Abstract

Obiectivul prezentului studiu a fost de a determina efectele suplimentării dietetice cu semințe de in asupra funcției vasculare și a dezvoltării leziunilor aterosclerotice în condiții hipercolesterolemice prelungite. Am selectat un model de iepure pentru a testa patru condiții dietetice diferite: o dietă de control regulată, o dietă suplimentată cu semințe de in, o dietă care conține niveluri crescute de colesterol și o dietă care conține atât colesterol, cât și semințe de in. Am emis ipoteza că semințele de in dietetice ar limita dezvoltarea aterosclerotică și ar demonstra un efect protector împotriva anomaliilor contractile vasculare induse de colesterol.

dietetice

Animale și intervenții dietetice.

Nouăzeci și șase de iepuri albi albini din Noua Zeelandă (NZW) (Southern Rose Rabbitry Farm, St. Claude, Canada), cântărind 2,5-3 kg la sosire, au fost adăpostiți individual în cuști metalice într-o cameră cu temperatură, umiditate și Cicl de lumină de 12 ore. Experimentele au fost revizuite și aprobate de Comitetul de revizuire a managementului protocolului de la Universitatea din Manitoba, în conformitate cu liniile directoare ale Consiliului canadian pentru îngrijirea animalelor (48). Animalele au fost repartizate aleatoriu în patru grupuri de opt animale pe durata hrănirii pe baza tratamentului dietetic. Animalele au fost hrănite timp de 6, 8 sau 16 săptămâni. Cele patru diete au inclus o dietă de control (RG) de iepure obișnuit (CO-OP Complete Rabbit Ration, Federal Cooperatives, Saskatoon, Canada), un chow de 10% suplimentat cu semințe de in (PX) și un chow suplimentat cu 0,5% colesterol CH) și o dietă suplimentată cu 0,5% colesterol și 10% semințe de in macinate (CF). Semințele de in Promega, furnizate de la Polar Foods din Fisher Branch, Canada, conțineau 71% ALA. Toate dietele au fost amestecate uscate și repelate pentru a încorpora componentele adăugate. Iepurii au fost hrăniți cu 125 g de tratament dietetic adecvat pe zi. Apa a fost dată ad libitum.

Prelevarea și analiza sângelui.

Probele de sânge au fost prelevate la momentul inițial (0 săptămâni) și după 6, 8 sau 16 săptămâni de intervenție dietetică din vena urechii marginale înainte de hrănirea zilnică. Nivelul colesterolului plasmatic și al trigliceridelor a fost măsurat enzimatic folosind truse comerciale (Thermo Electron). Acizii grași totali au fost extrasați din probele de plasmă și derivatizați așa cum s-a descris anterior (4, 38). Acizii grași au fost esterificați în esterii lor metilici corespunzători, utilizând o soluție de clorură de acetil-metanol-benzen. Analiza ulterioară prin cromatografie gazoasă (GC) cu detectarea ionizării cu flacără (FID) a condus cantitativ de esteri metilici ai acizilor grași (FAME) cantitativ. Conținutul de acizi grași ai probelor a fost identificat prin comparație cu standardele autentice (NuChek Prep, Elysian, MN).

Pregătirea țesuturilor.

După 6, 8 sau 16 săptămâni de tratament dietetic, iepurii au fost anesteziați cu izofluoran (5%, în oxigen, 2 l/min) și heparinizați. Aorta și arterele carotide au fost excizate și plasate imediat în soluție de calciu rece Krebs-Henseleit 1,9 mM (115 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 1,38 mM KH2PO4, 2,5 mM KCl, 2,46 mM MgSO4, 1,9 mM CaCl2, 11,2 mM dextroză, pH 7,4 ). Aorta a fost disecată cu atenție de la capătul distal al arcului aortic până la baza diafragmei. Aorta și carotidele au fost curățate de țesut adventitial și pregătite pentru testarea funcției vasculare, GC, secționarea sau analiza în față.

Evaluarea formării leziunilor aterosclerotice.

Leziunile aterosclerotice de-a lungul aortei distale și ale arterei carotide au fost evaluate în față și prin analiză transversală. Pentru analiza en face, arterele aortei și carotide au fost curățate de țesuturi periferice, deschise longitudinal și fotografiate digital, iar imaginile luminale au fost analizate folosind software-ul Silicon Graphics Imaging. Aria leziunii a fost calculată ca procent din aria luminală totală acoperită de leziunile aterosclerotice.

