Shingo Takada

1 Departamentul de Medicină Cardiovasculară, Școala de Medicină a Universității Hokkaido, Sapporo, Japonia

previne

Shintaro Kinugawa

1 Departamentul de Medicină Cardiovasculară, Școala de Medicină a Universității Hokkaido, Sapporo, Japonia

Shouji Matsushima

1 Departamentul de Medicină Cardiovasculară, Școala de Medicină a Universității Hokkaido, Sapporo, Japonia

Daisuke Takemoto

2 Institute for Health Care Science, Suntory Wellness Ltd, Osaka, Japonia

Takaaki Furihata

1 Departamentul de Medicină Cardiovasculară, Școala de Medicină a Universității Hokkaido, Sapporo, Japonia

Wataru Mizushima

1 Departamentul de Medicină Cardiovasculară, Școala de Medicină a Universității Hokkaido, Sapporo, Japonia

Arata Fukushima

1 Departamentul de Medicină Cardiovasculară, Școala de Medicină a Universității Hokkaido, Sapporo, Japonia

Takashi Yokota

1 Departamentul de Medicină Cardiovasculară, Școala de Medicină a Universității Hokkaido, Sapporo, Japonia

Yoshiko Ono

2 Institute for Health Care Science, Suntory Wellness Ltd, Osaka, Japonia

Hiroshi Shibata

2 Institute for Health Care Science, Suntory Wellness Ltd, Osaka, Japonia

Koichi Okita

3 Departamentul de Educație Sportivă, Universitatea Hokusho, Ebetsu, Japonia

Hiroyuki Tsutsui

1 Departamentul de Medicină Cardiovasculară, Școala de Medicină a Universității Hokkaido, Sapporo, Japonia

Abstract

Constatări noi

Care este întrebarea centrală a acestui studiu?

Scopul nostru a fost să examinăm dacă sesamina poate preveni o scădere a capacității de efort la șoarecii diabetici induși în grăsimi. Ipoteza noastră a fost că menținerea funcției mitocondriale și atenuarea stresului oxidativ în mușchiul scheletic ar contribui la acest rezultat.

Care este principala constatare și importanța acesteia?

Noile descoperiri sunt că sesamina previne scăderea capacității de efort indusă de diabet și afectarea funcției mitocondriale prin inhibarea stresului oxidativ dependent de NAD (P) H oxidază în mușchiul scheletic. Sesamina poate fi utilă ca agent nou pentru tratamentul diabetului zaharat.

Abstract

Introducere

Sesaminul, unul dintre lignanii găsiți în semințele de susan și în ulei, are funcții biologice multiple (Nakano și colab. 2006, 2008; Hong și colab. 2013). S-a raportat că sesamina scade nivelul glicemiei, insulinei și lipidelor la șoarecii diabetici de tip 2 (Hong și colab. 2013). Sesamina inhibă, de asemenea, producția de O2 · indusă de NAD (P) H oxidază în aorta la șobolanii cărora li s-a administrat acetat de deoxicorticosteron și sare (Nakano și colab. 2006). Mai mult, un metabolit sesaminic (SC - 1; (7α, 7′α, 8α, 8′α) ‐3,4 - dihidroxi - 3 ′, 4 ′ - metilendioxi - 7,9 ′: 7 ′, 9 - diepoxilignan) producția de O2 · indusă de xantină/xantină oxidază puternic inhibată (Nakai și colab. 2003; Nakano și colab. 2006, 2008). Având în vedere că sesamina are efecte antioxidante, am emis ipoteza că ar putea avea un efect favorabil asupra funcției mitocondriale, prevenind scăderea capacității de efort la șoarecii diabetici induși de HFD prin inhibarea producției de specii de oxigen reactiv indusă de NAD (P) H oxidază. Prin urmare, am investigat dacă sesamina ar putea preveni activarea NAD (P) H oxidazei și scăderea capacității de efort la șoarecii diabetici induși de HFD.

