Abstract

Introducere

Având în vedere variabilitatea genetică în cadrul populației umane, stilurile de viață divergente, dietele foarte variabile și auto-raportarea inexactă, legăturile neechivoce între dieta și predispoziția bolii au fost dificil de stabilit. Folatul, o vitamină B, este un factor important pentru o serie de căi metabolice, inclusiv metilarea ADN-ului și biosinteza nucleotidelor.1 În timp ce deficitul alimentar de folat este o problemă în mare parte din lumea în curs de dezvoltare, suplimentarea obligatorie cu folat a produselor din cereale din SUA și Canada, de la sfârșitul anilor 1990, a eliminat aproape deficitul de folat din aceste țări și a redus rata defectelor tubului neural.41

insuficiența

Folatul este important pentru sinteza purinelor și timidilatului, care sunt necesare pentru trifosfatul de adenozină mitocondrială și citosolică (ATP), trifosfatul de nucleotide totale (NTP) și deoxi-NTP (dNTP). cale donator de metil, fiind esențială pentru producerea de S-adenosilmetionină (SAM), care este esențială pentru metilarea ADN-ului, glutationului și a altor macromolecule. Important, în timp ce folii naturali din alimente sunt în principal tetrahidrofolați (THF), acidul folic (forma sintetică oxidată a folatului) este forma utilizată în principal pentru suplimentare, datorită sintezei sale economice și a bunei biodisponibilități.

Aportul ridicat de acid folic este obișnuit în societatea actuală, având în vedere atât suplimentarea de cereale, cât și consumul obișnuit de suplimente de vitamine suplimentare, băuturi energizante și cereale pentru micul dejun cu acid folic adăugat.32 Într-adevăr, multe cereale pentru micul dejun sunt fortificate la 160–175%. peste nivelurile raportate, 54 și adesea consumate cu mult peste dimensiunile de servire sugerate.6 În timp ce alocația dietetică recomandată (DZR) pentru folat este de 400 μg/zi, suplimentarea cu acid folic peste limita recomandată de 1000 μg/zi nu este neobișnuită pentru femei Doze zilnice chiar mai mari, de până la 5 mg, pot fi recomandate femeilor însărcinate cu anumite condiții prealabile, cum ar fi obezitatea, diabetul, starea MTHFR sau antecedente de sarcini asociate cu defecte ale tubului neural. 98 Având în vedere că folatul suplimentat este în principal sub formă de acid folic, care în mod normal nu este prezent in vivo și că acidul folic s-a dovedit că inhibă cel puțin o enzimă metabolică cheie, 10 este imperativ să obținem o u completă Înțelegerea modului în care această suplimentare afectează metabolismul celular.

Având în vedere că atât folatul dietetic scăzut cât și cel bogat au fost asociate cu diferite boli, în studiul de față am încercat să determinăm modul în care modulul nivelurilor de folat dietetic are impact asupra proceselor metabolice, de dezvoltare și fiziologice în celulele progenitoare hematopoietice. În mod surprinzător, am constatat că atât nivelurile insuficiente, cât și excesive de folat alimentar au compromis în mod similar metabolismul nucleotidic, ducând la defecte funcționale ale celulelor hematopoietice.

Methdos

Supliment de șoareci și folat

Șoarecii au fost hrăniți cu deficiențe (FD; 0,1 mg/kg acid folic), martor (CD; 2 mg/kg acid folic) sau diete supra-folate (SD; 10 mg/kg acid folic). 2 mg/kg acid folic respectă recomandările Institutului American de Nutriție pentru Rozătoare.21 Chow a fost achiziționat de la Research Diets (AIN-76A, cu excepția faptului că nivelurile de acid folic au fost variate) și a fost sterilizat prin iradiere. Toți chow-urile au fost suplimentate cu antibiotic succinilsulfathiazol pentru a preveni producția de folat din bacteriile intestinale.

Analiza spectrometriei de masă pentru metabolomica organelor

Progenitorii celulelor B ale măduvei osoase (BM) au fost izolați prin sortare celulară activată magnetică anti-B220 (Miltenyi Biotec) și prelucrați pentru analiza cromatografiei lichide ultra-performante - spectrometrie de masă (UHPLC-MS), așa cum este descris în Metodele suplimentare online.

