Abstract

  • AGRP, peptidă legată de agouti
  • BAT, țesut adipos maro
  • CART, transcriptă reglementată de cocaină și amfetamină
  • CRH, hormon care eliberează corticotropină
  • DIO, obezitate indusă de dietă
  • MCH, hormon care concentrează melanina
  • NPY, neuropeptidă Y
  • POMC, proopiomelanocortină
  • PVN, nucleu paraventricular
  • UCP, proteine ​​de decuplare

Echilibrul energetic implică o interacțiune complexă între hormoni, cum ar fi leptina, insulina și glucocorticoizii și neuronii cheie din hipotalamus, trunchiul cerebral și alte zone ale sistemului nervos central (1). Neuropeptida Y (NPY) este exprimată în hipotalamus, stimulează consumul de alimente, scade consumul de energie și mărește greutatea corporală atunci când este administrată în creier (1). În concordanță cu rolul său de peptidă orexigenică, expresia hipotalamică NPY este crescută în timpul postului și al hipoglicemiei și suprimată prin hrănire, leptină și insulină (1). În ciuda dovezilor farmacologice puternice care susțin rolul său în echilibrul energetic, întreruperea genetică a NPY nu a afectat hrănirea sau greutatea corporală la șoarecii crescuți pe un fond mixt 129J-C57Bl/6J (2). Paradoxal, ștergerea NPY sau a receptorilor Y1 și Y5 care mediază efectele NPY asupra echilibrului energetic au dus la obezitate ușoară (3-6). Cu toate acestea, pierderea hiperfagiei și obezității NPY atenuate la șoarecii Lep ob/ob (7). Alții au arătat, de asemenea, că deficitul de NPY scade hiperfagia după post și hipoglicemie (8-10). Mai mult, ștergerea receptorilor NPY Y2/Y4 previne obezitatea indusă de dietă (DIO) (11).

atenuează

Am argumentat că controversele legate de acțiunile NPY în aceste modele genetice se datorează parțial utilizării tulpinii de șoarece de 129, care este rezistentă la obezitate (12). Fenotipul aparent normal al șoarecilor cu deficit de NPY ar putea rezulta și din schimbări compensatorii de dezvoltare. De exemplu, ablația neuronilor hipotalamici care exprimă NPY/AGRP nu a modificat hrănirea la șoarecii neonatali, în timp ce ablația la adulți a provocat foamete (13,14). AGRP este coexprimat cu NPY în nucleul arcuat și ambele peptide stimulează hrănirea și creșterea în greutate (1.15). Este posibil ca AGRP să crească atunci când lipsește NPY, menținând astfel capacitatea de a se hrăni. Alternativ, peptidele anorexigenice, de exemplu, proopiomelanocortina (POMC) și transcriptul reglementat de cocaină și amfetamină (CART), pot fi reduse la șoarecii cu deficit de NPY, prevenind astfel pierderea în greutate. Am emis ipoteza că importanța NPY în homeostazia energetică ar fi evidentă la șoarecii C57Bl/6J predispuși la obezitate (12,14).

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Studiile au fost realizate în conformitate cu liniile directoare și reglementările Comitetului de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Pennsylvania. Șoarecii crescători Npy +/− pe un fundal mixt 129SvEv-C57Bl/6J au fost furnizați de Richard Palmiter (Universitatea din Washington, Seattle, WA) și au fost retro-încrucișați timp de 10 generații pe fundalul C57BL/6J, The Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME ). Heterozigoții au fost apoi crescuți unul cu celălalt pentru a genera șoareci NPYko și martori de tip sălbatic (2,3). Genotipurile au fost confirmate prin PCR așa cum s-a descris anterior (3). Șoarecii au fost înțărcați la 3 săptămâni, au adăpostit cinci pe cușcă la 22 ° C cu 12 ore cicluri lumină-întuneric (luminile aprinse la 0600) și au fost hrăniți cu o dietă de rozătoare conținând 4,5% grăsimi, 49,9% carbohidrați, 23,4% proteine, 4 kcal/g (Labdiet nr. 5001; Labdiet, Richmond, IN) (16).

Studii de post și realimentare.

Șoarecii cu vârsta de 10 săptămâni au fost adăpostiți individual în cuști calorimetrice și au fost obișnuiți timp de 3 zile. S-a măsurat greutatea corporală, s-a introdus o cantitate pre-cântărită de alimente la 0900, iar consumul de oxigen (V o 2) și producția de dioxid de carbon (V co 2) au fost măsurate la intervale de 15 minute folosind următorii parametri: debit de aer 0,5 l, probă 0,4 l, timpul de stabilire 120 s și timpul de măsurare 60 s (Oxymax EqualFlow System; Columbus Instruments, Columbus, OH) (16,17). Șoarecii au fost hrăniți ad libitum timp de 48 de ore sau lipsiți de hrană timp de 48 de ore sau alimentați 48 de ore. Calorimetria indirectă a fost efectuată pe tot parcursul, cu excepția cazului în care alimentele au fost îndepărtate sau înlocuite. Activitatea locomotorie a fost evaluată simultan cu ajutorul razelor foto (Optovarimex; Columbus Instruments). NPYko și șoarecii de tip sălbatic hrăniți, posti sau refidați după cum s-a descris au fost uciși; sângele a fost obținut prin puncție cardiacă, iar țesutul adipos maro (BAT) și hipotalamia au fost excizate rapid, congelate în azot lichid și depozitate la -80 ° C.

