Subiecte

Abstract

Introducere

De la peste 100.000 de rinoceri negri africani în anii 1960, această specie pe cale de dispariție critică a scăzut cu mai mult de 90% la aproximativ 5.000 de animale în prezent 1. În medie, peste 1.000 de rinoceri sunt braconați anual într-o serie de țări care includ Africa de Sud, Namibia, Kenya și Zimbabwe 1. În prezent, mai puțin de 100 de rinoceri negri (sud-est și sub-specii combinate) locuiesc în instituțiile zoologice din America de Nord ca rezervor împotriva potențialei dispariții 2. Însă ex situ populația se confruntă cu propriile sale amenințări la adresa supraviețuirii, incluzând o multitudine de sindroame de boală neobișnuite care nu sunt descrise în general în sălbăticie 3,4,5,6,7,8,9,10, precum și o reproducere slabă 11,12 și populații fragmentate 3. La toate mamiferele, studii recente au sugerat că diferențele de microbiomi între populațiile sălbatice și captive pot influența sănătatea generală în general și funcțiile digestive și imune în special 4 .

Rezultate

Microbiom bun

Citiți abordările de mapare și extracție

Toate eșantioanele au fost secvențiate la o adâncime de cel puțin 6,9 milioane de lecturi de capăt perechi per eșantion, cu o medie de 12.479.613 citiri de capăt asociat. Foarte puține citiri au fost aruncate în timpul tăierii de calitate (3,16%); media post QC a fost de 12.085.574 citiri pereche pe eșantion.

În general, rate de cartografiere scăzute (Tabelul 1 Procentul mediu de cartografiere pentru toate platformele software de cartografiere metagenomică.

Bogăția unității taxonomice operaționale (OTU) a fost inconsistentă între eșantioane și a fost influențată de trusa de extracție utilizată. Probele extrase de ZymoBIOMICS au avut în medie mai multe lovituri OTU comparativ cu probele extrase de MoBio PowerFecal, indiferent de origine (sălbatic vs captiv; p = 0,099). PathoScope a atribuit o proporție mai mare de citiri setului de probe sălbatice (R2-R11) care au fost stocate în scutul Zymo ADN/ARN și extrase folosind kitul ZipmoBIOMICS DNA Miniprep (în medie 447.354 citiri) decât probele sălbatice înghețate și extrase cu MoBio PowerFecal kit (în medie 155.729 de citiri). Probele sălbatice Zymo au avut în medie 350 OTU la nivelul speciei, în timp ce probele sălbatice MoBio au avut 250 OTU (p = 0,036). Astfel, metoda de colectare a influențat compoziția microbiomului. Comunitățile observate au diferit semnificativ între probele sălbatice extrase de MoBio și cele extrase de Zymo (PERMANOVA, p Figura 1

intestinal

Compoziția microbiomului de rinocer, determinată de PathoScope, defalcate pe (A) filum și (B) clasă, grupată după gazdă sălbatică versus captivă. Spațiul gol reprezintă citiri bacteriene neidentificate la rangul taxonomic corespunzător. Taxa reprezentând mai puțin de 1% din citiri în medie și mai puțin de 5% din toate eșantioanele au fost filtrate de dragul vizualizării.

La nivel de filum și clasă, abundența câtorva bacterii distinge microbiomii rinocerului pe baza statutului sălbatic față de cel captiv. Analiza la nivelul genului a relevat diferențe mai mari între rinocerii sălbatici și cei captivi (Fig. 2A). Genere Escherichia, Oscilibacter, Pseudobutyrivibrio, și Treponema au fost mai mari în rinocerii sălbatici, în timp ce Bacteroides și Prevotella au fost crescute la toate omologii captivi. Cu toate acestea, atât rinocerii sălbatici, cât și cei captivi au exprimat principalele grupuri de microbi pentru digestie (celulolitic, amilolitic), dar au fost reprezentați de specii diferite (adică, microbiomi funcționali, dar taxonomici diferiți; Fig. 2B). Au existat, de asemenea, o serie de specii care erau în mod diferențiat abundente între rinocerii sălbatici și captivi. De exemplu, bacteriile producătoare de metan Methanocorpusculum bavaricum (p = 0,0059) a fost mai abundent la rinocerii sălbatici, în timp ce rinocerii captivi conțineau Methanobrevibacter ruminantium (p = 2.06e-28). Bacteroides fragilis (p = 0,0005), Steptococcus suis (p = 3,94e-15) și Escherichia coli (p Figura 2

Compoziția microbiomului bacterian rinocer negru, determinată de PathoScope, împărțită în (A) gen și (B) specii, grupate după gazdă sălbatică sau captivă. Spațiul gol prezintă citiri bacteriene neidentificate la rangul taxonomic corespunzător. Taxa reprezentând mai puțin de 1% din citiri în medie și mai puțin de 5% din toate eșantioanele au fost filtrate de dragul vizualizării.

