Abstract

  • BAT, țesut adipos maro
  • FFA, acid gras liber
  • PEPCK, fosfoenolpiruvat carboxicinaza
  • PGC, coactivator PPAR-γ
  • PPAR, proliferator de peroxizom - receptor activat
  • TZD, tiazolidindionă
  • UCP, proteine ​​de decuplare
  • WAT, țesut adipos alb

Obezitatea este o problemă majoră de sănătate în societățile occidentale. Această modificare a funcțiilor metabolice și endocrine ale țesutului adipos este frecvent asociată cu rezistența la insulină și diabetul de tip 2. Nu este clar modul în care masa mărită a țesutului adipos duce la rezistența la insulină la nivelul ficatului și mușchilor și la hipersecreția insulinei pancreasului. Țesutul adipos secretă mai multe proteine ​​numite adipocitokine care pot influența metabolismul glucozei și sensibilitatea la insulină și leagă creșterea adipozității și rezistenței la insulină (1,2). Cu toate acestea, excesul de acizi grași liberi (FFA) eliberați de țesutul adipos în obezitate poate fi, de asemenea, responsabil pentru dezvoltarea rezistenței la insulină (3-7). Creșterile nivelurilor de FFA plasmatice diminuează extracția insulinei de către ficat și sporesc gluconeogeneza hepatică (4,7). La nivelul mușchilor, rata crescută de oxidare a grăsimilor afectează eliminarea glucozei mediată de insulină, inhibând oxidarea glucozei și sinteza glicogenului (3). Mai mult, rezistența la insulină este asociată cu stimularea proliferării celulelor β și a secreției de insulină (6).

adipoasă

Acizii grași eliberați în sânge rezultă din diferența dintre hidroliza trigliceridelor din adipocite în timpul lipolizei și reutilizarea FFA de către celulele adipoase printr-un ciclu inutil de reesterificare denumită (8,9). Țesutul adipos tamponează fluxurile de lipide prin suprimarea eliberării de FFA și creșterea clearance-ului trigliceridelor (10). Cu toate acestea, în obezitate, afectarea acestei acțiuni de tamponare poate contribui la acumularea de trigliceride în ficatul, mușchiul scheletic și celulele β pancreatice, care la rândul lor pot duce la rezistență la insulină (10).

Tiazolidindionele (TZD), activatori specifici ai proliferatorului peroxizomului - receptor activat (PPAR) -γ, îmbunătățesc sensibilitatea la insulină la pacienții cu diabet zaharat de tip 2 (11). TZD au un efect antidiabetic direct asupra metabolismului glucozei la nivelul mușchilor scheletici și al ficatului (12). În plus, TZD-urile cresc sensibilitatea la insulină prin creșterea capacității de stocare a lipidelor a țesutului adipos și reducerea nivelurilor circulante de FFA și trigliceride (13). TZD-urile scad eliberarea de acizi grași din țesutul adipos prin creșterea reesterificării FFA prin inducerea atât a fosfoenolpiruvatului carboxicinazei (PEPCK), o enzimă de reglare a gliceroneogenezei, cât și a glicerol kinazei.

Creșterea gliceroneogenezei la șoarecii transgenici care supraexprimă PEPCK în țesutul adipos duce la creșterea reesterificării FFA; dimensiunea mai mare a adipocitelor, masa grasă și greutatea corporală; și scăderea FFA circulante (16). Mai mult, în ciuda obezității, se păstrează toleranța la glucoză și sensibilitatea la insulină a întregului corp (16). Acest lucru sugerează că obezitatea fără FFA crescute în circulație nu duce la rezistență la insulină sau diabet de tip 2. Astfel, am examinat acești șoareci transgenici pentru a determina dacă reesterificarea FFA crescută contracarează rezistența la insulină indusă de o dietă bogată în grăsimi. După 6 săptămâni pe această dietă, șoarecii transgenici au câștigat mai multă greutate corporală și au prezentat o intoleranță mai pronunțată la glucoză și rezistență la insulină decât șoarecii de control. Astfel, în mod paradoxal, supraexpresia PEPCK determină sensibilitate la insulină pe o dietă normală, dar rezistența la insulină pe o dietă bogată în grăsimi.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Tratamentul șoarecilor.

