Laborator de cercetare ortopedică, Centrul Medical Carolinas, Charlotte, Carolina de Nord 28232-2861

Laborator de cercetare ortopedică, Centrul Medical Carolinas, Charlotte, Carolina de Nord 28232-2861

Laborator de cercetare ortopedică, Centrul Medical Carolinas, Charlotte, Carolina de Nord 28232-2861

Abstract

Mecanismul de adaptare renală la diete cu conținut scăzut de fosfat nu este bine înțeles. Fie că Hyp mutație a Phex genele blochează această adaptare, de asemenea, nu este clar. Pentru a obține mai multe informații despre acest lucru, normal de 5 săptămâni și Hyp șoarecii au fost hrăniți cu o dietă martor (1,0% P) sau cu o dietă săracă în fosfați (0,03% P) timp de 3-5 zile. ARN-ul renal a fost hibridizat cu microarrays Affymetrix U74Av2 (5 matrici/grup). Din cele 5.719 gene detectabile de pe fiecare matrice, 290 au răspuns semnificativ (P rinichiul mamiferului are o rată variabilă de reabsorbție tubulară renală a fosfatului care răspunde la modificările nivelurilor de fosfat dietetic (33). Consumul redus de fosfat alimentar stimulează reabsorbția (maxim tubular, Tm) a fosfatului și crește sinteza renală a 1,25-dihidroxivitaminei D3 (16, 26). Deși se știu multe despre proteinele care transportă ionii fosfat peste membrana celulară (27), se știe mai puțin despre hormoni și citokine care reglează acest proces. O altă zonă de incertitudine este procesul prin care fosfatul reabsorbit traversează interiorul celulei.

Două protocoale experimentale sunt disponibile pentru a studia acest sistem. Dietele cu conținut scăzut de fosfați vor stimula mecanismele homeostatice pentru conservarea fosfatului (16, 26). În plus, mutațiile pierderii funcției ale Phex gena va bloca această adaptare și va suprima conservarea fosfatului (26). Se știe că mutațiile acestei gene apar la pacienții umani cu hipofosfatemie legată de X (33) și la Hyp și Gy mutații șoarecilor (8, 13, 37).

În acest proiect, expresia genei mARN în rinichiul șoarecelui a fost studiată prin tehnologia ADN microarray. Am emis ipoteza că genele care participă la răspunsul renal la modificarea aportului alimentar de fosfat ar răspunde la stimularea printr-o dietă cu conținut scăzut de fosfat și/sau inhibarea de către Hyp mutaţie. 1

1 Societatea Americană de Fiziologie a sponsorizat o întâlnire la hotelul Riverfront Augusta din Augusta, Georgia, 1-4 octombrie 2003, intitulată „Înțelegerea funcției renale și cardiovasculare prin intermediul genomicii fiziologice” și organizată de David Pollock de la Colegiul Medical din Georgia raport de întâlnire de către Moreno C și Pollock DM. Genomică fiziolică 16: 178–179, 2004; 10.1152/fiziolgenomică.00195.2003. http://physiolgenomics.physiology.org/cgi/content/full/16/2/178).

Acest protocol a fost aprobat de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor din Centrul Medical Carolinas. Hipofosfatemic normal și legat de X, Hyp, șoareci au fost crescuți în colonia noastră pe fundalul C57BL/6J din stoc provenind din Laboratorul Jackson, Bar Harbor, ME, așa cum s-a descris anterior (18). Crescătorii au fost hrăniți cu Teklad Mouse Breeder Diet (W) nr. 8626 (Harlan, Madison, WI) și apă de la robinet ad libitum. Puii au fost înțărcați la vârsta de 3 săptămâni și au trecut la Teklad Rodent Diet (W) nr. 8604 (Harlan). La vârsta de 5 săptămâni, șoareci, Hyp [mascul hemizigot (Hyp/ Y) și femelă heterozigotăHyp/ +)] și șoarecii masculi și femele normali (tip sălbatic) au fost hrăniți cu control (1,0% P, Teklad 86129) sau cu o dietă cu conținut scăzut de fosfat (0,03% P, Teklad 86128) timp de 3-5 zile.

Animalele au fost apoi anesteziate, un tub capilar (70 μl) de sânge a fost colectat din sinusul orbital și ambii rinichi au fost recoltați. Rinichii au fost congelați în azot lichid și depozitați la -75 ° C. Rinichii au fost apoi cântăriți și omogenizați, iar ARN-ul total a fost extras cu TRIzol (GIBCO-BRL; Invitrogen, Gaithersburg, MD) (15). Fosfatul anorganic plasmatic a fost măsurat prin metoda lui Chen și colab. (5).

Proiectare experimentală.

Cantități egale de ARN de la trei șoareci, potrivite pentru genotip, sex, dietă și timpul din dietă au fost reunite pentru a crea fiecare probă pentru analiza microarray. Au fost făcute patru grupuri de tratament: 1) Șoarecii normali au alimentat dieta de control, 2) șoareci normali hrăniți cu o dietă săracă în fosfați, 3) Hyp șoarecii care au alimentat dieta de control sau 4) Hyp șoarecii au alimentat o dietă săracă în fosfați. S-au făcut cinci replici cu fiecare replică conținând o probă din fiecare dintre cele patru grupuri de tratament pentru un total de 20 de probe independente (60 șoareci în total). Fiecare replică a fost potrivită pentru tovarăși de sex, sex (3 replici de șoareci masculi și 2 de șoareci femele), timp pe dietă (3 replici la 5 zile și 2 la 3 zile) și procesare paralel.

Analiza microarray.

