Abstract

Studii de prindere a glucozei

Studiile de fixare a glucozei au fost efectuate așa cum s-a descris anterior (23). Clemele au fost efectuate la șoareci în mișcare liberă. GIR a fost calculat odată ce perfuzia de glucoză a atins o rată mai mult sau mai puțin constantă, cu niveluri de glucoză din sânge la 5 mmol/L (80-90 min după începerea perfuziei cu insulină). Ulterior, nivelul glicemiei a fost menținut constant la 5 mmol/L timp de 15-20 min, iar GIR a fost calculat. Rata de eliminare a glucozei a fost calculată prin împărțirea ratei perfuziei [3-3 H] glucoză la activitatea specifică glucozei plasmatice [3-3 H] (24,25). Producția endogenă de glucoză (EGP) în timpul clemei a fost calculată prin scăderea GIR din rata de eliminare a glucozei (24,25). Pentru a evalua absorbția de glucoză specifică țesutului, un bolus (10 μCi) de 2- [1-14 C] deoxiglucoză a fost administrat printr-un cateter la sfârșitul perioadei de echilibru. Sângele a fost prelevat la 2, 15, 25 și 35 de minute după nașterea bolusului. Zona de sub curba de dispariție a 2- [1-14 C] deoxiglucoză a fost utilizată împreună cu concentrația tisulară de 2- [1-14C] dezoxiglucoză fosforilată pentru a calcula absorbția glucozei.

lipoliza

Analize de lipoliză

Adipocitele au fost izolate și lipoliza evaluată așa cum s-a descris anterior (26). Adipocitele izolate au fost incubate în absența sau prezența a 100 nmol/L insulină, 100 ng/mL recombinant IL-6 murin (Sisteme R&D) sau 1 μmol/L izoproterenol (Sigma, Buchs, Elveția) timp de 1 oră. Nivelurile FFA au fost măsurate utilizând metoda ACS-ACOD-MEHA (Wako Chemicals GmbH, Neuss, Germania).

Determinarea dimensiunii celulei

Mărimea celulei adipocitelor izolate a fost analizată de un contor de colier Multisizer 3 așa cum s-a descris anterior (27).

Prelevarea de sânge

Cavitatea abdominală a șoarecelui a fost deschisă imediat după moarte, iar vena portală a fost expusă. Vena portală a fost perforată de o seringă (0,30 mm [30G] × 8 mm; BD, Franklin Lakes, NJ) și sângele a fost colectat. Sângele sistemic a fost prelevat după puncție cardiacă folosind seringi similare. S-a adăugat sânge într-un tub Eppendorf cu o concentrație finală de 5 mmol/L EDTA. După centrifugare, plasma a fost depozitată la -80 ° C până la prelucrarea ulterioară.

Determinarea nivelurilor de insulină plasmatică, trigliceride și FFA

Nivelurile trigliceridelor plasmatice (TG) și ale FFA au fost determinate așa cum s-a descris în altă parte (28). Nivelurile de insulină plasmatică au fost măsurate folosind un kit ELISA așa cum s-a descris anterior (29).

Western Blotting

Probele de ficat sau AT au fost omogenizate și Western blot s-a efectuat așa cum s-a descris anterior (30). Au fost utilizați următorii anticorpi primari: anti-gp130 și anti-supresor al citokinei de semnalizare 3 (SOCS3) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX); anti-phosphop38, anti-phosphoERK și anti-ERK (Cell Signaling, Danvers, MA); și anti-actină (Millipore, Billerica, MA). Membranele au fost analizate cu ajutorul unui analizor luminescent de imagine care rulează software-ul Image Reader (FujiFilm, Dielsdorf, Elveția).

