Subiecte

Abstract

Introducere

Organismele vii sunt expuse zilnic substanțelor chimice care afectează endocrin (EDC) care sunt substanțe exogene, în mare parte produse de om, care prezintă activitate hormonală. Prin urmare, sunt capabili să interfereze, mai ales într-un mod negativ, cu căile endocrine normale și sunt astfel numiți estrogeni de mediu sau xenoestrogeni. EDC în special interferează cu procesele reglementate de estrogeni endogeni; EDC pot afecta negativ procesele de reproducere mediate de estrogeni 1 .

Materiale și metode

Animale

Șoarecii C57BL/6 și BALB/c de sex feminin au fost cumpărați de la Janvier Labs (Franța) și au ajuns la unitatea noastră de animale la vârsta de 8 până la 11 săptămâni. Femelele au fost ținute în grupuri de 2-4 animale pe cușcă. Șoarecii au primit apă și mâncare ad libitum și au fost adăpostite cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore (7 am - 7 pm) la 22 ± 2 ° C și o umiditate a aerului de 40-60%. Experimentele au început după 2 săptămâni de aclimatizare.

Proiectare experimentală și colectare de probe

Experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu orientările instituționale la aprobarea ministerială (Landesverwaltungsamt Sachsen Anhalt: 42502-2-1296UniMD, Magdeburg, Germania). Experimentele au fost efectuate de persoane autorizate în conformitate cu Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor în cercetarea și predarea în agricultură. Șoarecii C57BL/6 femele au fost împerecheați cu masculi BALB/c pentru a avea o împerechere alogenă care reflectă situația mamiferelor din natură, inclusiv ființele umane. Ziua de înfundare a fost definită ca ziua de gestație (gd) 0. Din gd1, femeilor li s-au administrat zilnic 50 ug/kg BPA/zi diluate în etanol 0,1% timp de 7 zile prin gavaj oral. Șoarecii martori au primit etanol 0,1% folosind aceeași procedură. Numărul și dimensiunea implantării au fost urmărite pe tot parcursul sarcinii cu ultrasunete de înaltă frecvență. Femelele însărcinate au fost sacrificate pe gd5, gd10 sau gd14. Numărul de implanturi a fost înregistrat pentru animalele sacrificate pe gd5. Pentru acele animale sacrificate pe gd10 și gd14, s-au înregistrat implantarea și avorturile, precum și greutatea făturilor și placentelor. Uterele gravide au fost disecate și o singură implantare de la fiecare femelă la gd10 a fost disecată și fixată într-o soluție de 4% paraformaldehidă (PFA) conținând zaharoză.

Examinarea cu ultrasunete de înaltă frecvență

Pentru a analiza dezvoltarea embrionară și fetală intrauterină, s-au efectuat examinări cu ultrasunete la gd5, 8, 10, 12 și 14 folosind un sistem Vevo 2100 (Fiji Fil Visualsonics Inc). Șoarecii au fost anesteziați cu izofluran într-o cutie etanșă. După ce au intrat în pierderea cunoștinței, șoarecii au fost fixați în poziție dorsală. Am folosit o cremă depilatoare pentru îndepărtarea blănii ventrale. În funcție de gd, dimensiunea implantării (gd5, 8, 10, 12), zona placentară, -grosimea și -diametrul (gd10, 14) sau fluxul de sânge în artera uterină (artera uterină) (UA, gd5, 8, 10, 12, 14) au fost înregistrate. Viteza sistolică de vârf (PSV) și viteza diastolică finală (EDV) au fost definite. În plus, s-au măsurat indicele de rezistență (RI) și indicele de pulsatilitate (PI). Analiza parametrilor înregistrați a fost făcută cu ajutorul software-ului Vevo 2100.

Măsurarea greutății fetale și placentare

Pentru documentarea greutății placentare și fetale la gd14, uterul bicornial al fiecărui șoarece a fost colectat și deschis pe lungime. Fetusii și placentele au fost separate de țesutul decidual înconjurător și de sacul galbenus. Apoi, greutatea fiecărui făt și a fiecărei placente corespunzătoare ar putea fi determinată folosind o cântare (Kern & Sohn GmbH, minim: 0,02 g, sensibilitate: 0,001 g). Restricția de creștere fetală a fost definită ca greutatea sub percentila a 10-a în comparație cu greutățile înregistrate pentru animalele din grupul martor 38 .