Analiză metabolomică de rezonanță magnetică nucleară 1H-cantitativă nețeleasă

S-au extras progenitori izolați ai celulelor B de la animale în grup și s-au efectuat analize de rezonanță magnetică nucleară (RMN) pe un spectrometru Bruker de 500 MHz, așa cum este descris în Metode suplimentare online.

Transplanturi de măduvă osoasă

Pentru testele de transplant BM concurențiale prezentate în Figura 6, BM donator întreg de la șoareci pe diferite niveluri de folat dietetic (proteină fluorescentă verde (GFP) -) a fost amestecat la un raport de 3: 1 cu concurent BM (GFP +) de la șoareci care exprimă GFP alimentat cu diete normale de folat. Pentru testele de transplant BM concurențiale prezentate în Figura 6, BM donator întreg de la șoareci pe diferite niveluri de folat din dietă a fost amestecat la un raport de 3: 1 cu proteina fluorescentă verde (GFP) care exprimă concurentul BM de la șoareci alimentați cu diete normale de folat.

Analiza citometrică de flux și hemoleucograma completă

Suspensiile monocelulare au fost placate în plăci cu fund rotund cu 96 de godeuri și spălate în tampon de sortare a celulelor activate cu fluorescență (FACS) [3% ser fetal bovin (FBS) + soluție salină 1X fosfat tamponat (PBS) + acid etilendiamină tetraacetic 2mM (EDTA) ); v/v)]. După spălare, celulele au fost colorate la suprafață timp de 1 oră pe gheață în 50 μl de soluție de anticorp și analizate prin citometrie în flux pentru a identifica populațiile hematopoietice de interes. Anticorpii utilizați sunt enumerați în Metodele suplimentare online.

Numărul complet de sânge

Sângele periferic a fost colectat din vena laterală a cozii în tuburi de microfugă heparinizate la momentele indicate. Hemogramele complete au fost efectuate pe un Cell-Dyn 1700 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, SUA).

Statistici

Au fost utilizate teste t nepereche, riscurile proporționale Cox și ANOVA unidirecțională pentru a analiza experimentele, cu semnificația indicată de * P

Figura 1. Șoarecii cu folat dietetic scăzut și bogat prezintă un număr redus de leucocite periferice. (A) Șoarecii BALB/c au fost hrăniți cu dietă martor (CD), cu deficit de folat (FD) și supra-folat (SD) timp de 4 luni, iar serul a fost colectat și analizat pentru prezența acidului folic utilizând un kit de testare microbiologică a acidului folic . Valorile reprezintă media ± SEM a (6 eșantioane totale). (B) Sunt prezentate greutățile șoarecilor BALB/c menținuți pe CD, FD și SD timp de șase luni. Greutățile reprezintă media ± SEM a 2 seturi independente de șoareci (6 eșantioane totale). (C și D) S-au efectuat hemoleucogramele complete pe sângele periferic colectat de la șoareci BALB/c păstrați pe diete CD, FD și SD folat timp de 2, 4 și 6 luni. Valorile reprezintă media ± SEM de la 5-10 șoareci/dietă la diferitele momente de timp. Toate analizele statistice au fost efectuate folosind testul t Student în raport cu CD pentru fiecare experiment. Testul t al studentului a fost utilizat în (A) și (B) comparând atât dietele FD, cât și dietele SD cu CD. În (C) și (D), analizele statistice au fost efectuate folosind un test ANOVA unidirecțional, urmat de post-testul lui Tukey. * P

Având în vedere importanța folatului în producția de nucleotide și ATP, s-au efectuat numărări complete de celule sanguine pentru a determina dacă modificarea nivelurilor de folat din dietă a afectat populațiile circulante de celule sanguine. Numărul de leucocite a fost în mod constant redus la șoareci, atât pe dietele FD, cât și pe cele SD, ceea ce a fost evident cu 4-6 luni pe dietele modificate (Figura 1C). Până la 6 luni pentru aceste diete, reducerea numărului de limfocite periferice a fost, de asemenea, evidentă (Figura 1D). Reprezentarea neutrofilelor și a trombocitelor circulante nu a fost modificată semnificativ prin modularea nivelurilor de folat din dietă timp de până la 6 luni (Figura suplimentară online S1A-S1C); cu toate acestea, hemoglobina și celulele roșii din sânge au fost reduse semnificativ cu dietele FD în unele experimente, dar nu și în altele (Figura suplimentară online S1D). Important, șoarecii menținuți pe dietele FD, SD și CD timp de până la un an nu s-au putut distinge prin caracteristici observabile, inclusiv diferențe în greutate (Figura 1B și Figura suplimentară online S1E), activitate sau supraviețuire (datele nu sunt prezentate). Luate împreună, aceste observații arată că șoarecii din dietele FD și SD au menținut fenotipuri fizice normale, dar au prezentat niveluri circulante reduse de leucocite și limfocite.

