Relația cauză-efect între hiperfibrinogenemie și boala vasculară

Bryce Kerlin, Brian C. Cooley, Berend H. Isermann, Irene Hernandez, Rashmi Sood, Mark Zogg, Sara B. Hendrickson, Michael W. Mosesson, Susan Lord, Hartmut Weiler; Relația cauză-efect între hiperfibrinogenemie și boala vasculară. Blood 2004; 103 (5): 1728–1734. doi: https://doi.org/10.1182/blood-2003-08-2886

Descărcați fișierul de citare:

Abstract

Nivelurile plasmatice crescute de fibrinogen sunt asociate cu prezența bolilor cardiovasculare, dar este controversat dacă fibrinogenul crescut conferă în mod cauzal un risc crescut și, ca atare, este un adevărat modificator al bolilor cardiovasculare sau este pur și simplu asociat cu boala. Investigând un model transgenic de șoarece de hiperfibrinogenemie, am arătat că concentrația plasmatică crescută de fibrinogen (1) determină depunerea crescută de fibrină în organe specifice, (2) interacționează cu un modificator independent al activității hemostatice pentru a regla rotirea/depunerea fibrinei, (3) exacerbează neointimalul hiperplazia într-un model experimental de remodelare vasculară indusă de stază, totuși (4) poate suprima generarea de trombină ca răspuns la o provocare procoagulantă. Aceste descoperiri oferă dovezi experimentale directe că hiperfibrinogenemia este mai mult decât un produs secundar al bolilor cardiovasculare și poate funcționa independent sau interactiv pentru a modula severitatea și/sau progresia bolii vasculare.

Introducere

Șoarecii modificați genetic descriși recent, cu niveluri crescute de fibrinogen plasmatic cronic, în absența inflamației subiacente, oferă un nou instrument experimental pentru a investiga relația cauză-efect dintre hiperfibrinogenemie și boala vasculară. 18 Tulpina de șoarece mutant (denumită în continuare șoareci Hifib) a fost derivată prin microinjecția pronocleară a ovocitelor a întregului locus fibrinogen al șoarecelui, incluzând toate cele 3 lanțuri de fibrinogen, precum și câteva kilobaze ale secvenței flancante. Alela transgenică adăugată a fibrinogenului este moștenită într-o manieră mendeliană, iar șoarecii au prezentat niveluri de fibrinogen plasmatic crescut de aproximativ 2 ori, dar nu au prezentat semne evidente de boală și au prezentat performanțe reproductive normale. 18 Hiperfibrinogenemia dependentă de transgen nu a avut niciun efect asupra aterogenezei induse de dietă la șoarecii C57Bl6 19 sau la șoarecii transgenici ApoE * 3-Leiden. 20

Obiectivul studiului actual a fost să investigheze dacă fibrinogenul crescut cronic la șoarecii Hifib (1) determină creșterea depunerii de fibrină intravasculară sau modificarea fluctuației fibrinei (ogenilor); (2) modifică formarea plachetelor-trombului ca răspuns la leziunea endotelială acută; (3) afectează incidența sau amploarea trombozei induse de stază și a remodelării vasculare; sau (4) mărește tromboza la șoareci cu o stare hipercoagulabilă subiacentă. Ultimul obiectiv a fost abordat prin încrucișarea șoarecilor Hifib cu o tulpină de șoarece modificată genetic care transportă o mutație (TMPro) în gena trombomodulinei (TM), 21,22 pentru a produce șoareci Hifib/TMPro. Mutația TMPro reduce drastic activitatea cofactorului TM în activarea dependentă de trombină a proteinei C și astfel determină o stare hipercoagulabilă. Prin urmare, analiza șoarecilor Hifib/TMPro ne-a permis să investigăm consecințele hiperfibrinogenemiei la animale care au prezentat o susceptibilitate crescută la tromboză.