Histologie

Implanturile au fost fixate în PFA 4% conținând zaharoză 0,1 M (pH 7,4) timp de 6 ore prin agitare ușoară la temperatura camerei (RT). Înainte de depozitare peste noapte la 4 ° C, acestea au fost transferate în etanol 70%. A doua zi, specimenul de implantare a fost deshidratat prin serii ascendente de etanol și incubat în xilen înainte de încorporarea parafinei. Au fost tăiate 5 lamele subțiri pentru colorarea ulterioară a hematoxilinei și a eozinei (H/E; pentru analiza arterei spirale), colorarea imunofluorescentă pentru actina musculaturii netede (SMA; pentru analiza arterelor spirale) sau colorarea lectinei Dolichus Biflorus Agglutinin (DBA) pentru detectarea uterului Analiza celulei ucigașe naturale (uNK)). Pentru a analiza prezența uMC-urilor, s-a efectuat colorarea cu albastru de toluidină după cum urmează: uterele gestante la gd5 au fost incubate în etanol 96%. Pentru deshidratare, probele au fost păstrate în etanol 100% timp de două ore, înainte de a fi transferate în xilen pentru încă 2 ore și încorporarea ulterioară a parafinei. H/E, IF, lectină DBA și colorare cu albastru de toluidină s-au făcut așa cum s-a descris anterior 39 .

Analiza arterelor spirale uterine (USAs)

Parametrii care definesc remodelarea uSA au fost analizați în lamele colorate cu H/E ale implanturilor încorporate în parafină obținute la gd10. Pentru mai multe detalii despre cum au fost obținute probe pentru localizarea SA, vă rugăm să consultați 40. Prin utilizarea microscopului cu lumină Zeiss, au fost identificate și analizate 3-8 uSAs în decidua basalis a unei implantări pe șoarece. Prin utilizarea funcției de meniu „Contur (spline)” din AxioVision Rel. Programul 4.8, circumferința exterioară și lumenul a 3-8 artere per animal au fost măsurate în mărire de 20 ×. Valorile obținute au fost utilizate pentru calcularea diametrului (diametru = circumferință/π), a raportului perete-lumen (diametru uSA/diametru lumen), precum și grosimea peretelui (diametru uSA - diametru lumen)/2) . Valorile medii ale parametrilor menționați mai sus au fost calculate pentru fiecare animal.

Cuantificarea uMCs și uNKs

CMU au fost cuantificate la gd5 în secțiuni uterine colorate cu albastru de toluidină, în timp ce uNK-urile au fost cuantificate în probe de implantare colorate cu DBA-lectină utilizând un ocular micrometru care a fost introdus într-un microscop cu lumină. Ocularul micrometru a fost poziționat în zece puncte diferite în cadrul probei colorate. Cele 10 × 10 pătrate simple reprezintă 60 × 60 µm la o mărire de 20 ×, astfel ar putea fi examinată o suprafață de 0,36 mm². După calcularea mediei a 10 pătrate individuale și luând în considerare aria măsurată, s-a determinat cantitatea de uMC/uNK pe 1 mm². Lectina DBA și colorarea cu albastru de toluidină au fost efectuate așa cum s-a descris înainte de 39 .

Statistici

Distribuția seturilor de date (normale sau nu normale) a fost evaluată cu testul D’Agostino Pearson-Omnibus înainte de a analiza datele fie cu teste parametrice, fie non-parametrice. În funcție de distribuția lor, datele sunt prezentate ca mijloace ± S.E.M sau mediane. Numărul de șoareci, probe sau experimente efectuate, precum și testul statistic utilizat și conform P valorile sunt indicate în legendele figurii corespunzătoare. GraphPad Prism 5.0 a fost utilizat pentru efectuarea analizelor statistice. Înainte de a analiza datele, am consultat Departamentul de Statistică al Facultății noastre (Institut für Biometrie und Informatik, Medizinische Fakultät, OVGU, Magdeburg) cu privire la testul adecvat pentru fiecare experiment.

Rezultate

Tratamentul cu BPA nu a influențat numărul sau dimensiunile de implantare la gd5

Pentru a înțelege dacă procesul de implantare în sine este afectat de expunerea la BPA, am determinat numărul de implanturi și dimensiunile acestora la gd5 la animalele care au fost tratate cu BPA începând cu gd1. Doza de BPA utilizată pentru gavajul oral a fost de 50 ug/kg BPA/zi; considerată drept doza maximă de siguranță permisă. Mărimea implantării (Fig. 1A, B) a fost comparabilă între animalele tratate cu BPA și controalele lor, așa cum au fost analizate prin ultrasunete de înaltă frecvență, la fel și valorile vitezei sanguine ale UA (PSV, EDV, RI, PI) (Fig. 2A ). Rezultatele noastre nu au sugerat niciun efect negativ al BPA asupra implantării, care merge în mână cu un număr de implantări comparabile după sacrificarea animalelor la gd5 (Fig. S1).

expunerea

Viteze comparabile ale arterei uterine materne (UA) la șoareci martori și tratați cu BPA. Viteza sistolică maximă, viteza diastolică finală, indicele de rezistență și indicele de pulsatilitate al UA de la șoarecii C57BL/6J (n = 5) și C57BL/6J (n = 5) tratați cu BPA la gd5A), gd8 (B), gd10 (C), gd12 (D) și g14 (E). Datele sunt prezentate ca mijloace cu S.E.M. Analiza statistică a fost efectuată folosind Mann-Whitney-U Test. UA, artera uterină; Dumnezeu, ziua de gestație.

