Abstract

Neuronii histaminici proveniți din nucleul tubero-mamilar al hipotalamusului posterior proiectează difuz în creier pentru a regla homeostazia energetică (1,2). S-a demonstrat că histamina neuronală suprimă consumul de alimente prin receptorii histaminei H1 (H1-Rs) din hipotalamusul ventromedial (VMH) și din nucleul paraventricular (PVN) (3,4). De asemenea, modifică termoreglarea (5). Deficiența energetică din creier, adică glucoprivarea neuronală, activează neuronii histaminei din hipotalamus (6) și mărește glicogenoliza în creier (7). Neuronii histaminici stimulează sistemul nervos simpatic pentru a crește lipoliza în țesutul adipos (8.9).

întreruperea

Leptina, un produs cu gene ob (10), s-a demonstrat recent că promovează fluctuația histaminei prin afectarea procesului post-transcripțional de formare a histidinei decarboxilazei sau eliberarea histaminei în sine (11). În plus, concentrația sau rata de rotație a histaminei hipotalamice a fost redusă la șoarecii ob/ob cu deficit de leptină și la șoarecii db/db mutați în receptorul leptinei, dar a fost crescută la animalele obeze induse de dietă (11). Leptina reglează eficiența metabolică și exercită acțiune anorectică (12,13,14) prin receptorii săi hipotalamici de formă lungă, în VMH, hipotalamusul dorsomedial, nucleul arcuat și nucleul premamilar ventral (15,16,17). VMH, PVN și nucleul arcuat sunt cunoscute sub numele de centre de control al poftei de mâncare și primesc proiecții de la neuronii histaminici (3,4,18,19).

Din punctul de vedere al metabolismului energetic, familia de proteine ​​de decuplare (UCP) joacă un rol esențial în homeostazia energetică (20,21,22). Expresia genică a acestor proteine ​​este reglementată de factori umorali și neuronali (23,24,25,26,27,28). Administrarea centrală a expresiei genei reglată în sus a leptinei din familia UCP (28). Aceste descoperiri sugerează că transducția semnalului între neuronii de leptină și histamină poate fi implicată în reglarea centrală a familiei UCP.

Un corp în creștere de informații care avansează rapid cu privire la rolurile funcționale ale neuronilor histaminici împreună cu căile lor centrale de semnalizare este în concordanță cu conceptul că neuronii histaminici hipotalamici sunt foarte susceptibili de a contribui la reglarea centrală a echilibrului energetic guvernat de leptină. Pentru a aborda această problemă, am emis ipoteza că eliminarea H1-R (H1KO) ar putea perturba mesajele de semnalizare a leptinei, de la expresia neuropeptidelor hipotalamice la cea a familiei UCP și a genei ob. Un obiectiv al prezentului studiu a fost de a examina rolurile esențiale ale H1-R în reglarea aportului alimentar și a exprimării UCP.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Animale. Șoarecii C57Bl/6J masculi maturi (Seac Yoshitomi, Fukuoka, Japonia) și șoarecii H1KO (Universitatea Kyushu, Fukuoka, Japonia), la vârsta de 0-30 săptămâni, erau cazați într-o cameră iluminată zilnic de la 0700 la 1900 (a 12: 12 h ciclu lumină-întuneric) la o temperatură la 21 ± 1 ° C și umiditate la 55 ± 5%. Șoarecilor li s-a permis accesul la alimente standard sub formă de pulbere de șoarece (CLEA Japonia, Tokyo, Japonia) și apă de la robinet ad libitum. Consumul zilnic de alimente și greutatea corporală a șoarecilor au fost măsurate la ora 0800. Măsurarea a fost monitorizată cu cel puțin 7 zile înainte de fiecare experiment. Animalele utilizate au fost tratate în conformitate cu Orientările Universității Medicale Oita pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator.

Producția și furnizarea de șoareci H1KO. Șoarecii H1KO masculi și femele au fost menținuți pentru încrucișare la Institutul Medical de Bioreglare (Universitatea Kyushu). Metodele utilizate pentru producerea acestor șoareci sunt raportate în detaliu în altă parte (29). Backcrossing-ul șoarecilor homozigoti la tulpina C57Bl/6J timp de cinci generații a dus la șoarecii N4 congeniali incipienți din trei genotipuri (H1R -/-, H1R +/-, H1R +/+) utilizate aici. Toate genotipurile au fost confirmate folosind Southern blot. În total, 178 descendenți de bărbați și femele heterozigoți au fost analizați pentru genotip la vârsta de 28 de zile. S-a observat următoarea distribuție: +/+, n = 42; +/-, n = 90; -/-, n = 46. Aceste rezultate corespund îndeaproape raportului așteptat de 1: 2: 1, indicând faptul că deficiența de H1-R nu afectează negativ viabilitatea pre- sau post-natală.

Măsurarea consumului de alimente și curba de creștere. Rata de creștere a șoarecilor masculi H1KO și de tip sălbatic (WT) (6 șoareci/grup) a fost monitorizată de la înțărcare la vârsta de 1 săptămână până la o perioadă de 30 de săptămâni. Aportul zilnic al acestora de peste 24 de ore a fost măsurat la vârsta de 12 și 30 de săptămâni. Acești șoareci au fost adăpostiți singuri pe parcursul perioadei de monitorizare de 30 de săptămâni în condițiile ambientale aclimatizate descrise mai sus.