Dietele de control, cu deficit de folat și supra-folat modifică homeostazia celulară în moduri distincte

Figura 2. Nivelurile de folat atât deficitare, cât și supra dietetice modifică metabolismul în celulele B-progenitoare. Șoarecii (A-H) BALB/c au fost hrăniți cu control (CD), cu deficit de folat (FD) și cu supra-folat (SD) timp de 4 luni, iar celulele progenitoare B au fost izolate folosind selecția B220 + MACS. Analiza RMN a fost efectuată pe aceste celule pentru a determina modificările metabolice induse de dietă. Valorile reprezintă media ± SEM din 2 experimente independente (5 șoareci grupați/grup/experiment), care au exclus analiza statistică datorită numărului de replici tehnice (n = 2).

Figura 4. Dietele cu deficit de folat și supra-folat compromit metabolismul purinic al nucleotidelor. Șoarecii (A și B) BALB/c au fost hrăniți cu dietă martor (CD), cu deficit de folat (FD) și supra-folat (SD) timp de 4 luni, așa cum este descris în Figura 3, și metaboliți specifici în calea de sinteză a nucleotidelor purinice care au fost modificate de modificările nivelurilor de folat din dietă sunt reprezentate grafic (datele prezentate în tabelul suplimentar online S2). Valorile reprezintă media ± SEM a 5 șoareci/dietă din 2 experimente independente cu grupuri de 2 și 3 șoareci. Fiecare metabolit a fost analizat utilizând testul t Student cu valorile CD stabilite ca control. * P

Deoarece atât aportul ridicat, cât și cel scăzut de folat au ca rezultat un fenotip similar, presupunem că excesul de folat poate exercita activitate inhibitorie negativă asupra enzimelor care limitează rata metabolismului folatului, în special dihidrofolat reductaza (DHFR). Pentru a testa această ipoteză, am întrebat dacă tratamentul șoarecilor timp de 5 zile consecutive cu inhibitorul DHFR metotrexat (MTX), care este utilizat în mod obișnuit ca agent chimioterapeutic, ar fenocopia defectelor metabolice ale purinei observate la șoarecii FD și SD în celula progenitoare B compartiment. Tratamentul șoarecilor Balb/c de tip sălbatic (menținut pe șoricel de șoarece standard cu 2 mg/kg acid folic) cu MTX a condus la modele de metabolizare a nucleotidelor afectate în celulele progenitoare B, care, în unele cazuri, au reflectat cele observate pentru progenitori de la șoareci pe dietele FD și SD. În mod surprinzător, impactul tratamentului MTX asupra acestor metaboliți a fost mai mic decât pentru dietele modificate (Figura 5A și Figura suplimentară online S6; pentru rezultate complete a se vedea tabelul suplimentar online S4). De exemplu, scăderile GMP și AMP observate la progenitorii de celule B de la șoareci din dietele FD și SD au fost recapitulate în progenitorii de celule B izolați de la șoarecii tratați cu MTX (Figura 5B).

Figura 5. Metotrexatul reduce sinteza purinei în celulele B-progenitoare. Șoarecii BALB/c au fost tratați timp de 5 zile consecutive cu vehicul (1X PBS) sau metotrexat (MTX; 10 mg/kg) injectat intraperitoneal. (A și B) În ziua următoare ultimei injecții, celulele progenitoare B au fost izolate prin selecții MAC (B220 +) și UHPLC-MS a fost utilizat pentru a determina modificările metabolice ale căii de sinteză a nucleotidelor purinice care au rezultat în urma tratamentului cu MTX. Valorile reprezintă media ± SEM a 4 șoareci/grup de tratament. Testul t Student a fost utilizat pentru a compara modificările metabolice induse la progenitori B izolați de la șoareci tratați cu PBS și MTX. * P

Funcția celulelor progenitoare B este afectată la șoarecii hrăniți cu deficit de folat și în dietele supra-folat