Fetusii de la mame tratate cu BPA au manifestat IUGR încă din gd12, după cum s-a documentat prin ultrasunete

Creșterea fetală și a placentei a fost urmată de măsurători cu ultrasunete seriale. Parametrii vitezei sângelui din UA maternă au fost evaluați prin măsurători Doppler. La gd8, zonele de implantare au fost comparabile între animalele tratate cu BPA și animalele de control (Fig. 1A, B) și la fel au fost valorile vitezei sanguine UA (Fig. 2B). Același lucru este valabil și pentru gd10, zi în care nu s-au înregistrat diferențe între grupuri pentru zonele de implantare (Fig. 1A, B) sau parametrii vitezei sângelui UA (Fig. 2C). În consecință, am înregistrat un număr comparabil de implantări, avorturi și rate de avort în toate grupurile atunci când au fost sacrificate la gd10 (Fig. S2A, B). Astfel, BPA aplicat din ziua 1 până în ziua 7 a sarcinii nu pare să influențeze creșterea fetală până la jumătatea sarcinii. Interesant este că analiza dimensiunii implantării în etapele ulterioare a relevat un efect negativ al BPA. Dimensiunea implantului la mamele tratate cu BPA a fost semnificativ redusă (P Figura 3

Parametri placentari comparabili la șoareci de control și tratați cu BPA la gd10 și gd14. Zona placentară (A), grosime placentară (B) și diametrul placentar (C) din descendenții C57BL/6J (n = 5) sau tratat cu BPA C57BL/6Jn = 5) șoareci la gd10 și gd14. Parametrii placentari sunt prezentați ca valori și mijloace individuale. Diferențele statistice au fost determinate folosind nepereche t-Test. Dumnezeu, ziua de gestație.

Feturile și placentele de la mamele tratate cu BPA au fost mai ușoare decât controalele din ziua 14 a sarcinii, confirmând că expunerea la BPA în timpul sarcinii timpurii afectează creșterea fetală

Apoi, greutatea făturilor și a placentelor a fost măsurată după sacrificarea mamelor gravide la gd14. Greutatea fetală la femeile tratate cu BPA a fost semnificativ redusă (P percentila a. Un procent de 26,2 dintre fetuși a fost chiar sub percentila a 5-a (Fig. 4Aii). Ponderile placentare ale conceptelor de la mamele tratate cu BPA au fost reduse semnificativ statistic (P Figura 4

Greutate placentară mai mică și restricție de creștere intrauterină la șoareci tratați cu BPA la gd14. Greutăți fetale (A) și greutăți placentare (B) din descendenții C57BL/6J (n = 5) sau tratat cu BPA C57BL/6Jn = 5) șoareci la gd14. Parametrii fetali sunt prezentați ca valori și mijloace individuale. Diferențele statistice au fost determinate folosind testul t nepereche (*P a percentila (roșu); între percentila a 5-a și a 10-a (roz); sau peste percentila a 10-a (verde). Dumnezeu, ziua de gestație.

Remodelare uSA afectată la animalele tratate cu BPA

Remodelarea uSA este un moment important în sarcină, deoarece condiționează fluxul sanguin de la mamă la făt. În timpul acestui proces, SA-urile se transformă din arterele cu pereți groși în artere cu pereți subțiri și lumeni largi. Transformarea peretelui arterial se datorează pierderii celulelor musculare netede uterine (SM), care este fundamentală pentru a preveni vasoconstricția SA care ar putea întrerupe fluxul sanguin către placentă. Se crede că IUGR este o consecință a remodelării SUA afectate 41. Aici, am înregistrat parametrii uSA în lamele colorate cu H/E obținute din țesutul uterin al șoarecilor tratați cu BPA și șoareci martori. Măsurătorile noastre au relevat o creștere semnificativă statistic (P 39, am procedat apoi la cuantificarea numărului lor la interfața feto-maternă. Cu toate acestea, nici uNKs, nici uMCs (Fig. 6) nu au fost afectate cel puțin în număr de tratament cu BPA. Astfel, acestea nu par să fie ținta BPA pentru remodelarea uSA afectată, în ciuda faptului că au receptori pentru estrogeni și că pot migra către interfața feto-maternă ca răspuns la hormoni 42 .