Toleranță la frig.

Temperatura rectală a fost măsurată la temperatura camerei (timp 0) la șoareci de sex sălbatic de 10 săptămâni și NPYko masculi folosind un termistor (model YSI 4600) (16), după care șoarecii au fost adăpostiți la 4 ° C timp de 6 ore.

Hibridizare in situ.

Șoarecii NPYko și de tip sălbatic au fost anesteziați cu pentobarbital de sodiu la 0900–1100 și perfuzați transcardic cu dietil pirocarbonat tratat cu PBS urmat de 10% formalină tamponată neutră. Creierele au fost excizate, postfixate peste noapte și crioprotejate în zaharoză. NPY, AGRP, POMC, hormonul de concentrare a melaninei (MCH) și expresia ARNm a hormonului de eliberare a corticotropinei (CRH) au fost detectate pe secțiuni coronare (20 μm) folosind ribopobe specifice așa cum este descris (18,19).

NPYko și șoarecii de tip sălbatic au fost hrăniți cu o dietă normală de chow (4,5% grăsimi, 49,9% carbohidrați, 23,4% proteine, 4 kcal/g; Labdiet nr. 5001; Labdiet) sau o dietă bogată în grăsimi (45% grăsimi, 35% carbohidrați, 20% proteine, 4,7 kcal/g; Research Diets Nr. D12451; Research Diets, New Brunswick, NJ) de la vârsta de 4 săptămâni (16). Greutatea corporală a fost măsurată săptămânal. Aportul alimentar și compoziția corpului (absorptiometrie cu raze X cu dublă emisie) și cheltuielile de energie au fost măsurate la 4, 8 și 16 săptămâni (16,20). Frecvența de alimentare (pauzele fasciculului) a fost evaluată utilizând sistemul Vitalview (Minimitter, Bend, OR). Dietele au fost furnizate în hrănitoare echipate cu fascicule de lumină, iar activitatea de hrănire a fost analizată utilizând software-ul Actiview (www.minimitter.com/Products/VitalView/index.html). Șoarecii au fost uciși la 0900–1200 a doua zi, sângele a fost prelevat prin puncție cardiacă și hipotalamii au fost recoltați.

Chimia țesuturilor.

Nivelurile serice de glucoză, trigliceride, colesterol și acizi grași neesterificați au fost măsurate folosind teste colorimetrice (Stanbio, Boerne, TX; Wako Chemicals, Richmond, VA) (16,17,21). Insulina și leptina au fost măsurate prin test imunosorbent legat de enzime (CrystalChem, Chicago, IL). Corticosteronul și tiroxina au fost măsurate prin radioimunotest (16,17,21). Exprimarea proteinei de decuplare (UCP) -1 a nivelului ARNm în BAT a fost măsurată prin Northern blot (17). Nivelurile de ARNm de neuropeptidă hipotalamică au fost măsurate utilizând PCR în timp real și normalizate la fosfoproteină ribozomală (16,17).

Statistici.

Efectele deficienței NPY asupra diferiților parametri au fost analizate prin testul ANOVA și diferența protejată cel mai puțin protejată (PSLD) a lui Fisher. Analiza de regresie a fost efectuată pe variabile continue. O valoare P o 2) a fost mai mică decât cea nocturnă atât la șoarecii de tip sălbatic, cât și la șoarecii NPYko (Fig. 2A). V o 2 a scăzut semnificativ cu 40-50% (P o 2 la șoarecii de tip sălbatic a corespuns unei reduceri drastice a expresiei BAT UCP-1 (Fig. 2D).

Spre deosebire de șoarecii de tip sălbatic, V o 2 a rămas crescut la șoarecii NPYko post și refed (Fig. 2A - C). Mai mult, expresia BAT UCP-1 nu a căzut la șoarecii NPYko posti (Fig. 2E). În schimb, șoarecii de tip sălbatic și NPYko au menținut temperatura corpului în timpul expunerii la frig (Fig. 2F). Deficitul de NPY nu a afectat activitatea locomotorie în timpul postului sau al alimentării (datele nu sunt prezentate). Așa cum a fost cazul la șoarecii de tip sălbatic, nivelul glucozei, insulinei, leptinei, tiroxinei și trigliceridelor a scăzut, iar corticosteronul a crescut la șoarecii NPYko la post (Tabelul 1). Aceste modificări au fost inversate după realimentare (Tabelul 1).

