Împrăștierea luminii este o modalitate importantă de caracterizare a nanocurtorilor coloidali și macromoleculari și ar putea fi utilă în evaluarea proprietăților sistemului de administrare a medicamentelor topice sub formă de particule.

Termeni asociați:

  • Difuzare dinamică a luminii
  • Gene imbricate
  • Citometrie în flux
  • pH
  • Indicele de refracție
  • Foton
  • Fluorescenţă

Descărcați în format PDF

Despre această pagină

Caracterizarea polimerului

2.10.3.5 Pregătirea probelor și refractometre diferențiale

În cazurile de caracterizare a particulelor într-o soluție diluată, concentrația ar trebui să fie cât mai redusă posibil, atâta timp cât intensitatea luminii împrăștiate este suficient de puternică pentru a fi detectată și pentru a urma statistica Gaussiană. Trebuie remarcat faptul că la concentrații foarte scăzute și pentru particule mari sau lanțuri polimerice, fluctuațiile de număr pot deveni apreciabile atunci când numărul total de particule (sau de macromolecule) din volumul de împrăștiere se modifică odată cu timpul de măsurare. Apoi, funcția de corelare a timpului are o componentă de fluctuație a numărului care nu poate fi ignorată. 78

Când trebuie să evaluăm masa particulelor și al doilea coeficient virial și/sau când avem de-a face cu sisteme multicomponente, trebuie să cunoaștem creșterile indicelui de refracție. Refractometre comerciale diferențiale sunt disponibile în acest scop. Trebuie să avem în vedere că creșterea indicelui de refracție depinde de lungimea de undă a luminii, precum și de temperatură, astfel încât lungimea de undă utilizată pentru a determina indicele de refracție ar trebui să fie aceeași cu cea pentru măsurătorile de împrăștiere a luminii. Pentru măsurători de împrăștiere a luminii în condiții speciale, sunt necesare refractometre diferențiale special concepute pentru măsurători în aceleași condiții ca și cele utilizate pentru împrăștierea luminii. 79

Tehnici de extracție și aplicații: biologice/medicale și de mediu/criminalistică

3.07.3.6 Imunotest cu dispersie de lumină

Imagistica optică bazată pe semnale intrinseci

C. Componenta de împrăștiere a luminii

scattering

Semnalul de împrăștiere a luminii introduce o potențială confuzie în studiile intrinseci de cartografiere a semnalului. Difuzarea luminii ambele estompează imaginile și extinde aria aparentă de activitate. Cu toate acestea, în cortex, eroarea estimată datorată împrăștierii luminii este mai mică de 200 μm (Orbach și Cohen, 1983).

Recent, Nomura și colegii săi au introdus un nou protocol pentru cartografierea modificărilor de dispersie a luminii in vivo, fără nicio contribuție din absorbția hemoglobinei (Nomura și colab., 2000). Acest lucru a fost realizat prin transfuzie de schimb cu fluorocarbon (Green Cross, Osaka, Japonia). Fluorocarbonul este sânge artificial cu o capacitate adecvată de transportare a oxigenului pentru a menține viața timp de câteva zile, dar fără absorbție în domeniul vizibil și în infraroșu apropiat. Deși această abordare permite imagistica schimbărilor de dispersie a luminii izolate in vivo, rezultatele folosind acest model ar putea să nu fie extensibile la semnale intrinseci măsurate cu sângele integral intact, deoarece capacitatea de transport a oxigenului și solubilitatea fluorocarbonului sunt semnificativ diferite de cele ale hemoglobinei. Aceste diferențe au ca rezultat o dublare a fluxului sanguin cerebral și creșterea preferențială a fluxului către cortex și cerebel (Lee și colab., 1988). .

În mod similar, semnalul de împrăștiere a luminii a apărut ca un semnal de cartografiere extrem de util în felii (Stepnoski și colab., 1991) și creierul izolat. Semnalele de împrăștiere a luminii obținute în aceste preparate in vitro sunt, într-un fel, mai ușor de interpretat decât semnalele in vivo, deoarece nu sunt suprapuse semnalelor care decurg din modificările legate de hemoglobină. Cu toate acestea, rămâne dificultatea atribuirii unei etiologii specifice a semnalului semnalului de împrăștiere a luminii.