Număr comparabil de celule ucigașe naturale uterine (uNKs) și mastocite uterine (uMCs) de șoareci de control și tratați cu BPA. (A) Număr de uNK pe 1 mm 2 cuantificat în Dolichos biflorus aglutinină (DBA) secțiuni transversale colorate cu lectină ale implanturilor de șoareci BL/6J (n = 5) și șoareci BL/6J tratați cu BPA (n = 5) la gd10. (B) Numărul de CMU pe 1 mm 2 cuantificat în secțiuni transversale colorate cu albastru de toluidină ale uterilor șoarecilor BL/6J (n = 5) și șoareci BL/6J tratați cu BPA (n = 4) la gd5. Rezultatele sunt prezentate ca mijloace cu SEM. Diferențele statistice au fost obținute folosind Mann-Whitney-U- Test. uNKs, celule ucigatoare naturale uterine; gd, ziua de gestație; DBA, Aglutinina Dolichos biflorus; CMU, mastocite uterine.

Discuţie

Nivelurile hormonale bine echilibrate sunt obligatorii pentru o sarcină de succes. Alături de hormonul sarcinii, gonadotropina corionică umană, estrogenul și progesteronul sunt principalii actori în timpul gestației. Acești hormoni își îndeplinesc funcția prin legarea la receptorii de progesteron (PR) și receptorii de estrogen (ER) α, ERβ și ERRγ 43,44 .

În cadrul nostru experimental, expunerea la BPA în timpul sarcinii timpurii nu a avut niciun efect asupra numărului sau mărimii implantării, așa cum a fost analizat în ziua 5. Cu alte cuvinte, implantarea a avut succes la mamele expuse anterior la BPA. În literatură, efectele negative au fost descrise la șoareci care au fost tratați în mod repetat cu 100 mg/kg BPA/zi, o doză care a împiedicat implantarea, în timp ce 40 mg/kg BPA/zi au dus la întârzierea implantării embrionului la șoareci 45. O doză de 20 mg/kg BPA/zi a redus semnificativ numărul de implanturi la șobolani 46. Aceste doze sunt, cu toate acestea, mult mai mari decât dozele raportate de expunere reală. Aici și folosind doza oficială maximă permisă de BPA, nu am observat niciun efect asupra numărului de implantare sau a dimensiunilor de implantare, astfel cum a fost analizat în ziua 5. Concluzionăm că BPA în concentrația utilizată aici nu are niciun efect advers major asupra procesului de implantare în sine. . Cu toate acestea, nu putem arunca faptul că implantarea este întârziată sau mecanismele moleculare care dictează procesul de implantare sunt modificate negativ într-un mod în care efectele lor devin vizibile mai întâi atunci când fătul crește. Testarea efectului direct al BPA asupra in vitro modelele de implantare ar trebui să ajute la clarificarea acestui aspect.

După ce nu am observat niciun efect al BPA în ceea ce privește numărul de implanturi și dimensiunea implantelor la gd5, am urmărit apoi să înțelegem dacă implanturile s-au dezvoltat normal pe parcursul sarcinii. Ecografia de înaltă frecvență este un instrument valoros pentru monitorizarea creșterii fetale. Aici, am efectuat examinări cu ultrasunete la gd5, 8, 10, 12 și 14. Măsurătorile zonelor de implantare la gd5, 8 și 10 nu au evidențiat diferențe în dimensiunea implantării între animalele tratate cu BPA și animalele de control. Prin urmare, speculăm că BPA nu a influențat negativ implantarea și creșterea fetală la începutul până la jumătatea sarcinii.

Eșecul placentei de a se dezvolta normal și de a atinge creșterea în greutate așteptată poate duce la hipertensiune cronică maternă și preeclampsie 55, dar și la tulburări fetale 56. În ciuda unui fenotip IUGR clar în grupul tratat cu BPA în comparație cu animalele expuse vehiculului, nu au fost detectate diferențe în valorile UA între grupurile noastre în diferite momente de sarcină. Pe baza acestor observații, sugerăm că IUGR în acest model nu este asociat cu modificări remarcabile ale parametrilor Doppler în timpul sarcinii. Cu toate acestea, nu putem arunca faptul că perioada de observare nu este suficient de lungă sau că este posibil să avem nevoie de dimensiuni mai mari ale grupurilor pentru a detecta diferențele relevante între grupuri.

Pe scurt, prezentăm dovezi puternice că expunerea la scurt timp la BPA în timpul sarcinii murine precoce este suficientă pentru a provoca IUGR la făt; fiind IUGR precedat de remodelarea insuficientă a arterelor spirale uterine. Propunem că BPA poate afecta negativ dezvoltarea fetală prin afectarea directă a remodelării SA. Acest fapt alarmant ar trebui să conducă la studii ulterioare asupra mecanismelor moleculare care stau la baza cu scopul final de a concepe strategii care tind să prevină astfel de consecințe drastice pentru nenăscut.

Referințe

McLachlan, J. A. și Korach, K. S. Simpozion asupra estrogenilor din mediu, III. Perspective de sănătate a mediului 103(Supliment 7), 3-4 (1995).