Materiale și metode

Animale transgenice

Model de leziuni carotide acute

Leziunea arterială indusă de FeCl3 a fost indusă conform procedurilor publicate. 24,25 Artera carotidă comună stângă a fost expusă prin disecție contondentă și fluxul sanguin a fost înregistrat cu sonde de flux Doppler (model 0,5VB; Transonic Systems, Ithaca, NY) poziționate în jurul capătului distal al arterei. La zece minute după plasarea sondei, o bandă de hârtie de filtru de 1,0 × 0,6 mm 2 înmuiată în 20% FeCl3 a fost aplicată pe suprafața adventitială a arterei timp de 1 minut. Câmpul a fost spălat cu ser fiziologic și fluxul a fost monitorizat continuu. În unele experimente, procedura a fost apoi repetată pe carotida comună dreaptă. Timpii de ocluzie au fost exprimați ca t75, timpul la care fluxul amplitudinii pulsului a scăzut la 25% din debitul inițial, definit ca debitul mediu care apare între minutul 2 și minutul 4 după accidentare. Datele au fost evaluate pentru semnificația statistică prin analiza Wilcoxon a sumelor de rang și testul Student t.

Ligarea arterei carotide

Artera carotidă comună stângă a fost disecată și fluxul sanguin a fost întrerupt permanent prin aplicarea unei ligaturi strânse în apropierea bifurcației carotide așa cum este descris. 26 După 4 săptămâni, toate animalele au fost perfuzate la presiune fiziologică cu 4% paraformaldehidă în tampon fosfat de sodiu 0,1 M, pH 7,3. Arterele carotide comune stânga și dreapta au fost disecate, încorporate în parafină, iar secțiunile seriale (5-μm grosime) au fost tăiate la intervale de 150 μm pe toată lungimea vasului. Imaginile digitalizate ale acestor vase au fost analizate folosind software-ul de analiză a imaginii (NIH Image 1.60; National Institutes of Health, Bethesda, MD) așa cum este descris. 26

Determinarea nivelurilor de fibrinogen plasmatic, a complexelor trombină-antitrombină, dimerul D, depunerea fibrinei tisulare și generarea de trombină in vitro

Rezultate

Metabolismul fibrinei (ogenilor) este modificat la șoarecii hiperfibrinogenemici

Nivelurile de fibrinogen plasmatic la șoarecii Hifib în vârstă de 8 până la 16 săptămâni, determinate de ELISA, au fost de aproximativ 1,5 ori mai mari decât la șoarecii de tip sălbatic (3,5 ± 0,4 versus 2,4 ± 0,4 mg/mL ± SD; P ≤ .0005; n = 12/grup). Valorile obținute prin ELISA s-au corelat cu cantitatea de proteină coagulabilă întreagă în plasma săracă în trombocite. Nivelurile de fibrinogen la șoarecii TMPro și Hifib/TMPro au fost aceleași ca la șoarecii de tip sălbatic și respectiv la șoarecii Hifib, demonstrând că mutația TMPro nu modifică nivelurile de fibrinogen din mediul înconjurător.

Nivelurile plasmatice ale produsului divizat de fibrină D-dimer au fost substanțial crescute la șoarecii Hifib (Figura 1) comparativ cu șoarecii de tip sălbatic (40 ± 17 față de 7,9 ± 2 μg/mL ± SD; P ≤ .0005) și au fost, de asemenea, mai mari decât cele măsurate la animalele TMPro (16,6 ± 6 μg/mL ± SD, P ≤ .005). Reconstituirea probelor de plasmă de la șoareci cu deficiență de fibrinogen cu fibrinogen de șoarece purificat la concentrații de până la 5 mg/ml nu a dat un semnal de dimer D detectabil. În mod similar, scăderea plasmei normale de șoarece cu fibrinogen în exces pentru a obține o concentrație plasmatică de 5 mg/ml nu a modificat concentrația măsurată a dimerului D. Aceste experimente de control elimină posibilitatea ca creșterea aproximativ 5 ori a dimerului D la șoarecii Hifib să fie atribuită reactivității încrucișate a anticorpilor de testare cu fibrinogen de șoarece. La șoarecii Hifib/TMPro, nivelurile dimerilor D au fost și mai crescute (93 ± 40 μg/mL ± SD). Aceasta arată că creșterea concentrației plasmatice a fibrinogenului a provocat în sine generarea crescută de produse de degradare a fibrinei și - prin inferență - formarea crescută a fibrinei. Acest efect este clar observat la șoarecii Hifib și este mai pronunțat la animalele Hifib/TMPro, demonstrând că ambele mutații interacționează într-o manieră sinergică în ceea ce privește cifra de afaceri a fibrinei (ogenilor).