Analiza ARN.

ARN-ul total a fost obținut din WAT și BAT utilizând reactiv de izolare Qiazol (Qiagen, Hilden, Germania). ARN-urile au fost separate prin electroforeză pe un gel de agaroză 1% conținând 2,2 mol/l formaldehidă. Bloturile nordice au fost hibridizate cu 32 de sonde PEPCK, PGC-1α, PPAR-γ, 18S rRNA și UCP-1 cADN (17-20).

Detectarea proteinelor prin Western blot.

Analiza Western blot a fost efectuată prin proceduri standard din omogenatele celulare totale de WAT și BAT (21). Țesuturile au fost omogenizate într-un tampon conținând 20 mmol/l HEPES pH 7,9, 25% (vol/vol) glicerol, 420 mmol/l NaCI, 10 mmol/l KCl, 0,5 mmol/l ditiotreitol, 1,5 mmol/l MgCl2, 0,2 mmol/l EDTA, 0,5 mmol/l fluorură de fenilmetilsulfonil, 20 μmol/l leupeptină, 20 μmol/l pepstatin, 20 μmol/l aprotinină, 50 mmol/l NaF și 2 mmol/l vanadat de Na. Probele au fost centrifugate (15.000 g) și o alicotă a supernatantului a fost testată pentru concentrația de proteine ​​prin metoda Bradford, așa cum este descris de producător (testul proteinei Bio-Rad; Bio-Rad, Hercules, CA). Douăzeci și cinci de micrograme de proteină au fost analizate cu SDS-PAGE 10% și transferate în membranele de nitroceluloză. Proteinele au fost detectate folosind anticorp policlonal anti-PPAR-γ coactivator (PGC) -1 (Chemicon International, Temecula, CA) anticorp diluat 1: 2.000, anticorp policlonic anti-decuplare (UCP) -1 (Abcam, Cambridge, UK) diluat 1: 1.000 și iepure policlonal anti-piruvat carboxicinază (PCK) -1 (Abgent, San Diego, CA) diluat 1: 500.

Analize enzimatice, metabolite și hormonale.

Conținutul de trigliceride tisulare a fost determinat prin extragerea lipidelor totale din probe de ficat și BAT cu cloroform-metanol (2: 1 vol/vol) așa cum s-a descris anterior (22), separând fazele de cloroform și metanol-apă. Trigliceridele au fost apoi cuantificate spectrofotometric folosind un kit de testare enzimatică (GPO-PAP; Roche Diagnostics, Basel, Elveția). Glucoza a fost măsurată enzimatic (Glucoquant; Roche Diagnostics) în ser. Glucoza a fost, de asemenea, determinată în 5 μl de sânge utilizând un analizor Glucometer Elite (Bayer, Leverkusen, Germania). Trigliceridele serice au fost determinate enzimatic (GPO-PAP). FFA-urile au fost măsurate în ser prin metode acil-CoA sintază și acil-CoA oxidază (Wako Chemicals, Neuss, Germania). Nivelurile serice de insulină au fost măsurate prin radioimunotest (CIS Biointernational, Gif-Sur-Yvette, Franța). Concentrația de leptină a fost determinată în 5 μl de ser folosind un kit de testare imunoabsorbant legat de enzime (Crystal Chemical, Chicago, IL) urmând instrucțiunile producătorului. Nivelurile serice de adiponectină au fost măsurate prin radioimunotest (Linco, St. Charles, MO).

Teste de toleranță la glucoză și insulină.

Pentru testele de toleranță la glucoză, șoarecii de control trezit și transgenici au postit peste noapte (16 ore) cu acces gratuit la apă și li s-a administrat o injecție intraperitoneală de glucoză (1 g/kg corp greutate). Probele de sânge au fost obținute din vena cozii înainte de injecția de glucoză și la momentele indicate după încărcarea de glucoză, iar concentrația de glucoză a fost măsurată. Pentru testele de toleranță la insulină, insulina (0,75 UI/kg corp greutate; Humulin Regular; Eli Lilly, Indianapolis, IN) a fost injectată intraperitoneal la șoareci de control alimentați treaz și la șoareci transgenici. Concentrația de glucoză a fost determinată în probele de sânge obținute din vena cozii la momentele indicate după injectarea insulinei.