Metode

Animale experimentale

Șoarecii masculi C57BL/6J au fost adăpostiți într-o cameră pentru animale în condiții controlate pe un ciclu de lumină-întuneric de 12 h - 12 h. Șoarecii au fost hrăniți fie cu o dietă normală (ND) conținând 4,2% grăsimi și 54,6% carbohidrați, fie cu un HFD (HFD32) conținând 32,0% grăsimi și 29,4% carbohidrați timp de 8 săptămâni. Șoarecii au fost în continuare împărțiți în grupuri cu sau fără adăugarea de sesamină (0,2%) la dieta lor ND sau HFD. Sesaminul a fost preparat din ulei rafinat de semințe de susan și purificat așa cum s-a descris anterior (Fukuda și colab. 1986). Cantitățile de alimente consumate de fiecare șoarece (2,4-2,5 g zi -1 pentru fiecare șoarece) și greutățile corporale au fost monitorizate în fiecare săptămână (datele nu sunt prezentate). Doza de sesamină din prezentul studiu a fost aleasă pe baza studiilor anterioare (Ashakumary și colab. 1999; Ide și colab. 2001 a). Prezentul studiu a avut astfel următoarele patru grupuri de tratament: (i) ND; (ii) ND + sesamină; (iii) HFD; și (iv) HFD + Sesamin (n = 10 pentru fiecare grup). Aceste proceduri de atribuire au fost efectuate folosind coduri numerice pentru identitatea animalelor. Toate procedurile și îngrijirea animalelor au fost aprobate de comitetul nostru instituțional de cercetare a animalelor și au respectat Ghidul de îngrijire a animalelor pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator de la Universitatea Hokkaido Școala de Medicină.

Probele de sânge au fost colectate din vena cavă inferioară înainte ca șoarecii să fie uciși, sub anestezie generală profundă indusă cu tribromoetanol - amilenhidrat [Avertin; 2,5% g/v, 250 mg (kg greutate corporală) -1, i.p. ] (Sigma - Aldrich, St Louis, MO, SUA). Grăsimea epididimală și mușchii scheletici unilaterali ai membrelor posterioare (cvadriceps, gastrocnemius și soleus) au fost apoi excizați și cântăriți. Am folosit doar mușchiul gastrocnemius pentru funcția mitocondrială și analize biochimice în toate experimentele (n = 6-10 pentru fiecare test).

În studiul in vitro, am folosit miotuburi C2C12 de șoarece și am măsurat activitatea NAD (P) H oxidază (n = 10-11 pentru fiecare grup).

Măsurători ale tensiunii arteriale

Tensiunea arterială sistemică și ritmul cardiac au fost măsurate folosind metoda cozii (BP-98A; Softron, Tokyo, Japonia) fără anestezie.

Măsurători biochimice

Nivelurile de insulină plasmatică, colesterol total, trigliceride și acizi grași neesterificați au fost măsurate așa cum s-a descris anterior (Takada și colab. 2013, 2014; Ono și colab. 2015).

Concentrațiile plasmatice de sesamină și SC - 1

Probele de plasmă au fost extrase după hidroliză cu β-glucuronidază/arilsulfatază. Sesaminele și SC-1 au fost măsurate prin cromatografie lichidă cu ultraperformanță - spectrometrie de masă tandem (UPLC - MS/MS) așa cum s-a descris anterior (Tomimori și colab. 2013).

Teste de toleranță intraperitoneală la glucoză și insulină

Pentru testul de toleranță la glucoză sau insulină, șoarecii au fost posti timp de 6 ore și li s-a administrat i.p. injectarea de glucoză (1 mg g -1) sau insulină umană (0,25 mU g -1) în apă purificată. Probele de sânge au fost extrase în mod repetat din vena cozii acelorași șoareci înainte și la 15, 30, 60, 90 și 120 de minute după injecție. Nivelurile de glucoză din sânge au fost determinate cu ajutorul unui glucometru (Glutest Ace R; Sanwa Kagaku Kenkyusho, Nagoya, Japonia).

Testarea benzii de rulare cu analiza gazelor expirate și activitate fizică spontană

Activități enzimatice mitocondriale în mușchiul scheletic

Activitatea enzimatică a citratului sintază (CS), o enzimă cheie a ciclului acidului tricarboxilic, a fost determinată spectrofotometric în omogenatul tisular din probele de mușchi scheletic, așa cum s-a descris anterior (Inoue și colab. 2012; Suga și colab. 2014; Takada și colab. 2014; Kadoguchi și colab. 2015; Nishikawa și colab. 2015).