Extracția ARN și RT-PCR cantitativă

ARN-ul total a fost extras folosind un mini kit RNeasy Lipid Tissue (QIAGEN, Basel, Elveția), iar concentrația a fost determinată spectrofotometric (NanoDrop 1000; NanoDrop Instruments, Boston, MA). O microgramă de ARN a fost transcrisă invers cu SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen, Basel, Elveția) folosind un primer hexamer aleatoriu (Invitrogen). TaqMan (Applied Biosystems, Rotkreuz, Elveția) a fost utilizat pentru amplificarea PCR în timp real. Au fost utilizați următorii primer PCR (Applied Biosystems): factor de necroză tumorală-α (TNF-α), Mm00443258_m1; IL-6, Mm00446190_m1; F4/80, Mm00802529_m1; CD11b, Mm00434455_m1; acizi grași sintaza (FAS), Mm00662319_m1; proliferator de peroxizomi - receptor activat-α (PPARα), Mm00627559_m1; SREBP1, Mm00550338_m1; SCD-1, Mm01197142_m1; CPT-1, Mm00550438_m1; și AOX, Mm00443579_m1. Expresia genică relativă a fost obținută după normalizare la ARN 18S (Applied Biosystems) folosind ecuația 2 −ΔΔcp (31).

TG hepatic și determinarea lipidelor totale

Țesutul hepatic (20-30 mg) a fost omogenizat în PBS, iar lipidele au fost extrase într-un amestec de cloroform-metanol (2: 1). Lipidele hepatice totale au fost determinate printr-o reacție sulfo-fosfo-vanilină așa cum s-a descris anterior (32). Nivelurile TG hepatice au fost determinate în 50 mg de țesut hepatic conform metodei Bligh și Dyer (33) și cuantificate cu un test enzimatic (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Elveția).

Histologie

Țesuturile hepatice au fost fixate în 4% formalină tamponată și încorporate în parafină. Secțiunile au fost tăiate și colorate cu hematoxilină-eozină.

Analiza datelor

Creșterea în greutate și adipogeneza similare la șoarecii gp130 F/F și gp130 poadipo. A: Analiza Western blot a nivelurilor de proteine ​​gp130 în celulele și țesuturile respective ale șoarecilor gp130 F/F și gp130 ipoadipo. B: Greutatea corporală a șoarecilor hipo-alimentați (●, ●) și HFD (■, ■) gp130 F/F și gp130 iceadipo (n = 5-24). Greutăți de grăsime ale depozitelor epididimale (C) și mezenterice (D) ale șoarecilor padipo gp130 F/F și gp130 hrăniți cu chow și HFD (n = 6-18). Diametrul adipocitelor epididimale (E) și mezenterice (F) ale șoarecilor hipo-alimentați (●, ●) și HFD (■, ■) gp130 F/F și gp130 Δadipo (n = 4-6). Datele sunt medii ± SEM. * P Δadipo; Adipo, adipocite; F/F, gp130 F/F; SkM, mușchi scheletic.

Lipoliza bazală redusă și nivelurile FFA portal la șoarecii obezi gp130 ipoadipo

Lipoliza bazală redusă și nivelurile de FFA portal la șoarecii obezi gp130 Δadipo. Eliberarea bazală de FFA de la adipocitele epididimale (A) și mezenterice (B) ale șoarecilor gp130 F/F și gp130 hp-adipo (H = D) (n = 5-10). Nivelurile de proteine ​​ale fosfo-ERK, ERK și actină în epididimale (C) și mezenterice (D) WAT ale șoarecilor gp130 F/F și gp130 ipoadipo alimentate cu HFD (n = 4). Concentrația de FFA a fost determinată în probe de plasmă sistemice (E) și portale (F) de șoareci gp130 F/F hrăniți și HFD și șoareci gp130 ipoadipo (n = 3-8). IL-6 (G), precum și expresia mARN-ului CD11b și F4/80 (H) în grăsimea mezenterică a șoarecilor gp130 F/F și gp130 ipoadipo alimentați cu HFD (n = 6). Datele sunt medii ± SEM. * P Δadipo; F/F, gp130 F/F; pERK, fosfo-ERK.