S-au găsit taxe obișnuite în rinocerii sălbatici și, respectiv, captivi, sugerând un microbiom de rinocer de bază bazat pe starea de captivitate (Tabelul suplimentar S1a, b). Filul Firmicutes a dominat microbiomul atât al rinocerilor sălbatici, cât și al celui captiv, care cuprindea 32,7% și 20,8% din totalul citirilor cartografiate și 51,1% și respectiv 48,0% din microbiomul de bază. Cu toate acestea, următoarele filme dominante principale în rinocerii sălbatici au fost Proteobacteria (23,6%) și Bacteroidetes (17,6%), în timp ce Bacteroidetes a fost al doilea filum dominant în microbiomul rinocerului captiv (42,4%).

Deși compoziția taxonomică a rinocerilor prezintă diferențe între microbiomii intestinului sălbatic și captiv, măsurile de diversitate alfa între cele două grupuri au fost similare. Cu toate acestea, bogăția speciilor observate (p = 0,082) a indicat că rinocerii sălbatici au o bogăție mediană mai mare observată de OTU (

335) comparativ cu captivii

220) (Fig. 3), care este în concordanță cu toate rezultatele taxonomice. Atât indicii de diversitate Shannon (p = 0,36), cât și Simpson (p = 0,69) indică faptul că rinocerii prezintă o diversitate ridicată, independent de originea lor (sălbatic vs captiv), cu rinoceri sălbatici care prezintă o diversitate ușor (dar nu semnificativă) mai mare. 3) . Pentru toate cele trei măsuri de diversitate alfa, eșantioanele derivate din rinoceri sălbatici au prezentat o varianță mai mare, împreună cu mai multe valori aberante comparativ cu eșantioanele captive și grupate împreună în funcție de originea lor (sălbatic vs captiv; Fig. 4). Aceste tipare au fost consistente atât pe indicii Jaccard, cât și pe cei de la Bray-Curtis. Mai mult, aceste modele au fost consistente între PathoScope (Fig. 4A, B) și rezultatele PhyloSift (Fig. 4C, D). Măsurile de diferențiere, măsurate separat cu indicii Bray-Curtis, Jaccard și Jensen-Shannon (JSD) cu 10.000 permutări, au fost toate foarte semnificative (PERMANOVA, p = 9.999e-05), reprezentative ale centroidelor fiind diferite între cele două grupuri . Acest lucru indică faptul că cele două grupuri au comunități distincte și diferite. Împreună, graficele de hirotonire și PERMANOVA au indicat că microbiomii rinocerilor erau mai asemănători cu alți rinoceri cu același statut de captivitate, rinocerii sălbatici afișând o variație și o gamă considerabil mai mare decât rinocerii captivi.

Bogăția și diversitatea OTU la nivel de eșantion PathoScope (indici Shannon și Simpson) ale populațiilor de rinoceri sălbatici și captivi.

Graficele de scalare multidimensionale non-metrice ale datelor PathoScope folosind distanțele Jaccard (A) și distanțele Bray-Curtis (B) și a datelor PhyloSift folosind distanțele Jaccard (C) și distanțele Bray-Curtis (D).

Analiza funcțională

Un total de 39 de termeni ai ontologiei genetice (GO) s-au dovedit a fi abundenți diferențial între microbiomii rinoceri sălbatici și captivi cu o valoare Q mai mică de 0,05 (Tabelul suplimentar S2). Majoritatea termenilor GO au fost asociați pozitiv cu microbiomii rinocerilor captivi. Un total de 127 de căi au fost abundente în mod diferit, însă doar două căi (PWY_5103 L_isoleucine_biosynthesis_III și PWY_6121 5_aminoimidazole_ribonucleotide_biosynthesis_I) au avut valori Q sub 0,05, probabil datorită dimensiunii reduse a eșantionului (Tabelul suplimentar S3). Microbiomii rinoceri captivi par să aibă o activitate mai mare pentru replicarea bacteriilor și producerea de aminoacizi. În plus, căile funcționale și termenii GO arată indicații privind disponibilitatea mai mare a amidonului în rinocerii captivi. Rinocerii sălbatici și captivi prezintă căi diferite, sugerând că între cele două grupuri are loc o activitate metabolică diferită.

