Afiliere Sinopah Wildlife Research Associates, Missoula, Montana, Statele Unite ale Americii

expunerii

Adresa actuală: New England Aquarium, Boston, Massachusetts, Statele Unite ale Americii

Departamentul de Afiliere Biologie, Universitatea din Washington, Seattle, Washington, Statele Unite ale Americii

Afiliere Northern Rocky Mountain Science Center, US Geological Survey, West Glacier, Montana, Statele Unite ale Americii

Departamentul de Afiliere Biologie, Universitatea din Washington, Seattle, Washington, Statele Unite ale Americii

  • Jeff Stetz,
  • Kathleen Hunt,
  • Katherine C. Kendall,
  • Samuel K. Wasser

Cifre

Abstract

Citare: Stetz J, Hunt K, Kendall KC, Wasser SK (2013) Efectele expunerii, dietei și termoreglării asupra măsurilor de glucocorticoizi fecali la urșii sălbatici. PLOS ONE 8 (2): e55967. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0055967

Editor: Frank Seebacher, Universitatea din Sydney, Australia

Primit: 1 octombrie 2012; Admis: 4 ianuarie 2013; Publicat: 14 februarie 2013

Acesta este un articol cu ​​acces liber, lipsit de orice drept de autor și poate fi reprodus, distribuit, transmis, modificat, construit sau utilizat în orice mod de către oricine în orice scop legal. Lucrarea este pusă la dispoziție sub dedicarea domeniului public Creative Commons CC0.

Finanțarea: Munca de teren pentru acest studiu a fost finanțată în principal de JBS, dar nu au existat potențiale câștiguri financiare pentru niciun autor prin intermediul acestei lucrări. USGS a oferit spații de birouri, suport IT și un vehicul de teren. Toate analizele de laborator au fost sprijinite de Universitatea din Washington Center for Conservation Biology. Un sprijin suplimentar de laborator a fost oferit de Universitatea din Montana. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: În conformitate cu politica PLOS ONE privind documentarea conflictelor de interese, autorii declară prin prezenta că nu există interese concurente cu niciun autor. Mai exact, autorul afiliat la o entitate privată (JBS) nu are interese în niciuna dintre metodele sau rezultatele incluse în acest manuscris. Ca atare, afilierea autorilor nu modifică respectarea autorilor la toate politicile PLOS ONE privind schimbul de date și materiale.

Introducere

Analiza hormonilor fecali a devenit o tehnică utilizată pe scară largă pentru măsurarea stării endocrine a unui animal și poate oferi informații valoroase programelor de conservare și monitorizare. Probele de fecale sunt adesea ușor de găsit și identificat la nivelul speciei și pot fi colectate fără a perturba viața sălbatică [1]. Analiza hormonilor din aceste probe poate oferi o varietate de măsuri de stres, de reproducere și de stare metabolică, care pot fi corelate cu presiunile mediului în timp [2] - [10]. Cu toate acestea, colectarea eșantionului neinvaziv include deseori eșantioane care au fost expuse la condiții de mediu variabile pentru perioade de timp variate și necunoscute. Înțelegerea modului în care timpul și expunerea în mediul natural afectează degradarea hormonilor este o condiție prealabilă pentru interpretarea fiabilă a nivelurilor hormonilor fecali, mai ales dacă aceleași condiții naturale care determină variații ale nivelurilor hormonilor (de exemplu, temperatura ambiantă) promovează și degradarea hormonilor [11],].

Separăm efectele termoregulatorii de efectele legate de degradare asupra nivelurilor de fGC într-un studiu al urșilor grizzly (Ursus arctos horribilis) și al urșilor negri americani (U. americanus) în Glacier National Park, MT. Data iuliană (estimarea temperaturii ambientale) plus aspectul, panta și elevația (estimarea colectivă a expunerii termice) și precipitațiile în locațiile de colectare a probelor au fost folosite pentru a prezice impacturile termoreglatorii prin măsurarea nivelurilor de fGC în probe de fecale proaspete la momentul 0 (adică, probe Figura 1 Harta care arată locația traseelor ​​și a șobolanilor chestionați colectate în Parcul Național Glacier, Montana.

Scats au fost colectate în perioada 09 septembrie-11 octombrie 2001.

Zona de studiu a fost situată chiar la vest de diviziunea continentală, într-un climat relativ umed care reflectă o influență maritimă. Altitudinea a variat de la aproximativ 950 m la 1250 m. Traseele supravegheate se desfășurau în principal pe versanți orientați spre vest sau spre sud, prin pădure matură formată în mare parte din brad Douglas (Pseudotsuga menziesii), molid Engelmann (Picea engelmannii), pin lodgepus (Pinus contorta) și zada vestică (Larix occidentalis).