Concentrația plasmatică a produsului de degradare a fibrinei D-dimer la șoareci mutanți. Concentrația de dimeri D în starea de echilibru în plasmă a șoarecilor hiperfibrinogenemici (Hifib și Hifib/TMPro), șoarecilor de tip sălbatic (wt) și șoarecilor cu deficit de trombomodulină (TMPro) a fost determinată prin ELISA. Valorile sunt date ca concentrație aparentă de dimer D determinată dintr-un standard construit cu D-dimer uman purificat. Nivelurile crescute de dimeri D la șoareci hiperfibrinogenemici au îmbunătățit formarea și degradarea ulterioară a fibrinei. Barele indică media; asteriscurile denotă semnificație statistică sub nivelul de încredere 0,05 (test Student t).

Concentrația plasmatică a produsului de degradare a fibrinei D-dimer la șoareci mutanți. Concentrația dimerului D în starea de echilibru în plasma șoarecilor hiperfibrinogenemici (Hifib și Hifib/TMPro), șoarecilor de tip sălbatic (wt) și șoarecilor cu deficit de trombomodulină (TMPro) a fost determinată prin ELISA. Valorile sunt date ca concentrație aparentă de dimer D determinată dintr-un standard construit cu D-dimer uman purificat. Nivelurile crescute de dimeri D la șoareci hiperfibrinogenemici au îmbunătățit formarea și degradarea ulterioară a fibrinei. Barele indică media; asteriscurile denotă semnificație statistică sub nivelul de încredere 0,05 (test Student t).

Depunerea fibrinei reticulate în țesuturile șoarecilor hiperfibrinogenemici. Cantități echivalente (normalizate până la greutatea inițială a țesutului umed) din fracția insolubilă în uree a extractelor de țesut de la șoareci de tip sălbatic (greutate), deficit de trombomodulină (TMPro) și șoareci hiperfibrinogenemici (Hifib și Hifib/TMPro) au fost supuși SDS-PAGE (electroforeză pe gel de dodecil sulfat de sodiu - poliacrilamidă) și lanțul β de fibrină (săgeți) a fost detectat cu anticorpi specifici fibrinei care recunosc neoepitopul generat de eliberarea de fibrinopeptidă B mediată de trombină. Fiecare bandă reprezintă o analiză a unui organ de la un șoarece; Se afișează 6 benzi pe tulpină de șoarece. Conținutul total de proteine ​​încărcat în fiecare bandă a fost aproximativ echivalent, așa cum sa constatat prin colorarea Poinceau S a petei (nu este prezentat). Excesul de fibrină se găsește numai în splina șoarecilor Hifib și nu în alte organe, inclusiv în ficat. Șoarecii cu hiperfibrinogenemie și deficit de trombomodulină (Hifib/TMPro) prezintă exces de fibrină în ficat, dar nu în splină sau alte organe (inimă, plămâni, rinichi, creier neprezentate).

Depunerea fibrinei reticulate în țesuturile șoarecilor hiperfibrinogenemici. Cantități echivalente (normalizate până la greutatea inițială a țesutului umed) din fracția insolubilă în uree a extractelor de țesut de la șoareci de tip sălbatic (greutate), deficit de trombomodulină (TMPro) și șoareci hiperfibrinogenemici (Hifib și Hifib/TMPro) au fost supuși SDS-PAGE (electroforeză pe gel de dodecil sulfat de sodiu - poliacrilamidă) și lanțul β de fibrină (săgeți) a fost detectat cu anticorpi specifici fibrinei care recunosc neoepitopul generat de eliberarea de fibrinopeptidă B mediată de trombină. Fiecare bandă reprezintă o analiză a unui organ de la un șoarece; Se afișează 6 benzi pe tulpină de șoarece. Conținutul total de proteine ​​încărcate în fiecare bandă a fost aproximativ echivalent, așa cum sa constatat prin colorarea Poinceau S a petei (nu este prezentat). Excesul de fibrină se găsește numai în splina șoarecilor Hifib și nu în alte organe, inclusiv în ficat. Șoarecii cu hiperfibrinogenemie și deficit de trombomodulină (Hifib/TMPro) prezintă exces de fibrină în ficat, dar nu în splină sau în alte organe (inimă, plămâni, rinichi, creier neprezentate).