Teoria și metodologia eșantionării

1.18.6.3 Tehnici de împrăștiere

Răspândirea luminii a fost utilizată pentru a studia coloizi în diferite medii acvatice. 46 Razele X și împrăștierea luminii sunt exemple bune de tehnici de împrăștiere utilizate pentru a studia proprietățile fizice ale coloizilor și COM. Ambele metode sunt exemple de împrăștiere a radiației electromagnetice. 2 În timpul acestor tehnici de împrăștiere, o soluție apoasă de coloizi este plasată fie într-un fascicul de lumină, fie într-o rază X și se măsoară cantitatea de lumină care ajunge la un detector. Din aceasta, ecuațiile sunt utilizate pentru a determina diferitele proprietăți ale coloizilor prezenți. 2 În timpul împrăștierii luminii, lungimile de undă utilizate sunt mult mai mari decât dimensiunile particulelor coloidale; prin urmare, se spune că lumina împrăștiată dintr-o particulă este în fază. Când o particulă și sursa de energie sunt în fază, metoda devine mai eficientă și intensitățile împrăștiate sunt mai mari; prin urmare, împrăștierea luminii este în general privită ca o tehnică mai eficientă decât împrăștierea cu raze X. 2 Razele X și împrăștierea luminii pot fi utilizate pentru a măsura o gamă similară de proprietăți coloidale, cum ar fi raza de rotație, raza de rotație a secțiunii transversale, volumul particulelor coloidale, aria secțiunii transversale a particulei, greutatea moleculară pe unitate de lungime și forma particulelor.

Biotermodinamica, partea D

C. Preston Moon, Karen G. Fleming, în Methods in Enzymology, 2011

2.4 Reducerea împrăștierii luminii prin potrivirea indicelui de refracție

Difuzarea luminii de către lipozomi poate fi, de asemenea, redusă prin potrivirea indicelui lor de refracție cu substanțele dizolvate. După cum descriem mai complet mai jos, raportul dintre indicele de refracție al unui strat strat lipidic și indicele de refracție al soluției de fundal este unul dintre factorii care influențează cantitatea de lumină împrăștiată de lipozomi (Matsuzaki și colab., 2000). Dacă indicele de refracție al soluției de fundal este crescut prin adăugarea de substanțe dizolvate, atunci lipozomii vor împrăștia mai puțină lumină. Practic orice substanță dizolvată, inclusiv tampoane, poate crește indicele de refracție al soluției de fundal. Cu toate acestea, unele substanțe dizolvate în concentrații mari ar putea afecta structura bistratelor lipidice sau structura proteinelor de membrană. Prin urmare, substanțele dizolvate cu indici de refracție ridicați împreună cu solubilitatea ridicată ar fi cei mai buni candidați pentru potrivirea indicilor de refracție. Un grup a folosit zaharoza pentru a face lipozomii invizibili pentru spectroscopia liniară dicroică pentru studiul peptidelor care formează porii membranari (Ardhammar și colab., 2002).

Important pentru experimentele de pliere a proteinelor de membrană, denaturanții chimici cei mai frecvent utilizați (uree și guanidină HCl) sunt, de fapt, soluții bune pentru potrivirea indicelui de refracție. În Fig. 6.3 A, arătăm efectele guanidinei HCl asupra împrăștierii luminii la trei concentrații diferite de DLPC unde se poate observa că intensitatea maximă a luminii împrăștiate măsurată ca emisie cu unghi drept în spectrofluorimetrul nostru se descompune odată cu creșterea concentrațiilor de guanidină HCl. La o concentrație de lipide de 400 μM, LUV-urile sunt în esență invizibile în soluții cu mai mult de 3,5 M guanidină. La concentrații mai mari de lipide, este nevoie de mai multă guanidină pentru a face LUV-urile invizibile, deoarece există mai multe LUV-uri care împrăștie lumina. Datele din Fig. 6.3 A sunt complet reversibile și recuperăm aceeași cantitate de împrăștiere a luminii indiferent dacă LUV-urile sunt introduse mai întâi în guanidină concentrată și apoi diluate sau dacă sunt introduse mai întâi în tampon și apoi titrate în guanidină. De asemenea, dacă LUV-urile DLPC sunt preparate prin extrudare în 8,0 M guanidină, ele nu împrăștie lumina până când guanidina nu este diluată.