Deși PNB oferă un nivel ridicat de securitate faunei sălbatice în interiorul granițelor sale, se știe că urșii se mișcă ușor în afara parcului și în întreaga S.U.A. Autostrada 2/coridorul căii ferate. În afara ursului PNB sunt expuși la o varietate de factori de stres legați de activitățile umane, cum ar fi traficul cu trenul și autostrada, reședințele private și cazările publice mici, precum și diverse forme de activități recreative și industriale în aer liber, cum ar fi exploatarea forestieră.

Colectarea și prelucrarea probelor

Perioada de studiu a fost de la data iuliană 250 (începutul lunii septembrie), când temperatura zilnică era de 27 ° până la 35 ° C, până la data iuliană 300 (sfârșitul lunii octombrie), când temperaturile erau aproape de îngheț, cca. 0 ° până la -5 ° C (Fig. 2). Două trasee, cu o lungime de aproximativ 19 km fiecare, au fost inspectate zilnic pentru a se asigura că fiecare scat nou găsit a fost Figura 2. Modificarea temperaturii ridicate și scăzute (° C) în perioada de eșantionare din West Glacier, Montana, 2001.

Când un nou scat (. Astfel, +1 este cel mai tare aspect (orientat spre vest) și −1 (orientat spre NE) cel mai tare. Am folosit un sistem de informații geografice pentru a media aspectul la fiecare 30 m pixel care a intersectat un tampon de 100 m în jurul Locația fiecărui eșantion. Aspectul ar fi important dacă urșii caută și concurează pentru aceste locații pentru a regla mai bine cerințele termice. Metoda noastră presupune că locația eșantionului fecal este un proxy rezonabil al locației medii a ursului. Orice eroare aleatorie asociată cu această presupunere ar trebui să scadă mai degrabă decât creșterea semnificației covariabilelor în modelul nostru.

Toate probele de fecale au fost liofilizate în decurs de 30 de zile de la recoltare și depozitate la -80 ° C până când au fost extrase și analizate pentru concentrația de glucocorticoizi. În alți omnivori, probele de liofilizare și exprimarea conținutului de hormoni per g de fecale uscate s-au dovedit a minimiza impactul alimentar asupra ratelor de excreție a hormonilor fecali, independent de nutriție [12].

Toate probele au fost extrase și testate pentru fGC folosind metoda descrisă de Wasser și colab. [9]. Pe scurt, o submostă de 0,2 g de probă uscată, pulverizată, bine amestecată, a fost cântărită la cel mai apropiat 0,0001 g și transferată într-un flacon de 15 ml. După adăugarea 4 ml de metanol 90% la probă, flaconul a fost acoperit și apoi agitat timp de 30 de minute într-un vortex pulsator. Probele au fost ulterior centrifugate (20 min) și 1 ml de supernatant îndepărtat pe probă și depozitate la -20 ° C până la testare. Extractele au fost apoi diluate de patru ori în tampon de testare și cuantificate pentru fGC cu un kit de dublu anticorp 125 I radioimunoanaliză (MP Biomedicals [anterior ICN], Solon, OH, catalog nr. 07-120103). Am folosit protocolul producătorului, cu excepția celor cu jumătate de volum. Controalele scăzute și ridicate au fost incluse în fiecare test. Tuburile și semifabricatele nespecifice de legare au fost testate în patru exemplare, iar standardele, controalele și probele în duplicat; orice probă cu CV> 10% între duplicate a fost re-testată pentru a confirma rezultatele. Această analiză a fost validată anterior pentru fGC cu urs negru și grizzly [9]. Pentru alte detalii despre test, vezi Wasser și colab. [9] și Hunt și Wasser [11].

Analize statistice

Măsurile glucocorticoide fecale au fost normalizate prin transformarea logului (log10 (X + 1)) în toate analizele. Am folosit modele liniare generalizate (GLM) pentru a prezice mai întâi concentrațiile de fGC în probe proaspete (timp 0) pe baza proxy-urilor de nutriție (fructe de pădure și carne> vegetație [24]), temperatura ambiantă (data iuliană; Fig. 1) și expunerea termică (de exemplu, aspectul, panta, elevația și indicele sarcinii de căldură). Efectele de degradare s-au presupus a fi neglijabile în timpul a 0 eșantioane (≤24 ore vechi), deoarece lucrările anterioare [11] au arătat că GC-urile din urs sunt foarte stabile. Am găsit sprijin pentru această ipoteză arătând că precipitațiile (de la momentul defecării până la colectarea probelor) nu au avut niciun efect asupra concentrațiilor de fGC ale timpului 0 probe după ce s-a descoperit că precipitația este principala cauză a degradării în probele de timp 1 (vezi rezultatele). Covariabilele de la momentul 0 GLM au fost utilizate în continuare pentru a prezice concentrațiile de fGC în jumătățile de probă expuse pentru a determina dacă aceleași covariate de mediu prezic încă în mod fiabil concentrațiile de fGC, cu și fără a include efectele timpului de expunere și precipitații. Toate variabilele incluse în modelele noastre finale au fost derivate din două GLM-uri separate, suport pentru care s-a bazat pe valorile AICc [25].