Analiza histologică.

Tamponul de grăsime epididimal, BAT interscapulară și ficatul de la șoareci martori și transgenici au fost fixați timp de 12-24 ore în formalină, încorporate în parafină și secționate. Secțiunile au fost colorate cu hematoxilină/eozină. Pentru cuantificarea dimensiunii adipocitelor, secțiunile au fost vizualizate cu un microscop Nikon Eclipse E800 (Nikon, Tokyo, Japonia) la o mărire de 10 ×. Imaginile au fost obținute cu o cameră video conectată la un monitor color și la un analizor de imagine (analySIS 3.0; Soft Imaging System, Lakewood, CO). Suprafețele adipocitelor au fost măsurate folosind software-ul analySIS. Suprafața medie și distribuția frecvenței au fost calculate din> 500 de celule pentru fiecare șoarece.

analize statistice.

Activitățile enzimatice, parametrii serici și concentrațiile de metabolit sunt exprimate ca medii ± SEM. Semnificația diferențelor dintre date a fost analizată folosind testul Student-Newmann-Keuls. Diferențele au fost considerate semnificative la P 2 vs. transgenici hrăniți cu dieta standard 948 ± 52 μm 2). După o dietă bogată în grăsimi, suprafața adipocitelor a crescut de aproximativ 2,5 ori la șoarecii martori și de 23,2 ori la șoarecii transgenici, comparativ cu martorii din dieta standard (martorii hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi 1.006 ± 66 μm 2 vs. transgenici hrăniți -dieta grasa 1.301 ± 182 μm 2). Șoarecii transgenici hrăniți cu grăsimi au arătat, de asemenea, un număr mai mare de celule mici decât martorii, precum și prezența adipocitelor foarte mari (Fig. 2B). Expresia mARN-ului PEPCK a fost, de asemenea, analizată în WAT. O creștere de șase ori a expresiei genei PEPCK a fost observată în WAT de la șoareci transgenici hrăniți cu o dietă standard (Fig. 2C). O creștere similară a fost observată atunci când acești șoareci transgenici au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (Fig. 2C). Mai mult, niveluri mai ridicate de proteine ​​din PEPCK au fost măsurate în WAT și BAT la șoareci transgenici (Fig. 2D). Acest lucru indică faptul că supraexpresia PEPCK în țesutul adipos nu a fost modificată de dieta bogată în grăsimi.

Supraexprimarea PEPCK în țesutul adipos agravează hiperinsulinemia și rezistența la insulină induse de o dietă bogată în grăsimi.

Când șoarecii transgenici au fost hrăniți cu o dietă standard, nivelurile de glucoză circulante au fost neschimbate fie în condiții de hrănire, fie în condiții de repaus alimentar (Fig. 3A). După 6 săptămâni pe o dietă bogată în grăsimi, concentrațiile de glucoză din sânge au crescut în ambele condiții, atât la șoarecii de control, cât și la șoarecii transgenici (Fig. 3A). Șoarecii transgenici hrăniți cu o dietă standard au prezentat niveluri de insulină similare cu martorii (Fig. 3B). Cu toate acestea, după hrănirea cu o dietă bogată în grăsimi, șoarecii de control au fost ușor hiperinsulinemici (creștere de .51,5 ori), în timp ce șoarecii transgenici au prezentat o creștere puternică (de -14 ori) a insulinemiei (Fig. 3B). După 6 săptămâni pe o dietă bogată în grăsimi, șoarecii transgenici au avut niveluri mai ridicate de glucoză în sânge și nu au recuperat glucoza bazală la 180 de minute, indicând că au devenit mai intoleranți la glucoză decât martorii (Fig. 3C). S-a măsurat, de asemenea, sensibilitatea la insulină a întregului corp la șoareci transgenici. La șoarecii transgenici hrăniți cu grăsimi, efectul hipoglicemiant al insulinei a fost abolit, în timp ce răspunsul la insulină al șoarecilor martor hrăniți cu grăsime a fost ușor mai mic decât cel al șoarecilor martor hrăniți cu o dietă standard (Fig. 3D). Acest lucru a indicat faptul că șoarecii transgenici au dezvoltat o rezistență mai mare la insulină decât martorii atunci când au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi.