Țesutul aortic, fixat în paraformaldehidă tamponată 4% și clătit cu soluție de zaharoză 30% tamponat în 1 × PBS, a fost încorporat în mediul de înghețare a țesuturilor (compus cu temperatura optimă de tăiere), înghețat la -20 ° C, tăiat în grosimea de 10 μm secțiuni folosind un criostat și dezgheț montat pe lamele de sticlă pozitive Secțiunile au fost colorate cu ulei roșu O și contracolorate cu hematoxilină așa cum s-a descris anterior (44).

În urma analizei aterosclerozei în față, aortele au fost depozitate la -80 ° C, decongelate și omogenizate în pregătirea pentru extracția lipidelor cloroform-metanol, așa cum s-a descris anterior în detaliu (4, 21). Lipidele extrase au fost cuantificate așa cum s-a descris mai sus.

Protocol experimental pentru evaluarea răspunsului vascular.

Analize statistice.

Datele sunt exprimate ca mijloace ± SE. Comparațiile statistice au fost făcute folosind ANOVA unidirecțional, urmate de testul diferenței cu cel mai puțin semnificativ Fishers pentru comparații parametrice multiple. Diferențele dintre mijloace au fost considerate semnificative atunci când P

FIG. 1.Colesterol plasmatic (A) și trigliceride (B) concentrații la iepuri înainte (0 săptămâni) și după 6, 8 sau 16 săptămâni de intervenții dietetice. RG, dietă regulată; FX, 10% dietă suplimentată cu semințe de in; CH, 0,5% dietă suplimentată cu colesterol; CF, 0,5% colesterol și 10% dietă suplimentată cu semințe de in. Valorile sunt mijloace ± SE; n = 4-8. *P

Nivelurile de acid gras total plasmatic (TFA) au fost măsurate în toate grupurile (Tabelul 1). Conținutul de TFA a fost crescut în plasma grupurilor hrănite cu colesterol după toate punctele finale. Diferențele notabile în conținutul de acid gras din plasmă sunt următoarele: acid palmitic (C16: 0), acid palmitoleic (C16: 1), acid stearic (C18: 0), acid oleic (C18: 1), acid linoleic (C18: 2 n ) -6) și acidul arahadonic (C20: 4 n-6) nivelurile au fost semnificativ mai mari în grupurile CH și CF vs. grupurile RG și FX după 6, 8 și 16 săptămâni, cu niveluri mai scăzute ale acizilor grași din grupul CF comparativ cu grupul CH la 16 săptămâni. Nivelurile de ALA (C18: 3 n-3) au fost crescute la animalele hrănite atât cu semințe de in, cât și cu colesterol, după toate duratele de hrănire. S-a observat o mică creștere a nivelurilor plasmatice de ALA la animalele hrănite cu colesterol după 16 săptămâni. Acidul eicosapentaenoic cu acizi grași omega-3 cu lanț lung (EPA; C20: 5 n-3) a fost detectat numai în grupurile alimentate cu colesterol după 16 săptămâni, cu niveluri mai mari observate în grupul CF. Nivelurile de acid docosahexaenoic (DHA; C22: 6 n-3) din plasmă au fost detectate numai în urme. Raporturile dintre n-6 și n-3 PUFA au fost semnificativ mai mici în grupurile suplimentate cu semințe de in (până la 91 de ori) comparativ cu grupurile RG și CH, diferența diminuând odată cu durata studiului de hrănire.

tabelul 1. Concentrațiile plasmatice de acizi grași la iepuri hrăniți cu diete experimentale timp de 6, 8 și 16 săptămâni

Valorile sunt media ± SE, în mg/ml plasmă. Probele de plasmă au fost obținute după 6, 8 sau 16 săptămâni de hrănire (n = 7-8). RG, hrănit regulat; FX, 10% hrănit cu semințe de in; CH, 0,5% colesterol alimentat; CF, 0,5% colesterol plus 10% semințe de in hrănite; t, urme prezente (* P † P § P ‡ P

masa 2. Concentrațiile de acizi grași în țesutul aortic de la iepuri hrăniți cu diete experimentale timp de 8 și 16 săptămâni