Toate variabilele semnificative din aceste două GLM-uri au fost apoi incluse într-o analiză a variației multivariate de măsuri repetate (MANOVA) pentru a identifica variabilele de mediu care au afectat atât variația între eșantioane în fGC (independent de timpul de expunere), cât și efectele de degradare ale eșantionului timp de expunere. Acest lucru ne-a permis să stabilim dacă impacturile de degradare au fost suficient de severe în timpul sub-eșantioanelor 1 (adică, jumătățile de eșantion care au fost lăsate în câmp timp de 1-28 zile) pentru a masca diferențele în nivelurile de fGC datorită factorilor de stres de mediu detectați în timpul 0 ) submostre.

Mărimea efectului a fost, de asemenea, examinată în analizele MANOVA pentru a compara întregul model, precum și toate variabilele incluse în fiecare model, utilizând statistica lui Cohen, unde:

Prin convenție, dimensiunile efectului de 0,02, 0,15 și 0,35 sunt denumite mici, medii și, respectiv, mari.

Rezultate

Analiza 1: Factori care influențează nivelurile fGC la momentul 0

Principalele efecte care explică variația concentrațiilor fGC la momentul 0 (adică, înainte de efectele de degradare), bazate pe suportul modelului AICc, au fost conținutul de alimente (vegetație vs fructe de pădure sau carne), data iuliană, aspectul, precum și o interacțiune între data iuliană și aspect (Tabelul 1). Timpul 0 fGC a crescut odată cu data iuliană, fiind cel mai scăzut la date anterioare (temperaturi mai calde) și cel mai mare la date ulterioare (temperaturi mai scăzute; Fig. 2). Interacțiunea cu aspectul, totuși, a indicat că fGC-urile au fost cele mai scăzute în aspecte mai reci la date anterioare (temperaturi mai ridicate) și în aspecte mai calde la date ulterioare (temperaturi mai reci). În esență, fGC-urile au fost mai scăzute în scats colectate în locații reci (aspecte) pe vreme caldă și în locații calde pe timp rece (Fig. 3).

Fiecare rând reflectă o dată iuliană diferită, cu 20 de zile distanță, așa cum este indicat de linia verticală întreruptă din coloana centrală a fiecărui rând. Aspectul este transformat, prin care −1 = cel mai tare și +1 = cel mai cald aspect (a se vedea textul).

Time 0 fGCs părea, de asemenea, să reflecte calitatea nutrițională a dietei; fGC-urile au fost cele mai mari pentru șobolanii care conțin în principal vegetație (iarbă, frunze, tulpini, rădăcini, tuberculi și cormi, indicând probabil o nutriție relativ slabă și/sau stres ridicat) și cel mai scăzut pentru șobolanii care conțin fructe de pădure și carne (ceea ce implică o nutriție relativ bună și/sau scăzută stres; Tabelul 1).

Așa cum era de așteptat, precipitațiile nu au avut niciun efect asupra concentrațiilor de fGC în timp 0 probe, susținând presupunerea noastră că efectele de degradare au fost nedetectabile în timp 0 probe (Tabelul 1).

Analiza 2: Factori care influențează nivelurile fGC la momentul 1

Am examinat stabilitatea fGC în timp, evaluând dacă aceleași variabile care prezic concentrațiile de fGC în timpul eșantioanelor 0 au rămas semnificative în eșantioanele de timp 1, cu sau fără adăugarea tuturor măsurilor de degradare (de exemplu, timpul de expunere, precipitații și interacțiunile lor cu aspectul ). Toți predictorii fGC în timp 0 probe au rămas predictori semnificativi în timp 1 probe. Adăugarea precipitațiilor și interacțiunea sa cu aspectul au îmbunătățit însă semnificativ modelul care prezice concentrațiile de fGC în probele de timp 1 (Tabelul 1). Creșterea precipitațiilor cumulative între timpul 0 și timpul 1 a scăzut concentrațiile de fGC ale probelor de timp 1 și cu cât aspectul este mai rece, cu atât acest efect a fost exacerbat.

Analiza 3: Covariatele care influențează degradarea GC

Măsurile repetate MANOVA au fost în concordanță cu constatările de mai sus (Tabelul 2). Dieta, data iuliană și interacțiunea dintre data iuliană și aspect au rămas predictori semnificativi ai variației între eșantioane în fGC. Precipitațiile cumulative, care au afectat în mod semnificativ concentrațiile de fGC în probele de timp 1 dar nu și de timp 0, au fost, de asemenea, un predictor semnificativ al variației între probe în fGC în MANOVA. Cu toate acestea, doar dieta și interacțiunea dintre precipitații cumulative și aspect au fost predictori semnificativi ai variației în cadrul eșantionului în timp. Precipitațiile cumulate în probele expuse în aspecte mai reci au arătat o degradare crescută în timp (Tabelul 2).

