplimentarea cu propolis, șoarecii diabetici au prezentat o scădere semnificativă a numărului de greutate corporală, leucocite și limfocite comparativ cu animalele de control non-diabetice (*P Tabelul 1 Influența inducerii diabetului de către STZ și suplimentarea cu propolis la șoareci diabetici asupra greutății corporale și parametrilor biochimici din sânge

Tratamentul șoarecilor diabetici cu propolis timp de 4 săptămâni a avut un efect clar și semnificativ (# P # P # P # P Tabelul 2 Efectele administrării de propolis la șoareci diabetici asupra nivelului plasmatic de glucoză, insulină și citokine

Tratamentul șoarecilor diabetici cu propolis a scăzut nivelul de radicali liberi din diferite organe

Nivelurile ROS au fost detectate în plasmă și în lizatele tisulare ale măduvei osoase (organul limfoid primar și originea tuturor celulelor imune), splina (un organ limfoid secundar care este un loc de recunoaștere a antigenului) și ficat. Datele acumulate de la 10 șoareci individuali din fiecare grup sunt prezentate în Fig. 1. Nivelurile ROS ale șoarecilor diabetici au fost semnificativ mai mari decât cele ale șoarecilor martor (*P # P FIG. 1

șoarecilor

Șoarecii diabetici prezintă profiluri lipidice modificate semnificativ, prezentând o tendință spre obezitate anormală

Inducerea diabetului este frecvent asociată cu dislipidemie, un fenomen caracterizat prin modificarea profilurilor lipidice plasmatice și un risc crescut de boli cardiovasculare. Prin urmare, am monitorizat profilurile lipidice în cele 3 grupe de animale. Datele acumulate de la 10 șoareci individuali din fiecare grup sunt prezentate în Fig. 2. Nivelul LDL-C și nivelul colesterolului total au fost semnificativ mai mari în plasma șoarecilor diabetici decât în ​​cea a șoarecilor martor non-diabetici (*P # P FIG. 2

Tratamentul șoarecilor diabetici cu propolis îmbunătățește stimularea antigenului și proliferarea limfocitelor B și T

Suplimentarea șoarecilor diabetici cu propolis îmbunătățește chimiotaxia mediată de CCL21 și CXCL12 în limfocitele B și T

Discuţie

Mai mult, administrarea orală a extractului de propolis a suprimat semnificativ nivelul glicemiei și a contribuit la reducerea dislipidemiei la șobolanii diabetici [47]. Propolisul, care prezintă o puternică activitate anti-oxidantă, a fost confirmat că suprimă nivelul MDA și crește activitatea anti-oxidantă la modelele animale diabetice și la pacienții umani [48-50]. Complicațiile diabetice sunt atribuite în primul rând nivelurilor crescute de ROS datorate hiperglicemiei [51, 52]. Studiile clinice au arătat, de asemenea, că îmbunătățirea stresului oxidativ poate preveni progresia ambelor tipuri de diabet [53, 54].

Important, T1D contribuie la inflamația prelungită, care se caracterizează prin afectarea răspunsului imun datorită nivelurilor crescute de IL-1β, IL-6 și TNF-α [55, 56]. Prin urmare, țintirea mediatorilor inflamatori a fost propusă ca o strategie eficientă pentru îmbunătățirea răspunsului imun și modularea inflamației la pacienții diabetici. În studiul de față, am arătat că suplimentarea cu propolis a abrogat procesul inflamator asociat cu diabetul și a restabilit nivelul IL-1 β, IL-6 și TNF-α la niveluri aproape normale. S-a demonstrat că propolisul inhibă direct producerea de citokine de către celulele imune [57]. Khayyal și colab. (2003) au arătat că administrarea unui extract apos de propolis pentru tratamentul bolilor inflamatorii a scăzut nivelul citokinelor pro-inflamatorii (TNF-α și IL-6) [58].

Concluzii

Datele noastre sugerează că tratamentul cu propolis a îmbunătățit eficacitatea chemotaxiei celulelor B și T la șoarecii diabetici. Luate împreună, datele noastre sugerează că propolisul atenuează profilurile lipidice anormale, stresul oxidativ, inflamația și afectarea proliferării limfocitelor și migrarea către chemokine pentru a menține un răspuns imun eficient al limfocitelor. Prin urmare, utilizarea propolisului este o strategie potențială pentru tratamentul complicațiilor diabetice.