Valorile sunt medii ± SE, în mg/g țesut. Acizii grași au fost extrasați din aortă după 8 sau 16 săptămâni de hrănire (n = 4-5). RG, hrănit regulat; FX, 10% hrană cu semințe de in; CH, 0,5% colesterol alimentat; CF, 0,5% colesterol plus 10% semințe de in hrănite; t, urme prezente (* P † P ‡ P

FIG. 2.Extinderea leziunilor aterosclerotice aortice după 6 (A), 8B) și 16 săptămâni (C) de tratament dietetic. Zona leziunii a fost măsurată ca procent din aria luminală aortică acoperită de leziuni aterosclerotice. Valorile sunt mijloace ± SE; n = 3-7. *P

Un efect calitativ similar asupra formării plăcii a fost observat în analiza secțiunii transversale (Fig. 3). Plăcile au fost prezente doar la animalele hrănite cu colesterol și au fost mai severe la animalele care nu au primit supliment de semințe de in. Cu toate acestea, la 16 săptămâni, efectul protector al semințelor de in dietetice asupra grosimii plăcii nu a fost observat.

FIG. 3.Secțiuni transversale aortice reprezentative din cele 4 grupuri experimentale care prezintă depozite de lipide colorate cu roșu uleios. Grup RG, 6 săptămâni (A); Grup FX, 6 săptămâni (b). Nu sunt prezentate imagini reprezentative din grupurile RG și FX la 8 și 16 săptămâni, deoarece leziunile aterosclerotice nu au fost evidente în grupurile RG și FX în niciun moment. Grup CH: 6 (c), 8e) și 16 săptămâni (g). Grupa CF: 6 (d), 8f) și 16 săptămâni (h).

Rezultate similare în ceea ce privește formarea plăcii aterosclerotice au fost observate în vasele carotide, deși gradul de ateroscleroză nu a fost la fel de sever (Fig. 4). Carotidele nu au fost colectate după procesul de 6 săptămâni. După 8 săptămâni de suplimente alimentare, formarea plăcii aterosclerotice în carotide a fost inhibată prin includerea semințelor de in în dieta colesterolului. Acest efect protector a fost pierdut după 16 săptămâni de intervenție dietetică.

FIG. 4.Nivelul leziunilor aterosclerotice carotide după 8 (A) și 16 săptămâni (B) de tratament dietetic. Zona leziunii a fost măsurată ca procent din aria luminală a arterelor carotide acoperite de leziuni aterosclerotice. Valorile sunt mijloace ± SE; n = 4-7. *P

Greutățile țesuturilor secțiunilor aortice de 3 mm care au fost utilizate pentru a evalua răspunsul vascular nu au fost semnificativ diferite între cele patru grupuri în urma studiilor de 6 și 8 săptămâni. Cu toate acestea, greutățile țesutului aortic au fost semnificativ mai mari, din cauza leziunilor aterosclerotice mari, în grupurile CH și CF în urma intervenției dietetice de 16 săptămâni, comparativ cu grupurile RG și FX (CH, 35,4 ± 2,3; CF, 39,0 ± 4,7; RG, 21,5 ± 0,8; și FX, 20,9 ± 1,5 mg).

Efectele semințelor de in dietetice și ale colesterolului asupra răspunsului contractil vascular.

Răspunsul inelelor aortice de la animale hrănite cu diferite regimuri dietetice a fost investigat mai întâi în funcție de agoniștii contractili. Nu s-au observat diferențe în vasoconstricția indusă de KCl în niciun grup după 6 și 8 săptămâni de tratament dietetic (Fig. 5, A și B). Cu toate acestea, inelele aortice din ambele grupuri suplimentate cu colesterol au prezentat un răspuns contractil atenuat la KCl în comparație cu grupurile RG și FX după 16 săptămâni de tratament dietetic (Fig. 5C).