Discuţie

Este posibil ca o parte a varianței între eșantioane în fGC explicată de data iuliană să se fi datorat, de asemenea, schimbărilor sezoniere în dietă, deoarece fructele de pădure importante din punct de vedere nutrițional erau cele mai abundente mai devreme în sezonul de prelevare, când fGC era mai scăzută. Astfel de efecte nutriționale nu ar explica, totuși, interacțiunea dintre data iuliană și aspectul pe fGC; acestea pot fi împăcate numai prin efectele comune ale temperaturii și expunerii. Mai mult, șobolanii au avut un amestec de produse alimentare de înaltă și joasă calitate pe tot parcursul sezonului de prelevare. De exemplu, fructele de pădure foarte nutritive au fost principalele conținuturi în unele scats până la mijlocul lunii octombrie.

O anumită degradare a fGC a avut loc în perioada de expunere de 28 de zile, în mare parte din cauza precipitațiilor cumulative, în special în aspecte mai reci, unde evaporarea ar fi redusă. În general, fGC a scăzut în timp 1 eșantioane în funcție de aspectul care interacționează cu precipitațiile. Cu toate acestea, în timp 0 eșantioane, această relație a fost inversată; fGC a crescut în timp 0 eșantioane atunci când aspectul a interacționat cu data iuliană (temperaturi reci), în ciuda precipitațiilor mai mari la datele iuliene ulterioare. Aceste relații diferite în timp 0 vs. probele de timp 1 susțin cu tărie concluziile noastre că (a) fGC reflectă cerințele de termoreglare și (b) că o anumită degradare a fGC are loc în probele expuse la precipitații cumulative pentru perioade de săptămâni înainte de colectare. Aceste ultime efecte, totuși, au fost încă insuficiente pentru a masca efectele covariabilelor biologice care prezic concentrațiile de fGC în probele de timp 1.

În cele din urmă, autocorelarea măsurătorilor fGC este puțin probabil să contribuie la rezultatele studiului, deoarece mai multe probe au fost colectate în imediata apropiere una de cealaltă cu o singură ocazie (Fig. 1). Viitoarele studii de teren ar putea genotipiza scat ca o protecție suplimentară împotriva autocorelației, așa cum a făcut Wasser și colab. [1].

Concluzii

Scat poate oferi o mare varietate de informații fiziologice și genetice și este cel mai accesibil produs biologic din viața sălbatică din natură. În mod colectiv, acest lucru oferă posibilitatea de a împărți impacturile dintr-o serie de presiuni de mediu multiple, având în vedere proiectarea corectă a studiului [5], [10]. Rezultatele noastre sugerează că analizele fGC pot oferi informații despre termoreglare și nutriție la urșii grizzly și urșii negri și pot servi drept indice de răspuns fiziologic la schimbările climatice. Am arătat în continuare că unele efecte ale degradării eșantioanelor se produc în natură. Aceste efecte au fost, însă, insuficiente pentru a masca detectarea impactului biologic asupra mediului asupra ursidelor în probele expuse timp de până la o lună. Indiferent, controlul precipitațiilor cumulative pe perioada de expunere a eșantionului poate fi folosit ca măsură de precauție suplimentară împotriva unor astfel de efecte de degradare care maschează efectele biologice. Studii similare care examinează alți hormoni, medii, diete și specii vor fi importante pentru a evalua cât de departe pot fi generalizate descoperirile noastre.

Mulțumiri

Mulțumim tehnicienilor noștri L. Erickson, J. Hebert, J. Mascia, D. Reding, B. Wollenzien și K. Yale pentru că au parcurs aceeași potecă în fiecare zi timp de 6 săptămâni, indiferent de vreme sau plictiseală. Mulțumim lui J. Reimers de la Universitatea din Montana pentru acces și asistență cu probele liofilizante. Mulțumim Liz Addis pentru asistență în analize de laborator și de date. Mulțumim lui Tyler Coleman, Clayton Miller și doi recenzori anonimi pentru că au oferit comentarii utile cu privire la versiunile anterioare ale acestui manuscris. Această cercetare a fost efectuată în baza permisului de colecții Glacier National Park GLAC-2001-SCI-0024.

Contribuțiile autorului

Conceput și proiectat experimentele: JS SW. A efectuat experimentele: JS KH SW. Analiza datelor: JS KH SW. Reactivi/materiale/instrumente de analiză contribuite: JS KH KK SW. Am scris lucrarea: JS KH KK SW.