Steatoza hepatică redusă la șoareci poadipo gp130 alimentați cu HFD

Steatoza hepatică redusă la șoarecii gp130 ipoadipo alimentați cu HFD. A: Nivelurile de proteine ​​ale fosfo-p38 și actinei în ficatul șoarecilor gp130 F/F alimentați cu HFD și gp130 șoareci ipoadipo (n = 10). B: Nivelurile de proteine ​​ale SOCS3 și ale actinei în ficatul șoarecilor gp130 F/F alimentați cu HFD și gp130 șoareci ipoadipo (n = 6). C și D: nivelurile totale de lipide hepatice și TG hepatice ale șoarecilor gp130 F/F și gp130 fedadipo hrăniți cu chow și HFD (n = 4-6). E: hematoxilină-eozină histologică reprezentativă - secțiuni hepatice colorate ale șoarecilor gp130 F/F alimentați cu HFD și șoareci gp130 ipoadipo. F și G: expresia ARNm a genelor respective în ficatul șoarecilor gp130 F/F alimentați cu HFD și șoarecii gadipo gp130 (n = 10). Datele sunt medii ± SEM. * P Δadipo; F/F, gp130 F/F .

Sensibilitate îmbunătățită la insulina hepatică la șoareci poadipo gp130 alimentați cu HFD

Îmbunătățirea sensibilității la insulină hepatică la șoarecii poadipo gp130 alimentați cu HFD. GIR (A), EGP (B) și absorbția glucozei în mușchiul cvadriceps (C) în timpul clemelor hiperinsulinemico-euglicemice la șoarecii gp130 F/F și gp130 Fadipo alimentați cu HFD (n = 4-6). Eliberarea FFA inhibată de insulină de la adipocitele epididimale (D) și mezenterice (E) ale șoarecilor 1adipo gp130 F/F și gp130 alimentați cu HFD (n = 8-10). Datele sunt medii ± SEM. * P Δadipo; F/F, gp130 F/F; inh., inhibiție; Sk., Scheletic.

Corelația pozitivă a expresiei Omental IL-6 cu steatoză hepatică și rezistență la insulină la oameni

Similar cu observațiile la rozătoare, expresia IL-6 a fost crescută în visceral/omental în comparație cu depozitele de grăsime subcutanată la oamenii obezi (43). Mai mult, creșterea lipolizei omentale, dar nu a celei subcutanate, a fost legată de boala hepatică grasă indusă de obezitate la oamenii cu obezitate morbidă (44). Pentru a descoperi dacă lipoliza grăsimilor omentale indusă de IL-6 poate contribui la steatoza hepatică asociată cu obezitatea și la rezistența la insulină, expresia mARN-ului IL-6 a fost analizată în AT de slab (n = 12, IMC 24,5 ± 0,2 kg/m2) și supraponderal. sau indivizi obezi (n = 51, IMC 34,4 ± 0,8 kg/m 2) și corelați cu conținutul de grăsime hepatică. Caracteristicile clinice de bază ale acestor subiecți sunt prezentate în tabelul 1. Sprijinind constatările anterioare (43), mARN-ul IL-6 a fost crescut la omental, dar nu la AT subcutanat la obezi comparativ cu persoanele slabe (Fig. 5A). De remarcat, am găsit o corelație pozitivă semnificativă între omental (r = 0,31, P Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up

Caracteristicile clinice de bază ale subiecților umani

Corelația pozitivă a expresiei omentale a IL-6 cu steatoza hepatică și rezistența la insulină la om. A: Expresia mARN-ului IL-6 în WAT omental și subcutanat la subiecți umani slabi (n = 12) și obezi (n = 51). Expresia mmentală a IL-6 Omental se corelează cu conținutul de grăsime hepatică (B) și GIR în timpul stării de echilibru a unei cleme hiperinsulinemico-euglicemice (C). Datele sunt medii ± SEM. #P = 0.11 (test t Student). sc, subcutanat.