Discuţie

Microbiomul intestinal joacă un rol cheie în sănătatea și bunăstarea animalelor, totuși nu există un consens cu privire la modul în care microbiomul intestinal s-ar putea schimba între animalele sălbatice și cele captive 4. La erbivore, populația bacteriană din intestin este implicată în descompunerea materialului vegetal fibros în diferiți metaboliți, inclusiv acizi grași cu lanț mic (SCFA) care exercită un impact semnificativ asupra sănătății gazdei. Studiile anterioare privind diversitatea microbiomului intestinal în sălbăticie comparativ cu animalele captive și-au limitat inferența la o singură genă pentru identificarea taxonilor bacterieni cunoscuți, care nu are lățimea genomică și profunzimea taxonomică disponibile prin metagenomica puștii. Aici valorificăm abordarea puternică metagenomică pentru a caracteriza și testa diferențele de diversitate alfa, diversitate beta și diversitate funcțională în microbiomul intestinal (fecal) al rinocerilor negri sălbatici și captivi, o specie pe cale de dispariție critică, cu scopul utilizării acestor informații. pentru a îmbunătăți sănătatea animalelor captive.

O proporție ridicată de bacterii identificate în probe fecale au fost conservate între rinoceri sălbatici și captivi, dar au fost de asemenea detectate diferențe care disting o schimbare semnificativă în comunitățile microbiene datorită captivității, așa cum s-a observat și în alte câteva studii de captivitate care utilizează secvențierea ampliconului 16S la mamifere 5,13, 14,15,16,17. Cu toate acestea, abordarea noastră metagenomică a dus la un număr mare de citiri de secvențiere neappărabile (

90%) din rinocerii negri, sugerând o lipsă de genomi bacterieni relevanți și cunoscuți în baza de date. Unul dintre marile avantaje ale abordării metagenomice este că puteți descoperi și cuantifica microbii necunoscuți, precum și cei cunoscuți, iar rezultatele noastre indică faptul că secvențierea țintită a ampliconului 16S lipsește o mare parte din diversitatea microbiană, dat fiind că 90% din citiri nu ar putea fi cartografiat la genomii de referință. Acest rezultat a fost validat pe trei platforme software diferite pentru caracterizarea diversității microbiomului, și anume PathoScope, Kraken și Centrifuge. Datorită lipsei semnificative a genomului microbian curatat și verificat din viața sălbatică din bazele de date genomice (de exemplu, NCBI's RefSeq), există o nevoie critică de a investiga aceste sisteme sub-studiate (de exemplu, viața sălbatică și dinamica sezonieră a diverselor lor microbiomi) pentru a reconstitui noi genomi pentru a identifica pe deplin organismele prezente în microbiomul lor. Identificarea microbilor necunoscuți din microbiomii faunei sălbatice va oferi întregii comunități de cercetare și sănătate a faunei sălbatice informațiile necesare pentru a caracteriza cu acuratețe și a modifica potențial microbiomul speciilor captive pentru a îmbunătăți sănătatea.

În timp ce nu am găsit nicio diferență semnificativă în diversitatea alfa a comunităților microbiene între populațiile sălbatice și captive de rinocer negru (ambele aveau un număr mare de specii microbiene), beta-diversitatea a fost semnificativ diferită sugerând că există comunități microbiene distincte în rinocerii negri sălbatici versus captivi . Rezultatele noastre au arătat o atribuire crescută a citirilor microbiene în probele captive la taxoni bacterieni asociați în mod tradițional cu intestinele rumegătoare (cum ar fi Ruminococcus albus, Selenomonas bovis, și Treponema bryantii), sugerând că necunoscuții (genomurile procariote care nu sunt prezente în RefSeq ale NCBI) microbii intestinali ai rinocerilor sălbatici au fost înlocuiți cu cei găsiți la animalele convenționale domestice. Această înlocuire ar putea fi parțial datorată rinocerilor care primesc o dietă similară cu vacile și caii sau cu oamenii cu care rinocerii captivi sunt adesea în contact. Rinocerii sălbatici par să urmeze un profil de microbiom mai aproape de animalele domestice mai sănătoase, cu o mai mare diversitate beta, diversitate funcțională și variație între rinocerii individuali comparativ cu rinocerii captivi 18 .

