Ellie Spahr

Divizia de Științe a Plantelor și a Solului, Universitatea West Virginia, Morgantown, Virginia de Vest, Statele Unite ale Americii

Matt T. Kasson

Divizia de Științe a Plantelor și a Solului, Universitatea West Virginia, Morgantown, Virginia de Vest, Statele Unite ale Americii

Teiya Kijimoto

Divizia de Științe a Plantelor și a Solului, Universitatea West Virginia, Morgantown, Virginia de Vest, Statele Unite ale Americii

Date asociate

Abstract

Introducere

Cultivarea ciupercilor, probabil cel mai cunoscut exemplu de simbioză mediată de ciuperci, a evoluat în mai multe linii de insecte, fie ca sursă unică de nutriție, fie pentru a completa nevoile dietetice [4]. Ecologia și evoluția creșterii ciupercilor au fost studiate pe larg în cadrul himenopterilor (furnicilor), Blattodea (termitelor) și Coleopterelor (gândacilor) [4, 5]. La furnici și termite, micofagia a evoluat o singură dată și a iradiat spectaculos ducând la diversele clade existente care există astăzi [6, 7]. Spre deosebire de furnici și termite, gândacii au dezvoltat simbioze nutriționale cu ciuperci de mai multe ori în ordinea coleopterelor [6, 8].

Gândacii de ambrozie reprezintă două sub-familii de gărgărițe (Curclionidae: Scolytinae, Platypodinae) care mențin mutualisme nutriționale obligatorii. În simbioza ambroziei, simbiozele nutriționale obligatorii au evoluat în paralel cu aproximativ 11 origini independente ale creșterii ciupercilor. Fiecare relație a coincis cu o origine independentă a structurilor specializate (micangia) pentru a transporta propagule simbiotice în interiorul sau pe corpul insectelor [5, 8, 9]. Aceste structuri se dezvoltă intern sau extern de-a lungul capului, toracelui și abdomenului și pot varia de la gropi de mică adâncime în exoschelet până la saci complexi sau structuri tubulare [9]. Unele micangii au arătat dovezi ale celulelor glandulare, dar categorizarea în profunzime a potențialei funcții secretoare nu a fost investigată în profunzime la nivelul micangiei [10, 11]. În plus, studiile anatomice aprofundate ale speciilor de gândaci singuri de-a lungul etapelor vieții sau ale sexului nu au fost niciodată investigate formal.

Gândacii Euwallacea ambrosia au primit o atenție semnificativă în ultimul deceniu din cauza pagubelor pe care le cauzează unei varietăți de copaci din habitate invadate din întreaga lume, inclusiv Israel, Australia, Mexic, Statele Unite și, mai recent, Africa de Sud [12-15] . Originar din Asia, acești gândaci au cauzat daune grave producției de avocado la nivel mondial și au afectat numeroase gazde de plante lemnoase atât în ​​mediul cultivat, cât și în cel forestier [16]. O specie de interes deosebit, Euwallacea validus, introdusă din Asia în estul Statelor Unite la sfârșitul anilor 1900 [17], posedă micangie orală pereche și vector două specii fungice; simbolul nutrițional primar Fusarium oligoseptatum și Raffaela subfusca, o ciupercă secundară recuperată în mod constant din capetele de sex feminin din populațiile introduse din estul SUA, dar al căror rol rămâne neclar [13, 18].

Gândacii xyleborini - inclusiv Euwallacea spp. - se reproduc prin împerechere haplodiploidă sib [19]. La fel ca în sistemele tipice de reproducere haplodiploidă, femelele diploide fertilizează selectiv ouăle pentru a genera descendenți femele, în timp ce ouăle haploide nefertilizate dau naștere la descendenți masculi care se vor împerechea cu frații lor în tunelul galeriei [20]. Gândacii feminini joacă roluri majore în medierea simbiozei cu F. oligoseptatum prin dispersarea acestora între copacii gazdă, în timp ce masculii au dimensiuni reduse și sunt fără zbor; funcția din cadrul galeriei este relegată la reproducere și, eventual, la întreținerea fungilor [20].