Hiperfibrinogenemia suprima generarea de trombină

Concentrația plasmatică ambiantă a markerului surogat de generare a trombinei, complexul trombină-antitrombină (TAT), a fost oarecum mai mică la Hifib decât la șoarecii normali (Hifib: 0,5 ± 1,0 ng/ml; tip sălbatic: 0,8 ± 1,0 ng/ml; Figura 3A), dar această diferență nu a fost semnificativă statistic. Confirmând descoperirile anterioare, 21 de șoareci TMPro au prezentat niveluri mai ridicate de TAT decât șoarecii de tip sălbatic (2,6 ± 2,1 ng/ml; P ≤ 0,05). Nivelurile TAT la șoarecii Hifib/TMPro (0,4 ± 0,9 ng/ml) s-au asemănat cu cei observați la șoarecii Hifib și au fost semnificativ mai mici decât cei observați la șoarecii TMPro (P ≤ 0,05). Injecția a 0,05 U de α-trombină de șoarece la șoareci de tip sălbatic și TMPro a crescut nivelurile TAT plasmatice la 30 ± 7 ng/ml și respectiv 56 ± 18 ng/ml, în concordanță cu amplificarea crescută a coagulării dependente de trombină la șoarecii TMPro. Aceeași manipulare nu a provocat o formare îmbunătățită a complexului TAT la șoarecii Hifib/TMPro (27 ± 9 ng/ml), în comparație cu șoarecii de tip sălbatic (Figura 3B).

Concentrația plasmatică a complexului trombină-antitrombină la șoareci mutanți. Nivelurile plasmatice ale complexelor trombină-antitrombină (TAT) au fost măsurate prin ELISA. (A) Nivelurile TAT la starea de echilibru la șoarecii hiperfibrinogenemici (Hifib) și la șoarecii hiperfibrinogenemici cu deficit de trombomodulină suprapusă (HiFib/TMPro) sunt comparabile cu cele măsurate la șoarecii de tip sălbatic (wt). (B) Șoarecii au fost injectați intravenos cu un bolus de 0,05 U de α-trombină de șoarece pentru a induce formarea complexului TAT, iar nivelurile TAT au fost măsurate la 10 minute după perfuzia de trombină. Hiperfibrinogenemia suprima creșterea formării TAT observată la șoareci cu deficit de trombomodulină izolat (TMPro). Valorile sunt date ca concentrație aparentă de TAT determinată dintr-un standard construit cu TAT uman purificat.

Concentrația plasmatică a complexului trombină-antitrombină la șoareci mutanți. Nivelurile plasmatice ale complexelor trombină-antitrombină (TAT) au fost măsurate prin ELISA. (A) Nivelurile TAT la starea de echilibru la șoarecii hiperfibrinogenemici (Hifib) și la șoarecii hiperfibrinogenemici cu deficit de trombomodulină suprapusă (HiFib/TMPro) sunt comparabile cu cele măsurate la șoarecii de tip sălbatic (wt). (B) Șoarecii au fost injectați intravenos cu un bolus de 0,05 U de α-trombină de șoarece pentru a induce formarea complexului TAT, iar nivelurile TAT au fost măsurate la 10 minute după perfuzia de trombină. Hiperfibrinogenemia suprima creșterea formării TAT observată la șoareci cu deficit de trombomodulină izolat (TMPro). Valorile sunt date ca concentrație aparentă de TAT determinată dintr-un standard construit cu TAT uman purificat.

Pentru a evalua în continuare efectul nivelurilor de fibrinogen asupra generării trombinei, am măsurat generarea in vitro a trombinei în plasma de șoarece afibrinogenemică săracă în trombocite (preparată din șoareci cu deficit de fibrinogen) care fusese reîncărcată cu cantități variabile de fibrinogen de șoarece purificat (Figura 4). Nivelul maxim al activității trombinei, precum și aria însumată a curbei de generare a trombinei, a fost invers corelată cu concentrația plasmatică a fibrinogenului. Această observație sugerează că nivelurile ridicate de fibrinogen diminuează formarea de trombină la șoareci, reproducând rezultatele anterioare obținute cu plasmă reîncărcată cu fibrinogen de la pacienți umani afibrinogenemici. 28

Efectul fibrinogenului asupra formării in vitro a trombinei. Generarea in vitro a trombinei în funcție de concentrația plasmatică a fibrinogenului a fost determinată prin măsurarea activității amidolitice a trombinei generate în timp în plasmă de șoareci cu deficit de fibrinogen reconstituiți cu cantități variabile de fibrinogen de șoarece. Generarea trombinei se corelează invers cu concentrația plasmatică de fibrinogen.