Am stabilit dacă deficitul de NPY va afecta nivelurile de neuropeptide hipotalamice implicate în homeostazia energetică (1). Exprimarea AGRP a fost limitată la nucleul arcuat atât la șoareci de tip sălbatic, cât și la șoareci NPYko (Fig. 3A și B). Cu toate acestea, nivelurile de ARNm de AGRP au fost de două ori mai mari la NPYko decât șoarecii de tip sălbatic (Fig. 3A - D). AGRP a fost crescut prin post și suprimat prin realimentare la șoareci de tip sălbatic (Fig. 3C). În schimb, nu au existat modificări evidente ale nivelurilor de ARNm AGRP în timpul postului sau al alimentării la șoareci NPYko (Fig. 3D). Distribuțiile POMC, CRH și MCH nu au fost modificate de deficiența NPY (datele nu sunt prezentate). Expresia POMC a scăzut ca răspuns la postul atât la șoareci de tip sălbatic, cât și la șoareci NPYko și a crescut după realimentare (Fig. 3E și F). MCH a crescut și CART a scăzut la șoarecii de tip sălbatic și NPYko la post, iar aceste modificări au fost inversate prin realimentare (datele nu sunt prezentate).

Deficitul de NPY atenuează DIO la șoarecii C57Bl/6J.

Șoarecii NPYko de sex masculin și feminin au prezentat reduceri semnificative ale greutății corporale și ale conținutului de grăsime pe o dietă bogată în grăsimi (Fig. 1A - D). Greutatea corporală a fost semnificativ mai mică la șoarecii masculi cu conținut ridicat de grăsimi NPYko cu 12 săptămâni și la șoarecii femele NPYko cu 16 săptămâni, comparativ cu șoarecii cu conținut ridicat de grăsimi de tip sălbatic (P o 2 a fost, de asemenea, mai mare la șoarecii cu conținut ridicat de grăsimi NPYko (3.778 ± 66 ml · kg −1 · h −1) decât șoarecii cu conținut ridicat de grăsimi de tip sălbatic (3.415 ± 48 ml · kg −1 · h −1) (nivelul P o 2 a rămas ridicat la șoarecii NPYko la post și a fost strâns paralel cu o creștere a BAT UCP- Interesant, deficitul de NPY nu a afectat temperatura corpului în timpul expunerii la frig, sugerând că NPY joacă un rol critic în răspunsul termoreglator la post, dar nu la stresul la rece.

Ablația unei neuropeptide poate modifica expresia altor neuropeptide, după cum se arată prin creșterea expresiei NPY în nucleul dorsomedial atunci când receptorul MC4 este perturbat (28). Am constatat că expresia AGRP a fost limitată la nucleul arcuat, dar nivelurile au fost semnificativ crescute la șoarecii NPYko, sugerând o compensare a dezvoltării pentru deficitul de NPY. Pe de altă parte, distribuțiile și nivelurile POMC, CRH și MCH nu au fost modificate la șoarecii NPYko. Astfel, propunem că greutatea aparent normală a șoarecilor NPYko în condiții hrănite ad libitum se datorează cel puțin parțial acțiunii orexigenice a AGRP. Cu toate acestea, AGRP nu a reușit să crească mai mult în timpul postului la șoarecii NPYko, ceea ce poate explica de ce hiperfagia postfastă și recuperarea greutății au fost atenuate la șoarecii NPYko.

Acest studiu evidențiază importanța fundalului genetic în obezitate, diabet și anomalii ale lipidelor (12,19,26,27). În timp ce tulpina C57Bl/6J este extrem de susceptibilă la hiperfagie, obezitate, rezistență la insulină și diabet, tulpina 129 utilizată în mod obișnuit pentru experimentele knockout genetice este rezistentă la obezitate (33-35). După cum am prezis, acțiunea orexigenă a NPY a devenit evidentă în tulpina C57Bl/6J, care este susceptibilă de obezitate. Deficitul de NPY a atenuat hiperfagia și creșterea în greutate la șoareci la post și DIO C57Bl/6J. Propunem că NPY este o componentă importantă a „genotipului economisitor” care optimizează stocarea energiei. În timpul postului, NPY va acționa probabil împreună cu alte peptide hipotalamice pentru a reduce consumul de energie, pentru a stimula pofta de mâncare și pentru a umple stocarea de energie. Acest răspuns adaptiv a semnalat, cel puțin parțial, prin scăderea nivelului de leptină și insulină și ar fi putut evolua ca o protecție împotriva amenințării înfometării (1.36). Pe de altă parte, NPY ar putea predispune la obezitate la persoanele susceptibile genetic stimulând consumul de alimente și reducând cheltuielile de energie atunci când alimentele sunt abundente.