Figura 6.3. Denaturanții pot reduce împrăștierea luminii de la LUV-uri prin potrivirea indicelui de refracție a straturilor bilidice lipidice. Sunt reprezentate intensitățile de vârf ale dispersiei luminii RGD de către LUV-urile DLPC la o lungime de undă de excitație de 295 nm. Tamponul de fundal pentru toate probele a fost 2 mM EDTA și 100 mM citrat, pH 3,8. (A) Efectul numărului de LUV asupra împrăștierii lor de lumină la diferite concentrații de solut guanidină HCl. (B) La fel ca în (A) unde reprezentă liniile punctate se potrivește cu ecuația. (6.9), iar liniile solide reprezintă potriviri pentru ecuație. (6.11) .

Abordări moderne în descoperirea drogurilor

Christian Bergsdorf, S. Kirk Wright, în Methods in Enzymology, 2018

2.2.1 Răspândirea luminii statice diferențiale

DSLS este un sistem de detectare optică care poate fi utilizat pentru a monitoriza denaturarea proteinelor. Denaturarea unei proteine ​​este monitorizată printr-o creștere a intensității luminii împrăștiate datorită agregării induse într-un gradient de temperatură, de obicei de la 25 la 95 ° C. Temperatura de agregare (Tagg) este determinată prin reprezentarea intensității luminii împrăștiate măsurate față de temperatură. Analog cu Tm în DSF, Tagg al unei proteine ​​țintă poate crește odată cu interacțiunea ligandului. Presupunerea din spatele acestei măsurări este că denaturarea proteinelor are loc ca un proces în trei stări care combină un proces reversibil cu unul ireversibil. Acest proces poate fi descris după cum urmează:

Aplicații farmaceutice și biomedicale ale polimerilor

Pran Kishore Deb,. Rakesh K. Tekade, în Fundamentele de bază ale livrării medicamentelor, 2019

6.5.2 Metoda de împrăștiere a luminii

Metoda de împrăștiere a luminii a fost utilizată pe scară largă pentru caracterizarea lanțurilor polimerice într-o soluție. Prin această metodă, este posibil să se determine raza de girație (Rg), greutatea medie a polimerului MW și al doilea coeficient virial (A2). Forma moleculei de polimer (de exemplu, înfășurată aleatoriu, sferică sau asemănătoare cu tija) poate fi, de asemenea, investigată (Hina și colab., 2014). Există două metode diferite de împrăștiere a luminii. Prima metodă este împrăștierea clasică a luminii în care este asigurată o măsurare directă a masei moleculare. Această metodă este foarte utilă pentru a determina starea nativă a polimerului dacă este un monomer sau oligomer și pentru a măsura masele de agregate. A doua metodă este împrăștierea dinamică a luminii, care este, de asemenea, cunoscută sub numele de spectroscopie de corelație a fotonilor sau împrăștiere cvasi-elastică a luminii (QELS). Această metodă utilizează lumina împrăștiată pentru a măsura viteza de difuzie a particulelor de polimer. Mărimea distribuției eșantionului este derivată de datele de mișcare care au fost procesate convențional, iar dimensiunea este dată de raza hidrodinamică sau raza Stokes a particulei de polimer (Øgendal, 2016; Schärtl, 2007).

Principiile și aplicațiile citometriei în flux

8.1.1 Difuzia luminii și fluorescența

Difuzarea luminii este devierea luminii incidente de către o particulă. Acest fenomen depinde de proprietățile fizice ale particulei, cum ar fi dimensiunea și complexitatea acesteia. Citometria de flux are două detectoare diferite de împrăștiere a luminii, dispersia directă (FSC) și dispersia laterală (SSC). În Fig. 8.1 putem vedea o schemă a celulei de flux, reprezentată de sistemul fluidic care aliniază celulele pentru a trece printr-un fascicul de lumină. Celula împrăștie lumina în unghiuri diferite sau chiar poate fi excitată pentru a emite fluorescență. Lumina este colectată de fotodetectori.

Figura 8.1. Prezentare generală a citometriei în flux. Celulele trec printr-un fascicul de lumină focalizat. Lumina împrăștiată este colectată de detectoarele FSC și SSC. Fluorescența este colectată de detectoarele FL1 și FL2.