Am determinat efectele acestor diete asupra hematopoiezei la șoareci. Numărul de celule stem și progenitoare hematopoietice timpurii (HSPC) și celule progenitoare mieloide din tibii și femuri nu a diferit pentru șoarecii din dietele CD, FD și SD (Figura suplimentară online S7). Având în vedere că dietele FD și SD au condus la o reducere a numărului de limfocite circulante și la metabolizarea redusă în celulele progenitoare B, am stabilit apoi dacă aceste diete au modificat replicarea ADN-ului în progenitorii B folosind EdU (5-etinil 2′-deoxiuridină) teste de încorporare (Figura 6A). În timp ce procentul de celule progenitoare B în faza S nu sa modificat ca urmare a modulării nivelurilor de folat din dietă (Figura 6B), dietele FD și SD au redus semnificativ rata de progresie a fazei S în celulele pro-B (în special în cazul deficitului de folat; Figura 6C) și a compromis eficiența încorporării nucleotidelor (Figura 6D). Mai mult, am observat că dietele FD și SD au promovat deteriorarea persistentă a ADN-ului în celulele progenitoare B (Figura 6E).

Atât folatul dietetic scăzut, cât și cel bogat afectează reconstituirea hematopoietică după iradiere

Având în vedere aceste observații, am întrebat dacă dietele modificate de folat ar avea impact asupra supraviețuirii după iradiere la șoareci. Șoarecii menținuți pe dietele CD, FD și SD timp de 4 luni au fost iradiați subletal (5 Gy) și monitorizați pentru supraviețuire după iradiere. În mod surprinzător, toți șoarecii hrăniți cu niveluri scăzute și ridicate de folat din dietă au cedat complicațiilor induse de iradiere în decurs de două săptămâni după iradiere și au necesitat sacrificii, în timp ce doar un șoarece CD a fost îndepărtat din studiu din cauza semnelor de morbiditate (Figura 7E). Mortalitatea crescută pentru șoareci din dietele FD și SD post-iradiere probabil, sau cel puțin parțial, ar putea rezulta din capacitatea redusă de a restabili hematopoieza după iradiere. Cu toate acestea, din moment ce mecanismul morții nu a fost determinat, impactul folatului alimentar modificat asupra altor organe (de exemplu, intestinele) ar putea contribui la creșterea sensibilității la radiații.

Discuţie

Datele prezentate aici susțin un model prin care afectarea metabolismului dependent de folat datorită dietelor, atât cu suplimente dietetice ridicate, cât și scăzute, duce la defecte hematopoietice (Figura 7F). După cum sa analizat anterior, 24282, în timp ce suplimentarea cu acid folic sa dovedit a fi benefică în reducerea defectelor tubului neural la nou-născuți, suplimentarea cu acid folic poate fi, de asemenea, asociată cu numeroase probleme de sănătate la om. Acestea includ tulburări respiratorii, cancere, tulburări ale spectrului autist și scleroză multiplă (deși relațiile de cauză și efect nu au fost stabilite, iar unele studii nu reușesc să găsească astfel de asocieri). O serie dintre aceste asociații au fost testate și confirmate cu modele de rozătoare. Deficitul alimentar în folati este, de asemenea, legat de o serie de tulburări, inclusiv cancer și defecte ale tubului neural. Cu toate acestea, înțelegerea noastră asupra modului în care atât folatul insuficient, cât și cel în exces ar putea contribui la reducerea sănătății umane este limitată.

Datele prezentate aici demonstrează că atât nivelurile scăzute, cât și cele ridicate ale folatului din dietă compromit metabolismul în mai multe organe, cu defecte semnificative care se manifestă în compartimentul progenitor B. Deși folatul este necesar în mai multe căi biosintetice (inclusiv pentru nucleotide, glutation, SAM și aminoacizi), am observat în primul rând deficiențe în căile de sinteză a nucleotidelor pentru progenitori B izolați de la șoareci alimentați cu diete FD și SD, așa cum s-a demonstrat folosind atât RMN, cât și UHPLC -spectrometrie de masa. Impactul dietelor FD și SD asupra sintezei nucleotidice reduse în celulele progenitoare B a contribuit probabil la defectele proliferative ale fazei S observate utilizând analiza EdU.