Discuţie

Studiul actual sugerează că semnalizarea IL-6 - lipoliza mediată poate fi limitată la AT omental/mezenteric și contribuie la rezistența la insulină hepatică și steatoză. Această noțiune se bazează pe următoarele constatări: 1) Lipoliza din AT mezenteric, dar nu epididimal, este redusă la șoarecii gp130 ipoadipo alimentați cu HFD comparativ cu colegii de control și 2) epuizarea gp130 în mod specific în adipocite reduce rezistența la insulină hepatică indusă de HFD și steatoza.

Pe lângă IL-6, alte citokine care semnalizează prin gp130 ar fi putut contribui la fenotipul observat. S-a demonstrat că mai multe citokine IL-6 afectează individual diferențierea și adipogeneza, transformând gp130 într-o potențială țintă terapeutică pentru combaterea obezității și a bolilor asociate acesteia (9). În consecință, s-a demonstrat recent că blocarea semnalizării trans IL-6 folosind o proteină solubilă gp130 Fc reduce infiltrarea indusă de obezitate a macrofagelor în AT (48). Am constatat în studiul actual că lipsa semnalizării citokinelor IL-6 la adipocite nu a avut niciun impact asupra masei grase și a dimensiunii adipocitelor. Această observație sugerează că semnalizarea citokinei IL-6 nu afectează adipogeneza. Cu toate acestea, expresia Cre în modelul nostru de șoarece a fost sub controlul promotorului adiponectinei și, prin urmare, a fost indusă doar în timpul etapelor tardive ale diferențierii adipocitelor, deoarece este situată în aval de C/EBP (49). Astfel, efectele potențiale ale citokinelor IL-6 individuale asupra diferențierii precoce a adipocitelor (9) s-ar putea să nu se reflecte în șoarecii gp130 ipoadipo.

În concluzie, creșterea asociată obezității în semnalizarea citokinelor mezenterice/omentale AT IL-6 promovează eliberarea FFA în circulația portală, inducând steatoză hepatică și/sau rezistență la insulină. Prin urmare, blocarea semnalizării citokinelor IL-6 în adipocite poate fi o abordare nouă pentru bontarea diafragmei dăunătoare a grăsimii-ficatului în obezitate. În acest scop, dezvoltarea vectorilor de virus adeno-asociați celulelor poate fi un instrument promițător în viitor (52,53).

Informații despre articol

Mulțumiri. Autorii îi mulțumesc lui Eugen Schoenle (Spitalul Universitar pentru Copii, Zürich, Elveția) și Giatgen Spinas (Spitalul Universitar, Zürich, Elveția) pentru sprijin continuu și Alexandrei Grob (Spitalul Universitar pentru Copii, Zürich, Elveția) pentru ajutor cu reproducerea și genotiparea șoarecilor.

Finanțarea. Această lucrare a fost susținută de un grant de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 1052/1, „Obesity Mechanisms”, către MB) și granturi de cercetare de la Swiss National Science Foundation (# 310030_160129 către DK) și Olga Mayenfisch Stiftung, Zurich (către SW ).

Dualitatea interesului. Nu au fost raportate potențiale conflicte de interese relevante pentru acest articol.

Contribuțiile autorului. S.W. a contribuit la conceptul de studiu, lucrări experimentale, discuții și scriere, revizuire și editare a manuscrisului. F.I., F.C.L., T.D.C. și M.B. a contribuit la munca experimentală, la discuții și la revizuirea și editarea manuscrisului. W.M. a furnizat șoarecii gp130 ipoadipo, a oferit sfaturi conceptuale și a contribuit la discuția, revizuirea și editarea manuscrisului. D.K. a contribuit la conceptul de studiu, discuție și scriere, revizuire și editare a manuscrisului. S.W. și D.K. sunt garanții acestei lucrări și, ca atare, au avut acces deplin la toate datele din studiu și își asumă responsabilitatea pentru integritatea datelor și acuratețea analizei datelor.

Prezentare prealabilă. Părți ale acestui studiu au fost prezentate sub formă de poster la cele 75 de sesiuni științifice ale Asociației Americane de Diabet, Boston, MA, 5-9 iunie 2015.