Cu foarte puține studii existente asupra microbiomului rinocerului, ruda lor cea mai apropiată, caii, poate fi utilizată ca sursă de comparație. Studiile anterioare pe cai sănătoși au arătat că Firmicutes sunt observate într-un raport mai mare comparativ cu Bacteroidetes 22, în timp ce proporții mai mari de Bacteriodetes sunt asociate cu colita 23. Cu toate acestea, există informații minime cu privire la incidența colitei la rinocerii captivi și justifică investigații suplimentare. În schimb, Proteobacteria a constituit al doilea cel mai abundent filu în omologii sălbatici. Deși Proteobacteria este considerată un microb de bază al erbivorelor 24, acest filum include, de asemenea, o mare varietate de agenți patogeni cunoscuți, cum ar fi Escherichia coli, Salmonella, Vibrio, Helicobactor și alții 25. Aceste descoperiri pot fi influențate de faptul că în rinoceri sălbatici se împărtășesc surse de apă (găuri de apă) care sunt adesea vizitate de numeroase alte specii. Nu este neobișnuit ca animalele să defeceze în aceste zone și, ca urmare, să contamineze apa cu alți microbi care, la rândul lor, ar putea să se stabilească în intestinul animalelor care consumă această apă.

O comparație a diversității funcționale în microbiomul rinocerului negru a demonstrat o abundență mai mare de căi de glicoliză și sinteză a aminoacizilor în captivitate comparativ cu omologii lor sălbatici, sugerând disbioză rezultată din dieta oferită în captivitate. Rinocerii negri captivi au prezentat, de asemenea, indicații privind disponibilitatea ridicată de amidon. Dietele de rinoceri captivi constau din

36% fibre de detergent neutre (NDF) și

25% fibre detergente acide (ADF) în produsele comerciale, 36-50% NDF și 28-39% ADF în fânul de lucernă și 49-69% NDF și 31-41% ADF în fânul de iarbă 26. Cea mai mare proporție a dietei provine din fân de lucernă și produse comerciale, ceea ce reprezintă un conținut mai scăzut de fibre decât ceea ce rinocerii sălbatici au fost observați consumând cu NDF variind de la 30-78% și ADF variind de la 14-59% 27. Ca atare, în comparație cu omologii lor captivi, microbiomul rinocerilor negri sălbatici conținea o proporție mai mare de bacterii implicate în descompunerea materialelor vegetale. Mai exact, am identificat proporții mai mari de Escherichia, Oscilibacter, Pseudobutyrivibrio, și Treponema în rinoceri negri sălbatici. Se știe că toate aceste taxe sunt implicate în defalcarea fibrelor. În plus, Pseudobutyrivibrio sunt implicați în producția de butirat, care, de asemenea, a fost raportată a fi mai mare la animalele sănătoase, prin susținerea papilelor mai sănătoase în intestin 28. Acetatul, butiratul și propionatul SCFA sunt importante în mai multe aspecte fiziologice ale achiziției nutrienților gazdei, funcției imune, semnalizării celulare și protecției agenților patogeni 29 .

Materiale și metode

Declarație privind utilizarea animalelor

Toate animalele au fost prelevate în mod oportunist în timpul eforturilor de translocare de rutină din Africa de Sud sau în timpul evaluărilor de sănătate de rutină din Statele Unite. Prin urmare, nu a fost necesară aprobarea instituțională pentru îngrijirea și utilizarea animalelor.

Colectie

Cele opt probe de fecale captive au fost depozitate congelate (-80 ° C) până la extracția ADN-ului. Opt din cele 17 mostre sălbatice au fost transportate la Universitatea Stellenbosch din Africa de Sud pentru extracția ADN-ului și expediate în Statele Unite ca ADN genomic purificat. Pentru celelalte nouă mostre de fecale sălbatice, între 1-2 grame de fecale au fost depozitate în ADN/ARN Shield (Zymo Research, SUA) și transportate în Statele Unite. Aceste probe au fost, de asemenea, depozitate congelate (-80 ° C) până când s-a încercat extragerea ADN-ului.

Extracția ADN și secvențierea metagenomică

Analize bioinformatice

Data disponibilității

Datele de secvențiere de generație următoare asociate acestui studiu au fost depuse în GenBank sub aderarea SRA: PRJNA532626.