Până în prezent, micangia orală asociată a fost descrisă la femela adultă Xyleborini utilizând atât tehnici de secțiune distructive, cât și nedistructive. Investigații cu secțiune transversală microtomică (o metodă distructivă), cum ar fi raportul Xyleborus glabratus de Fraedrich și colab. (2008), Xyleborus affinis de Hulcr și Cognato (2010) și Ambrosiodmus lecontei de Li și colab. (2015) au dezvăluit organizarea structurală de bază și au confirmat prezența propagulilor fungici [21-23]. Investigații structurale mai detaliate ale micangiei la Xyleborini și taxoni strâns înrudiți (Premnobiina) s-au bazat pe metodologia microtomului folosind tehnici de imagistică nedistructive emergente. Micangia Ambrosiodmus lecontei, A. minor, Ambrosophilus atratus, Premnobius cavipennis și Euwallacea interjectus au fost observate în mai multe metode (microtom, scanare LAT și μCT) [24, 25].

tabelul 1

Euwallacea sp. Locație specifică în headEvidenceOrientation (s) Referință
E. fornicatusMedial superiorColorarea GFP Freeman și colab. 2016 [29]
E. interjectusLateral inferiorMicroCTtransvers & sagitalJiang și colab. 2019 [30]
E. interjectusMedial superiorLATscantransversalLi și colab. 2018 [25]
E. perbrevisMedial superiorIlustraretransvers & sagitalFernando 1960 [26]
E. sp.Medial superior și lateral inferiorDescriptivn/AGoto 1998 [28]
E. validusMedial superiorSecțiunea de microtomindeterminabilNakashima 1982 [27]
E. validusMedial superiorSecțiunea de microtomtransversalKasson și colab. 2013 [13]

Aici, prin integrarea a două tehnici imagistice (secțiunea transversală tradițională a microtomului și μCT) ale întregului cap, obiectivul nostru este să îmbogățim cunoștințele despre dezvoltarea micangiană pe parcursul etapelor vieții gândacilor, precum și între sexe. În special, ne-am concentrat pe examinarea momentului de dezvoltare, precum și a unei posibile dezvoltări sexuale specifice a micangiei în E. validus. Astfel de studii sunt, de asemenea, importante în Xyleborini deoarece; 1) studiile anterioare au avut tendința să se concentreze pe confirmarea unei singure perechi de micangie, oferind doar o secțiune transversală parțială sau unică a capului femeilor adulte, cu vedere posibilă la prezența structurilor secundare; și 2) mai multe Euwallaea spp. au dat mai mult de o ciupercă cu abundențe similare din micangia lor [13, 31] crescând posibilitatea co-cultivării într-o singură micangie sau structuri specializate adaptate pentru fiecare simbiont [32].

Materiale și metode

Protocol de creștere

Metodele de creștere au fost adaptate de la Cooperband și colab. (2016) [33] pentru a ține cont de preferința regională a gazdei (Ailanthus altissima) a speciei țintă de gândaci ambrozi, Euwallacea validus. Membrele Ailanthus altissima au fost tăiate și colectate din campusul Evansdale al Universității West Virginia din Morgantown, Virginia de Vest. Membrele au fost tăiate în secțiuni transversale lungi de 2,5 cm și uscate la temperatura camerei timp de câteva săptămâni. Materialul membrelor uscate a fost măcinat până la dimensiunea particulelor de rumeguș trapezoidal de 1 mm pentru mediile de creștere a gândacului utilizând o pulverisetă 25 de fabrică de tăiere Fritsch Power (Fritsch GmbH, Germania). Agar de rumeguș sterilizat așa cum este descris de Cooperband și colab. (2016) [33] a fost preparat în tuburi Falcon de 50 ml.

Gândacii au fost preluați din tulpinile infestate de Ailanthus altissima din pădurea Universității din Virginia de Vest, la sfârșitul primăverii (iunie). Tulpinile au fost tăiate în secțiuni de 0,6 m și împărțite longitudinal în sferturi de secțiuni pentru a dezvălui tunelurile galeriei. Gândacii din toate etapele vieții au fost colectate din galerii prin forță mecanică și recuperate folosind apă sterilă și perii de vopsea sau pensă cu aderență moale. Etapele vieții au fost stocate separat. Gândacii au fost apoi transferați în medii neinoculate și au furnizat tuneluri „starter” de-a lungul exteriorului tubului. Au fost introduse 5 gândaci femele adulte și până la încă 3 masculi pe tub de mediu și adăpostite într-un incubator la 26 ° C.

Stadializarea animalelor

Pupele au fost puse în scenă și selectate pe baza colorării capsulei și a elitrelor (Fig. 1). Femelele adulte au fost puse în scenă prin colorarea corpului (Fig. 4); culoarea se referă la gradul de sclerotizare a exoscheletului și estimează maturitatea adulților post-mutare.

permite

Denumirile „tardive” și „timpurii” au fost făcute pe baza colorării capsulelor capului și a elitrelor. Animalele apropiate de eclosiune apar mai întunecate pe tot corpul pupal.