Detectorul FSC măsoară intensitatea luminii în direcția căii optice a sursei incidente în direcția eșantionului. Intensitatea măsurată este proporțională cu diametrul celulei, în funcție de difracția acesteia. Parametrul FSC permite compararea dimensiunilor celulei. Un punct critic care poate compromite analiza parametrului FSC este raportul dintre dimensiunea celulei și lungimea de undă a sursei de lumină. Particulele cu un diametru mai mic decât lungimea de undă pot prezenta un comportament modificat, cauzând inconsistență în citirea FSC.

Detectorul SSC măsoară lumina refractată sau reflectată, legată de granularitatea și complexitatea celulei. Semnalul SSC este de intensitate mai mică decât semnalul FSC, necesitând utilizarea unui fotomultiplicator pentru amplificarea acestuia.

În acest fel, semnalele FSC și SSC permit caracterizarea morfologică a diferitelor subpopulații celulare dintr-un eșantion.

Având în vedere fluorescența eșantionului, este posibil să se detecteze emisiile la diferite lungimi de undă, permițând o analiză multiplă, folosind un set de lasere și filtre pentru excitație și detectare la diferite lungimi de undă.

Imagistica și analiza spectroscopică a celulelor vii

Iestyn Pope,. Peter Watson, în Methods in Enzymology, 2012

2.1 Răspândirea Raman

Introducere în tehnologia produselor imunologice în testarea clinică de diagnostic

Nefelometrie și turbidimetrie

Imunotestele de împrăștiere a luminii se bazează pe reacția dintre antigen și anticorp pentru a produce un agregat sau un aglutinat suficient de mare pentru a împrăștia lumina peste și peste cea împrăștiată de constituenții reacției. Testele de aglutinare timpurie au depins de inspecția vizuală pentru a oferi un rezultat semicantitativ. Instrumentele de turbidimetrie și nefelometrie au fost introduse pentru a măsura gradul de combinație antigen - anticorp. Turbidimetre este măsurarea speciilor de împrăștiere a luminii în soluție prin scăderea intensității fasciculului incident după ce acesta a trecut prin soluție. Se măsoară cu un detector de 180 ° din fasciculul incident. Nefelometrie detectează energia luminii împrăștiate sau reflectate către un detector care nu se află pe calea directă a fasciculului de lumină. Una dintre provocările tehnologice timpurii a fost reducerea luminii rătăcite, iar nefelometrele au fost proiectate pentru a măsura la unghiuri cuprinse între 90 ° și 180 ° pentru a profita de intensitatea sporită a dispersiei înainte cauzată de împrăștierea luminii din particule mai mari. Cu filtre avansate pentru a suprima lumina nedeflectată de la sursă, lumina împrăștiată poate fi detectată la mai puțin de 30 ° din calea luminii directe, maximizând sensibilitatea.

Utilizarea turbidimetriei și a nefelometriei este anterioară testului radioimunologic (RIA) cu mulți ani (a se vedea Fundațiile I mmunochimiei). Instrumentele pentru măsurarea turbidimetriei au fost introduse în 1938, iar introducerea nefelometriei a fost raportată pentru prima dată în 1951. Imunoprecipitarea a fost adaptată pentru a rula pe autoanalizatorul cu flux continuu Technicon în 1972 pentru a cuantifica imunoglobulinele. Technicon a fabricat, de asemenea, analizoare de imunoanaliză nefelometrică de bancă. Primele nefelometre au folosit filamente ușoare de tungsten, dar au fost introduse lasere începând cu 1974. Produsele principale care utilizează această tehnologie au fost Behringwerke BNA și Hyland Laser Nephelometer. Beckman a introdus sistemul de imunochimie (ICS), folosind inițial o lampă cu cuarț halogen sau xenon ca sursă de lumină, dar introducerea laserelor cu intensitate și coerență ridicată a îmbunătățit semnificativ sensibilitatea și a scăzut timpul necesar măsurătorilor nefelometrice.

Imunoanalizele de împrăștiere a luminii - în special pentru măsurarea proteinelor specifice - sunt încă utilizate în mod obișnuit în mulți analizatori de chimie clinică generală.