Șoarecii transgenici au prezentat acumularea de lipide în ficat și creșterea trigliceridemiei.

Șoarecii hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi timp de 6 săptămâni au prezentat o depunere de grăsime hepatică mai mare decât șoarecii hrăniți cu o dietă standard (Fig. 4A). Deși șoarecii martor au prezentat o acumulare ușoară de lipide, șoarecii transgenici au dezvoltat steatoză hepatică ridicată. În concordanță cu această modificare morfologică, conținutul de trigliceride hepatice a fost crescut de aproximativ șapte ori la șoarecii transgenici hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi comparativ cu șoarecii martor hrăniți cu o dietă standard și dublu comparativ cu martorii hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (Fig. 4B). Șoarecii transgenici hrăniți cu o dietă standard au prezentat concentrații serice de trigliceride, în comparație cu martorii (Fig. 4C). Cu toate acestea, după 6 săptămâni pe o dietă bogată în grăsimi, șoarecii transgenici au prezentat hipertrigliceridemie, în timp ce trigliceridele circulante la șoarecii martori au rămas nealterate (Fig. 4C). Aceste rezultate indică faptul că reesterificarea crescută a țesutului adipos asociată cu o dietă bogată în grăsimi duce la depunerea lipidelor în ficat și la creșterea nivelului de trigliceride circulante, care poate fi contribuit și la dezvoltarea rezistenței la insulină la șoarecii transgenici.

Nivelurile FFA circulante au fost similare la șoarecii transgenici și martori cu hrană bogată în grăsimi.

La animalele hrănite, majoritatea FFA circulante provin din alimente, deoarece lipoliza țesutului adipos este inhibată de insulină. Șoarecii martori hrăniți cu grăsime și transgenici au prezentat o creștere similară a FFA circulantă la șoarecii hrăniți cu o dietă standard, probabil din cauza dietei bogate în grăsimi și a rezistenței la insulină a țesutului adipos (Fig. 5A). La șoarecii de control post, eliberarea FFA a fost crescută (aproximativ de patru ori), comparativ cu șoarecii de control hrăniți, datorită lipolizei crescute. În schimb, șoarecii transgenici la post pe o dietă standard au arătat doar o creștere de două ori a nivelurilor FFA, rezultând din rata mai mare de reesterificare. Cu toate acestea, după 6 săptămâni pe o dietă bogată în grăsimi, șoarecii transgenici la post au prezentat o creștere similară a FFA-urilor circulante față de martori (Fig. 5A). Astfel, deși șoarecii transgenici au fost mai obezi decât șoarecii martor, nu au prezentat niveluri mai ridicate de FFA circulante. Acest lucru a sugerat că rezistența mai mare la insulină observată la șoarecii transgenici nu a rezultat din creșterea nivelului de FFA circulant.

Nivelurile de adiponectină au scăzut la șoarecii transgenici.

S-a descris că nivelurile interleukinei (IL) -6, factorului de necroză tumorală (TNF) -α, leptinei și adiponectinei sunt modificate în timpul obezității și pot contribui la rezistența la insulină. Concentrația acestor hormoni a fost, de asemenea, determinată în ser de la șoareci transgenici și de control înainte și după o dietă bogată în grăsimi de 6 săptămâni. Concentrația circulantă de IL-6 și TNF-α nu a fost detectată (datele nu sunt prezentate), ceea ce indică faptul că la șoarecii noștri transgenici, rezistența la insulină nu a fost probabil rezultatul modificărilor acestor hormoni. Nivelurile de leptină au fost aceleași în ambele grupuri care se hrăneau cu o dietă standard și au fost crescute într-o măsură similară în ambele grupuri printr-o dietă bogată în grăsimi (Fig. 5B). În schimb, nivelurile de adiponectină din dieta standard au fost mai mari la șoarecii transgenici (Fig. 5C). În cadrul unei diete bogate în grăsimi, nivelurile de adiponectină au crescut (~ 300%) la șoarecii martor, în timp ce aceștia au crescut doar ușor (~ 30%) la șoarecii transgenici și au fost cu 30% mai mici decât la martorii cu hrană bogată în grăsimi (Fig. 5C). Această concentrație mai mică de adiponectină, împreună cu creșterea leptinemiei, ar fi putut contribui, de asemenea, la dezvoltarea rezistenței la insulină la șoarecii transgenici cu hrană bogată în grăsimi.