Cutiile albastre indică micangia superioară medială, în timp ce cutiile roșii denotă pungile laterale inferioare. A-D) Vedere exterioară a secțiunilor transversale superioare (E-H). I-L) Secțiunile transversale sagittale dezvăluie micangia superioară și pungile inferioare la gandacii femele pupa târzie (K) și adultă (L). M, N) Secțiunea transversală inferioară ilustrează pungi inferioare împerecheate în gandacii femele din pupa târzie (M) și adult (N).

Tomografie micro-computerizată

Euwallacea validus a fost fixată în etanol 70% la temperatura camerei cel puțin peste noapte. Insectele au fost apoi colorate peste noapte în soluție de Lugol 5% (I3K), modificată de la Metscher și colab. (2009) [34] pentru iod în petele de iodură de potasiu.

Scanarea a fost efectuată folosind Skyscan 1272 μCT (Bruker). Probele au fost scanate în etanol în vârfurile de pipetă de 200 μL montate pe suport. Parametrii de scanare au fost unificați pentru toate eșantioanele (2x2 binning la dimensiunea pixelilor de 4,3 μm, fără filtru. Sursa de raze X setată la 50 kW și 200 μA). Datele de scanare au fost compilate folosind NRecon (versiunea 1.7.1.0) și decupate în Dataviewer (versiunea 1.5.3.4). Secțiunile transversale digitale și videoclipurile au fost capturate din modelul 3D în CTVox (versiunea 3.3). Filmul capturat detaliat este disponibil ca film suplimentar (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12221981.v1).

Secțiunea transversală a microtomului

Probele au fost fixate în PFA 2% peste noapte și înmuiate în fenol timp de 6 zile înainte de încorporarea parafinei și secțiunea transversală (așa cum a fost modificat din Li și colab. 2015) [23]. Înainte de încorporarea parafinei, insectele au fost re-fixate cu formaldehidă apoi deshidratate într-o serie cu gradient de etanol. Probele au fost depozitate până la secționare. Secțiunile transversale au fost prelevate folosind un microtom rotativ Microm HM 325 (Walldorf, Germania) și diapozitive colorate manual în hematoxilină Harris și eozină-floxină. Diapozitivele au fost realizate cu ajutorul unui microscop compus Nikon Eclipse E600 (Nikon Instruments, Melville, NewYork) și a unei camere microscop Nikon Digital Sight DS-Ri1 de înaltă rezoluție prin intermediul software-ului de imagine Nikon NIS-Elements BR 3.2.

Rezultate

Descriere detaliată a micangiei femele adulte

Gândacii femele adulte prezintă două perechi de pungi orale (în toate cele cinci insecte femele adulte prelevate). Primul set este organizat superomedial la mandibule în țesutul cefalic (rostral) (Fig. 2A, 2B și 2C). A doua pereche este organizată lateral, inferior părții posterioare a mandibulei, lângă fiecare ochi compus (Fig. 2A, 2B și 2D, vezi și filmul suplimentar; https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12221981.v1) . Secțiunea transversală a microtomului a dezvăluit colonizarea interioară a ambelor buzunare mediale superioare (Fig 3C) și pe partea laterală a capului în apropierea ochiului (Fig 3F) ca echivalent cu structurile inferioare asemănătoare pungii din imaginile noastre μCT. Celulele coloane aliniază membrana primară a structurilor laterale asemănătoare pungii (S1B și S1C Fig). Structurile asemănătoare conductelor (S1A, S1B și S1E Fig) sunt prezente lângă cameră, dar nu am observat legătura fizică între aceste caracteristici între secțiunile pe care le-am generat. Secțiunile de microtomi au indicat în plus că gândacii dezvoltă coloane mici și structuri asemănătoare părului în conductă (S1A, S1B, S1D și S1E Fig). Celule columnare similare care căptușesc pungile laterale împreună cu structuri periferice asemănătoare canalelor și părului pot fi văzute în micangia laterală a genurilor de gândaci strâns înrudite, precum și în triburile mai îndepărtate (S2 Fig) [24, 35].

Căsuțele albastre indică micangia mediană superioară (C), în timp ce cutiile roșii indică structura laterală inferioară (D). Plan de vizualizare pentru fiecare structură asociată (C, D) notată prin culoarea corespunzătoare (E).