Sarcina de șoareci cu dietă bogată sau cu conținut scăzut de grăsimi. Potrivite pentru greutatea corporală la vârsta de 8 săptămâni, șoarecii H1KO și WT au fost împărțiți în grupuri cu dietă bogată în grăsimi (HFD) și dietă cu conținut scăzut de grăsimi (LFD) (n = 6 pentru fiecare subgrup). HFD a constat din 45% grăsimi, 35% carbohidrați și 20% proteine, cu o densitate de energie de 4,73 kcal/g. LFD a constat din 10% grăsimi, 70% carbohidrați și 20% proteine, cu o densitate de energie de 3,85 kcal/g. Greutatea corporală în fiecare subgrup a fost măsurată săptămânal cu vârsta cuprinsă între 8 și 16 săptămâni. Greutatea totală a grăsimii, procentul de grăsime și expresia genei ob în WAT au fost măsurate la vârsta de 16 săptămâni.

Implantarea cronică cu o canulă în ventriculul lateral. Șoarecii adulți masculi cu vârsta cuprinsă între 12-14 săptămâni au fost anesteziați cu injecție intraperitoneală de nembutal (1 mg/kg). Șoarecii au fost așezați într-un dispozitiv stereotactic pentru a implanta cronic o canulă din oțel inoxidabil cu calibru 29 în cerebroventricul lateral stâng (0,5 mm posterior, 1,0 mm lateral și 2,0 mm ventral către bregma). După operație, în fiecare canulă a fost introdus un dop de sârmă cu ecartament 30 pentru a preveni coagularea sângelui. Toți șoarecii au primit o săptămână de recuperare postoperatorie înainte de a fi tratați zilnic pentru a-și echilibra nivelurile de excitare. După încetarea tuturor experimentelor, plasarea canulei a fost verificată la fiecare șoarece infuzat cu colorantul verde Indiana.

Proceduri de tratament cu leptină. Leptina recombinantă murină (Amgen, Thousand Oaks, CA) a fost dizolvată în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS). Pentru a dobândi o relație doză-răspuns, leptina a fost perfuzată în cerebroventricul lateral stâng la doze de 0,1, 0,25 și 0,5 μg/șoarece pe zi, timp de 3 zile de succes. Procedurile de perfuzie cu PBS în grupul de control au fost aceleași cu cele din grupul de leptină, acolo unde este cazul. Volumul perfuziei intracerebroventriculare de leptină și PBS a fost de 0,1 μl. Potrivite în funcție de greutatea corporală bazală la vârsta de 12-14 săptămâni, șoarecii H1KO și WT au fost împărțiți în grupurile de leptină și martor (n = 6 pentru fiecare). În ziua precedentă și timp de 3 zile după tratament, aportul de alimente a fost măsurat zilnic în fiecare subgrup (n = 6 pentru fiecare subgrup). Pentru a preveni o diferență în consumul de alimente între grupurile de leptină și martor, șoarecii martori din fiecare studiu de perfuzie cu leptină au fost hrăniți zilnic cu șoareci corespunzători tratați cu leptină. După evaluarea hrănirii, țesuturile adipoase au fost îndepărtate chirurgical conform procedurilor menționate mai sus și analizate pentru acumularea de grăsime și expresia UCP.

Extracția ARN și analiza Northern blot. ARN celular total a fost preparat din diferite țesuturi de șoarece cu utilizarea Isogen (gena Nippon, Toyama, Japonia) conform protocolului producătorului. ARN-ul total (20 μg) a fost electroforizat pe gel de 1,2% formaldehidă-agaroză, iar ARN-ul separat a fost transferat pe o membrană Biodyne B (Pall Canada, Toronto, ON, Canada) în 20 × clorură de sodiu-citrat de sodiu prin ștergere capilară și imobilizat prin expunerea la lumina ultravioletă (0,80 J). Prehibridarea și hibridizarea au fost efectuate conform protocolului producătorului. Membranele au fost spălate în condiții de severitate ridicată. După spălarea membranelor, semnalele de hibridizare au fost analizate cu analizorul de imagine BIO BAS 2000 (Instituția de film Fuji, Tokyo, Japonia). Membranele au fost dezbrăcate prin expunere la fierbere 0,1% SDS și rehibridizate cu un ARN ribozomal care a fost utilizat pentru a cuantifica cantitățile de specii de ARN pe pete.

analize statistice. Toate datele au fost exprimate ca medie ± SE. Analiza statistică a diferenței a fost evaluată prin Sheffe sau analiza repetată a varianței în două direcții (Fig. 1,2,3,4), iar testul t nepereche pentru comparații multiple a fost utilizat acolo unde este cazul (Tabelul 1, Fig. 1). Pentru a evalua curba doză-răspuns în ceea ce privește efectele perfuziei intracerebroventriculare de leptină asupra consumului de alimente, s-a efectuat coeficientul de corelație Spearman în funcție de rang.