FIG. 5.Răspuns contractil la 47 mM KCl a inelelor aortice proximale izolate după 6 (A), 8B) și 16 săptămâni (C) de tratament dietetic. Valorile sunt mijloace ± SE; n = 5-8. *P

O ușoară depresie în răspunsul contractil la NE a fost observată după 6 săptămâni de intervenție dietetică, deoarece preparatele aortice din ambele grupuri suplimentate cu colesterol s-au contractat semnificativ mai puțin ca răspuns la 10-7 M NE decât au făcut grupurile RG și FX (Fig. 6).A). Nu s-a observat nicio diferență în contracția indusă de NE între grupurile după 8 săptămâni de tratament dietetic (Fig. 6B). Cu toate acestea, grupurile CH și CF s-au contractat semnificativ mai puțin ca răspuns la o serie de concentrații de NE (10-6, 10-5 și 10-4 M NE) comparativ cu grupurile RG și FX după 16 săptămâni de tratament dietetic (Fig. 6C). A existat, de asemenea, un mic declin al răspunsului contractil general la NE observat în funcție de vârsta tuturor animalelor (Fig. 6, A - C).

FIG. 6.Răspuns contractil la creșterea dozelor de norepinefrină (NE) a inelelor aortice proximale izolate după 6A), 8B) și 16 săptămâni (C) de tratament dietetic. Valorile sunt mijloace ± SE; n = 6-8. *P

Răspunsurile de relaxare aortică au fost, de asemenea, monitorizate după precontractare cu 10-6 M NE în funcție de intervențiile dietetice. Inelele aortice din grupul CH au prezentat semnificativ mai puțină relaxare dependentă de endoteliu ca răspuns la doze mai mari de ACh (10-6 și 10-5 M) decât grupul RG după 6 săptămâni de intervenții dietetice (Fig. 7A). Semințele de in adăugate în dietă au prevenit în mod eficient aceste defecte induse de colesterol. După 8 săptămâni de hrănire cu colesterol, grupul CH sa relaxat mai puțin ca răspuns la 10-6 M ACh decât grupurile RG și FX (Fig. 7B). Din nou, acest lucru a fost prevenit prin includerea semințelor de in în dietă. În urma studiului de 16 săptămâni, grupul CH a demonstrat din nou un defect semnificativ în relaxarea endotelială dependentă de ACh. Adăugarea de semințe de in a prevenit parțial aceste defecte ale relaxării vasculare induse de colesterol; cu toate acestea, efectul protector nu a mai atins semnificația statistică la concentrații de 10 -5 M ACh (Fig. 7C).

FIG. 7.Relaxare dependentă de endoteliu ca răspuns la acetilcolină (ACh) în inele aortice după precontractie cu 10-6 M NE la 6A), 8B) și 16 săptămâni (C) de tratament dietetic. Rezultatele sunt prezentate ca procentaj de tensiune după administrarea ACh după precontractare cu 10-6 M NE. Valorile sunt mijloace ± SE; n = 6-8. *P

Vasorelaxarea independentă de endoteliu a fost, de asemenea, investigată folosind SNP. Rezultatele intervenției dietetice de 16 săptămâni sunt prezentate în Fig. 8. Nu au existat diferențe semnificative în ceea ce privește gradul de relaxare independentă de endoteliu la SNP între cele patru grupuri după 16 săptămâni de intervenție dietetică (Fig. 8A). Mai mult, rata relaxării indusă de SNP a fost, de asemenea, nealterată de alegerea intervențiilor dietetice (Fig. 8B).

FIG. 8.A: relaxare independentă de endoteliu ca răspuns la nitroprusidă de sodiu (SNP) în inele aortice după precontractare cu 10-6 M NE, după 16 săptămâni de tratament dietetic. Rezultatele sunt prezentate ca procentaj de tensiune după administrarea SNP după precontractare cu 10-6 M NE. B: rata de relaxare ca răspuns la 10 −6 M SNP (g tensiune/s). Rezultatele reprezintă pierderea tensiunii în primul minut după administrarea SNP 10-6 M. Valorile sunt mijloace ± SE; n = 7-8.