Se estimează că 200 μg/zi copleșesc capacitatea unei persoane de a converti acidul folic în THF, ducând la acid folic nemetabolizat în circulație.266 În special, într-un studiu al femeilor aflate în postmenopauză din SUA, acidul folic circulant a fost găsit la 78% dintre participanți, 22 și atât fortificarea obligatorie, cât și suplimentarea suplimentară s-au dovedit a avea niveluri crescute de acid folic circulant în cohorta Framingham Offspring. acid (spre deosebire de folii reduși); 2928, totuși, este necesară o experimentare suplimentară pentru a testa această ipoteză. Împreună cu aceste studii anterioare, rezultatele prezentate aici sugerează că studiile care examinează impactul folatului dietetic asupra riscului de boală trebuie să ia în considerare sursa și tipul de folat.

Am observat că atât deficiența de folat, cât și supra-nivelurile de folat din dietă duc la reducerea potențialului de reconstituire hematopoietică în experimentele competitive de transplant de măduvă osoasă (BMT) și la creșterea morții după iradiere, în concordanță cu defectele observate ale ciclului celular la progenitorii hematopoietici. Studiile noastre de BMT ar putea indica faptul că defectele de fitness aparente la progenitorii hematopoietici sunt ereditare somatic, prin faptul că se manifestă la șoarecii primitori care sunt menținuți pe diete normale. Cu toate acestea, având în vedere că progenitorii hematopoietici la șoarecii FD și SD par a fi deficienți în capacitatea lor de a reconstitui hematopoieza după iradiere, concurența redusă la șoarecii destinatari ar putea fi parțial legată de un eșec imediat în HSPC de a reconstitui gazda, independent de impactul dietele modificate privind metilarea ADN-ului.

Asocierea paradoxală a dietelor atât scăzute, cât și bogate în folate cu cancer crescut a fost atribuită diferitelor efecte ale folatului asupra inițierii cancerului și asupra creșterii tumorilor preexistente.32 Se consideră că insuficiența folatului crește inițierea cancerului prin creșterea încorporării incorecte a dUTP în ADN., ducând la mutații oncogene. Pentru aceștia din urmă, folatul excesiv se crede că alimentează creșterea tumorilor preexistente. Cu toate acestea, arătăm că atât acidul folic insuficient cât și excesiv sunt asociați cu sinteza ADN-ului afectat. Datele noastre sugerează că efectele comune ale folatului insuficient sau suplimentat excesiv asupra bolii ar putea avea o cauză comună - afectări ale metabolismului dependent de folat. Deși poate părea contraintuitiv faptul că afectarea căilor esențiale pentru proliferarea celulară (cum ar fi sinteza nucleotidelor) ar crește riscul de cancer, aceste afectări ar fi de așteptat să sporească selecția pentru evenimentele oncogene care sunt adaptive în acest context. Deteriorarea ADN-ului ar putea crește frecvența evenimentelor potențial oncogene asupra cărora ar putea acționa o astfel de selecție modificată.

Având în vedere rezultatele noastre că dietele bogate în acid folic pot, în timp, să aibă efecte negative substanțiale asupra metabolismului și stării de sănătate a țesuturilor și celulelor progenitoare, reflectându-le pe cele ale deficitului de folat din dietă, consumul excesiv de acid folic de către mulți americani ar putea avea efecte negative neapreciate asupra sănătății lor. Există indicații clare că suplimentarea obligatorie și voluntară combinată cu acid folic depășește cu mult nivelul vizat, 323162, cu aportul de acid folic pentru majoritatea americanilor cu mult peste ADR. Într-adevăr, 23% din populația SUA (inclusiv 43% dintre copii) a fost considerată bogată în folati serici în studiul NHANES 1999-2000, 23 și dietele multor americani au fost fortificate la> 1000 μg/zi. Cu o fracțiune substanțială a populației din America de Nord cu risc de aport excesiv de folat și o mare parte a restului lumii potențial deficitar în folat, studiile prezentate aici ar trebui să stimuleze cercetarea paralelă la oameni care ar putea avea implicații semnificative de politici publice.

Mulțumiri

De asemenea, dorim să mulțumim doctorilor. Lee Niswander și Juliette Petersen de la Universitatea din Colorado Anschutz Medical Campus pentru analiza atentă a manuscrisului. Mulțumim și doctorilor. Amber Marean și Lee Niswander pentru măsurătorile folatului seric din Figura 1A.