Efectul fibrinogenului asupra formării in vitro a trombinei. Generarea in vitro a trombinei în funcție de concentrația plasmatică a fibrinogenului a fost determinată prin măsurarea activității amidolitice a trombinei generate în timp în plasmă de șoareci cu deficit de fibrinogen reconstituiți cu cantități variabile de fibrinogen de șoarece. Generarea trombinei se corelează invers cu concentrația plasmatică de fibrinogen.

Hiperfibrinogenemia nu accelerează formarea trombocitelor arteriale

Hiperfibrinogenemia nu provoacă formarea trombului ca răspuns la staza vasculară

Aceste date arată că hiperfibrinogenemia preexistentă nu provoacă tromboză mai mare decât cea observată la animalele de tip sălbatic sau modifică incidența formării neointima în acest model. Pe de altă parte, hiperfibrinogenemia a modificat remodelarea vasculară provocată de încetarea fluxului sanguin, rezultând hiperplazie intimă mărită și îngustarea lumenului vasului.

Discuţie

Descoperirile noastre oferă dovezi că nivelurile crescute de fibrinogen determină depunerea crescută a fibrinei în organe specifice și exacerbează hiperplazia neointimală într-un model experimental de remodelare vasculară indusă de stază. Pe de altă parte, hiperfibrinogenemia nu a modificat amploarea sau incidența trombozei arteriale indusă fie de leziuni chimice acute, fie de staza fluxului sanguin. Într-adevăr, nivelurile crescute de fibrinogen plasmatic la șoareci au suprimat generarea de trombină în plasmă in vitro, precum și în sângele animalelor supuse unei provocări trombotice. Aceste date stabilesc o relație directă cauză-efect între o creștere moderată a concentrației de fibrinogen și modificări ale funcției sistemului hemostatic și, respectiv, a răspunsului la leziuni vasculare.

Astfel, fibrinogenul plasmatic crescut pare să suprime formarea de trombină în plasmă, dar și să îmbunătățească depunerea fibrinei în unele organe. O explicație pentru acest potențial paradox, care este în concordanță cu descoperirile noastre experimentale, este că trombina, odată formată, poate fi sechestrată pe fibrină (ogen) și este apoi fie eliminată rapid din circulația 40,41, fie devine asociată cu fibrina depusă la peretele vascular. Trombina asociată cu fibrina este protejată împotriva inactivării prin antitrombină și păstrează activitatea, 42,43 și, prin urmare, poate duce la propagarea localizată și la îmbunătățirea depunerii de fibrină, suprimând în același timp formarea complexului trombină-antitrombină.

Pe scurt, datele noastre oferă dovezi experimentale directe că o creștere moderată a concentrației de fibrinogen are ca rezultat formarea crescută de fibrină și degradarea ulterioară a fibrinei, funcția modificată a sistemului de coagulare și un răspuns modificat la leziunea vasculară. Aceste descoperiri stabilesc că hiperfibrinogenemia este mai mult decât un produs secundar al bolilor cardiovasculare, dar poate - într-un mod pozitiv sau negativ - determina severitatea și/sau progresia bolii vasculare. De remarcat, descoperirile noastre prezic că proprietățile specifice speciilor fibrinogenului, cum ar fi interacțiunea cu afinitate ridicată a trombinei cu lanțul γ'fibrinogen, pot exercita efecte relevante din punct de vedere fiziologic la om, care pot scăpa de detectare la modelele de șoareci utilizate pentru a testa funcția fibrinogenului.

Prepublicat online ca Blood First Edition Paper, 13 noiembrie 2003; DOI 10.1182/blood-2003-08-2886.

• Deficitul Af17 crește excreția de sodiu și scade tensiunea arterială American Society of
• Dozare adecvată de chimioterapie pentru pacienții adulți obezi cu cancer American Society of Clinical
• Acid Reversion Products din Jurnalul D-Glucozei al American Chemical Society
• Neutrofilele din sânge se corelează cu obezitatea la pacienții astmatici European Respiratory Society
• Asociațiile dietei cu albuminuria și funcția renală scad Societatea Americană de Nefrologie