Suplimentarea cu semințe de in a dus la o creștere semnificativă a nivelurilor de ALA în plasmă și țesutul aortic (tabelele 1 și 2). Această creștere a avut loc în absența sau prezența colesterolului alimentar suplimentar. Deși concentrația plasmatică a EPA cu acizi grași omega-3 cu lanț mai lung a fost detectată numai la niveluri scăzute cu alimentarea cu colesterol în urma studiului de 16 săptămâni, EPA și DHA au fost detectate ambele în țesutul aortic al iepurilor care consumă semințe de in și colesterol după 8 săptămâni de hrănire. Cele mai ridicate niveluri au fost observate la animalele care consumă o combinație de colesterol și semințe de in în urma studiilor de hrănire mai lungi. Aceste rezultate demonstrează că ALA este metabolizat într-o mică măsură la acizi grași cu lanț mai lung, cum ar fi EPA și DHA la iepure. Suplimentarea cu semințe de in a redus, de asemenea, raportul n-6 la n-3 PUFA, în principal ca urmare a nivelurilor crescute de n-3 PUFA circulante. Adăugarea de semințe de in dietetice la dieta aterogenă a atenuat, de asemenea, creșterea indusă de colesterol a nivelurilor plasmatice de trigliceride (Fig. 1B). Aceste rezultate sunt în concordanță cu lucrările anterioare din laboratorul nostru folosind această intervenție dietetică (4).

Stresul oxidativ poate fi un alt factor mecanic important în disfuncția contractilă vasculară indusă de colesterol (22, 28, 33, 43) și în ateroscleroză (35, 57, 75). De exemplu, statinele pot îmbunătăți relaxarea vasculară dependentă de endoteliu la pacienții hipercolesterolemici prin scăderea stresului oxidativ (33). Prin urmare, este posibil ca capacitatea antioxidantă puternică a semințelor de in să fi fost responsabilă de acțiunea sa benefică asupra aterosclerozei și relaxării vasculare (50, 54). Se consideră că lignanul SDG din semințele de in este responsabil pentru această acțiune antioxidantă (34, 51, 54, 55, 58) și ar fi putut contribui, de asemenea, la efectul său protector împotriva defectelor induse de colesterol în relaxarea vasculară.

Pe scurt, datele noastre demonstrează pentru prima dată că semințele de in pot proteja împotriva depunerii de plăci aterosclerotice în arterele carotide și confirmă efectele sale anti-aterosclerotice în aortă. Am arătat, de asemenea, pentru prima dată că semințele de in dietetice pot îmbunătăți relaxarea vasculară dependentă de endoteliu în prezența unei diete bogate în colesterol. Cu toate acestea, semințele de in dietetice nu sunt un panaceu. Dacă dieta bogată în colesterol este prelungită în durată, semințele de in își pierd în cele din urmă capacitatea de a proteja împotriva leziunilor induse de colesterol. În ciuda acestei limitări, datele noastre întăresc ipoteza că suplimentarea pe termen lung a dietei cu semințe de in poate fi o strategie dietetică eficientă și sigură pentru a limita etapele timpurii și moderate ale aterogenezei și ale disfuncției vasculare asociate cu ateroscleroza. Dozajul de semințe de in utilizat în această investigație este similar cu cel utilizat anterior în studiile la om (14, 42). Rezultatele noastre, prin urmare, sugerează că modificarea dietei cu semințe de in poate avea o acțiune importantă de protecție la om împotriva bolilor vasculare atât în ​​inimă, cât și în accident vascular cerebral.

Acest studiu a fost susținut de o subvenție acordată de Institutele Canadiene de Cercetare în Sănătate (IRSC), Consiliul Flax din Canada și Direcția Produse pentru Sănătate Naturală. C. M. C. Dupasquier deține o bursă de doctorat în Consiliul de cercetare în științe naturale și inginerie din Canada. B. P. Ander deține un premiu de cercetare doctorală a Fundației inimii și accidentului vascular cerebral din Canada. J. T. Wigle deține un premiu CIHR pentru nou investigator.

NOTĂ DE PICIOASĂ

Costurile de publicare a acestui articol au fost suportate parțial prin plata taxelor de pagină. Prin urmare, articolul trebuie marcat prin prezenta „publicitate”În conformitate cu 18 U.S.C. Secțiunea 1734 doar pentru a indica acest fapt.

Suntem recunoscători Polar Foods și Dr. Edward Keneschuk pentru furnizarea de semințe de in îmbogățite cu ALA pentru acest studiu. Mulțumim, de asemenea, Andrea L. Edel, J. Alejandro Austria și Riya Ganguly pentru asistență tehnică valoroasă în extracția și analiza lipidelor.