Imunoblotarea mușchiului scheletic

Imunoblotarea a fost efectuată folosind anticorpi împotriva formelor fosforilate de AMPK și acetil - CoA carboxilază - β (Cell Signaling, Danvers, MA, SUA). Încărcarea egală a proteinelor a fost verificată prin imunoblotare cu gliceraldehidă 3-fosfat dehidrogenază (GAPDH; Cell Signaling), așa cum s-a descris anterior (Takada și colab. 2013; Fukushima și colab. 2014; Kadoguchi și colab. 2015; Nishikawa și colab. 2015; Ono et al. 2015).

RT-PCR cantitativ

Anion superoxid și activitate NAD (P) H oxidază în mușchiul schelet in vivo

Chimioluminiscența provocată de O2 · - în prezența lucigeninei (5 μmol l -1) a fost măsurată în mușchiul scheletic al membrelor posterioare utilizând un luminometru (AccuFLEX Lumi 400; Aloka, Tokyo, Japonia) așa cum s-a descris anterior (Yokota și colab. 2009; Takada și colab. 2013, 2014; Fukushima și colab. 2014; Suga și colab. 2014; Kadoguchi și colab. 2015; Nishikawa și colab. 2015; Ono și colab. 2015). Activitatea NAD (P) H oxidază a fost măsurată în omogenate izolate din mușchiul scheletic al membrelor posterioare prin testul lucigeninei după adăugarea NAD (P) H (300 μmol l -1) așa cum s-a descris anterior (Yokota și colab. 2009; Takada și colab. 2013, 2014; Fukushima și colab. 2014; Suga și colab. 2014; Kadoguchi și colab. 2015; Nishikawa și colab. 2015; Ono și colab. 2015).

Activitatea NAD (P) H oxidază în miotuburile C2C12 in vitro

Linia celulară de mioblast C2C12 de șoarece (American Type Culture Collection, Manassas, VA, SUA) a fost însămânțată pe plăci de cultură cu mediu conținând 2% ser de cal. Diferențierea mioblastelor C2C12 în miotuburi s-a produs în 6-7 zile, confirmată prin microscopie cu lumină care arată alinierea morfologică, alungirea și fuziunea, așa cum s-a descris anterior (Fukushima și colab. 2014; Nishikawa și colab. 2015). După preincubare la 37 ° C în condiții fără ser, miotuburile C2C12 au fost incubate la 37 ° C cu 1 μmol l -1 angiotensină II (Sigma - Aldrich) timp de 24 de ore în absența sau prezența 1 sau 10 μmol l -1 SC - 1, care a fost preparat așa cum s-a descris anterior (Urata și colab. 2008). După 24 de ore de incubație, celulele au fost recoltate și depozitate la -80 ° C pentru măsurarea activității NAD (P) H oxidază. Activitatea NAD (P) H oxidază a fost măsurată în omogenatele miotuburilor C2C12 printr-un test de lucigenină (5 μmol l -1) după adăugarea NAD (P) H (100 μmol l -1) așa cum s-a descris anterior (Fukushima et. și colab. 2014; Nishikawa și colab. 2015).

analize statistice

Datele sunt exprimate ca mijloace ± SEM. Pentru comparații cu mai multe grupuri, a fost efectuat ANOVA bidirecțional urmat de testul lui Tukey. În i.p. teste de toleranță la glucoză și insulină, diferențele dintre grupuri au fost determinate cu măsuri repetate ANOVA. O valoare P 1 arată caracteristicile animalelor din cele patru grupe. Greutatea corporală a fost semnificativ mai mare în HFD în comparație cu șoarecii ND și acest lucru a fost însoțit de o creștere semnificativă a greutății epididimale a grăsimilor (Tabelul 1). Nu au existat diferențe în greutățile musculare cvadriceps, gastrocnemius și soleus, tensiunea arterială sistolică sau ritmul cardiac între șoarecii ND și HFD (Tabelul 1). Nivelul glicemiei, insulinei, trigliceridelor, colesterolului total și nivelurilor de acid gras neesterificat în jeun au fost semnificativ mai mari la șoarecii HFD (Tabelul 2). Mai mult, nivelul glicemiei în timpul i.p. testele de toleranță la glucoză și insulină au fost semnificativ mai mari la HFD decât la șoarecii ND (Fig. 1).