Șoarecii transgenici au prezentat modificări ale BAT.

Cheltuielile de energie, dar nu activitatea fizică, sunt reduse la șoarecii transgenici.

Cheltuielile cu energia au fost măsurate prin calorimetrie indirectă la șoarecii hrăniți fie cu o dietă standard, fie cu un conținut ridicat de grăsimi (ciclu întunecat). În timp ce consumul de alimente a fost similar la șoarecii transgenici și șoareci de control în timpul experimentului, cheltuielile de energie au fost mai mici la șoarecii transgenici decât la martorii hrăniți fie cu o dietă standard, fie cu o dietă bogată în grăsimi (Fig. 7A). Mai mult decât atât, șoarecii cu control bogat în grăsimi și șoarecii transgenici au prezentat cheltuieli de energie mai mici decât șoarecii de control hrăniți cu o dietă standard (Fig. 7A). Cu toate acestea, nu s-a observat nicio diferență în activitatea fizică între grupuri (Fig. 7B). Acest lucru indică faptul că cheltuielile reduse de energie nu s-au datorat unei activități mai mici. De asemenea, sugerează că creșterea crescută a grăsimii corporale se datorează scăderii ratei metabolice și a termogenezei.

DISCUŢIE

Rezultatele noastre indică faptul că PEPCK este implicat în stocarea trigliceridelor țesutului adipos și poate juca un rol crucial în reglarea stocării lipidelor. Activitatea PEPCK este controlată la nivel transcripțional, iar PPAR-γ este unul dintre factorii de transcripție implicați în activarea promotorului PEPCK (36-38). În concordanță cu aceasta, o ștergere a unui site critic de legare PPAR-γ în promotorul genei PEPCK a ablat expresia PEPCK în WAT și a condus la lipodistrofie (39). Activarea PPAR-γ de către TZD îmbunătățește toleranța la glucoză la pacienții diabetici și la modelele animale diabetice (11-13). Cu toate acestea, aceste medicamente, probabil prin creșterea reesterificării FFA prin PEPCK și activarea glicerol kinazei (14,15), induc creșterea în greutate. Tratamentul cu TZD duce la o redistribuire a țesutului adipos de la depozitele viscerale la cele subcutanate (40-43). Această schimbare poate îmbunătăți sensibilitatea la insulină. Cu toate acestea, rezultatele noastre indică faptul că o creștere a reesterificării FFA asociată cu o dietă bogată în grăsimi poate avea efecte dăunătoare

Pe scurt, rezultatele noastre indică faptul că supraexpresia PEPCK în țesutul adipos și reesterificarea crescută a șoarecilor transgenici în urma unei diete standard duc la obezitate fără FFA circulante mai mari sau rezistență la insulină (Fig. 8). Paradoxal, sub o dietă bogată în grăsimi, acești șoareci au fost rezistenți la insulină. Hrănirea cu conținut ridicat de grăsimi în prezența supraexprimării PEPCK duce la acumularea de trigliceride în WAT și BAT și la saturația depozitării grăsimilor. Acest lucru afectează rolul WAT în tamponarea fluxului de lipide în circulație, ducând la depunerea grăsimilor în ficat, hipertrigliceridemie și rezistență la insulină (Fig. 8). Mai mult, acumularea de grăsimi în BAT probabil a redus termogeneza indusă de dietă. Astfel, toate aceste rezultate sugerează că reglarea capacității de stocare a lipidelor a țesutului adipos este crucială pentru menținerea sensibilității la insulină.