Eșantioanele au fost prelucrate așa cum este descris în Manualul tehnic pentru analiza expresiei Affymetrix GeneChip (Affymetrix, Santa Clara, CA; Rev. 1, partea nr. 701021, http://www.affymetrix.com). Pregătirea eșantionului este descrisă aici pe scurt. Probele cu ARN de 30 μg au fost purificate pe coloane RNeasy de la Qiagen (Valencia, CA; produs nr. 74104) și apoi convertite în ADNc dublu catenar cu un kit de sinteză ADNc catenă dublă SuperScript (produs nr. 11917-010; Invitrogen, Carlsbad, CA). ADNc a fost apoi exprimat ca ARNc marcat cu biotină prin transcriere in vitro (IVT) cu trusa de etichetare a transcrierii ARN Enzo (Affymetrix, produs nr. 900182). Fiecare probă a fost adăugată cu bioB, bioC, bioD și cre (Affymetrix, produs nr. 900299). ARNc marcat cu biotină a fost fragmentat nonenzimatic. ARNc fragmentat din cele 20 de probe independente a fost hibridizat cu 20 de microarrays U74Av2 de șoarece (Affymetrix, produs nr. 900343) în tampon de hibridizare Affymetrix timp de 16 ore la 45 ° C. Tablourile hibridizate au fost spălate și colorate în Affymetrix Fluidics Station 400 pentru a atașa etichete fluorescente la biotină, urmate de anticorp marcat cu biotină și apoi a doua colorare cu marcare fluorescentă a biotinei. Fiecare matrice a fost scanată de două ori de către scanerul Agilent GeneArray G2500A (Agilent Technologies, Palo Alto, CA).

Analiza datelor.

Datele au fost analizate cu software-ul Affymetrix Microarray Suite 5.0 și Affymetrix Data Mining Tool 3.0. Microarray Suite a fost utilizat pentru a scala expresia ARNm (valoarea semnalului) a tuturor genelor la o medie de 500 pentru fiecare matrice. Datele pentru toate genele pentru cele 20 de probe au fost transferate într-o foaie de calcul Excel (Microsoft, Redmond, WA). Datele au fost asociate de replici. Asociat t-testele au fost apoi calculate pentru a testa efectul Hyp mutație prin compararea șoarecilor normali cu Hyp șoarecii au alimentat dieta de control (Tabelul 1). Efectul dietei cu conținut scăzut de fosfat a fost testat prin compararea șoarecilor hrăniți cu dieta de control cu ​​șoarecii hrăniți cu dieta scăzută în fosfați pentru șoareci cu același genotip (tabelele 2 și 3). Datele au fost exprimate ca medii ± SE pentru cele cinci replici.

Tabelul 1. Comparația expresiei genei mRNA în mod normal vs. Șoarecii hip au alimentat dieta de control

Datele sunt mijloace ± SE pentru cinci eșantioane pe grup. Nivelurile de ARNm sunt în unități arbitrare de fluorescență.

Tabelul 2. Șoareci normali: control vs. dieta saraca in fosfati

Datele sunt mijloace ± SE pentru cinci eșantioane pe grup. Nivelurile de mARN sunt în unități arbitrare de fluorescență.

Tabelul 3. Șoareci hip: control vs. dieta saraca in fosfati

Datele sunt mijloace ± SE pentru cinci eșantioane pe grup. Nivelurile de ARNm sunt în unități arbitrare de fluorescență.

Genele asociate anterior cu conservarea fosfatului au fost selectate pentru prezentare în Fig. 1. Instrumentul de extragere a datelor a fost utilizat pentru a identifica gene cu răspunsuri mari la tratament. Acestea sunt prezentate în Fig. 234. Alte gene au fost selectate din „procesul bazat pe Mm_microtubule” din GenMAPP pentru prezentare în Fig. 5.

răspunsul

FIG. 1.expresia genei mARN de normal și Hyp șoareci hrăniți cu control sau dietă cu conținut scăzut de fosfat pentru gene studiate anterior în homeostazia fosfatului. Fiecare bară este media ± SE a mediei pentru cinci probe. Asteriscurile indică diferențe semnificative la *P


FIG. 2.Expresia genei mARN pentru gene care răspund la Hyp mutaţie. Datele sunt prezentate ca în Fig. 1.

Formulele pentru analiza varianței 2 × 2 cu blocuri complete (48) au fost inserate într-un singur rând și copiate la toate genele. Foaia de calcul a fost apoi sortată pe statistica F pentru interacțiunea dintre dietă (martor sau P scăzută) și genotip (normal sau Hyp). Aceasta a fost utilizată pentru a identifica genele pentru care răspunsul la dieta cu conținut scăzut de fosfat a diferit între normal și Hyp șoareci (Tabelul 4). Genele sunt denumite după numărul lor de acces GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide) și cel mai recent nume funcțional din baza de date NetAffx (http: //www.affymetrix .com).

Tabelul 4. Genotip prin interacțiunea dietei

2 Materialul suplimentar pentru acest articol (tabelele suplimentare 5-8) este disponibil online la http://physiolgenomics.physiology.org/cgi/content/full/00210.2003/DC1.

Datele pentru gene selectate au fost analizate în continuare prin algoritmul GLM cu testul de comparație multiplă Tukey de către sistemul SAS pentru Windows, versiunea 8.02 (SAS Institute, Cary, NC).

GenMAPP.

„Hs-Mm-Rn-Affy_database” (http://www.GenMAPP.org; Conklin Lab, J. David Gladstone Institute, Universitatea California din San Francisco, San Francisco, CA) a fost utilizată pentru a transforma foaia de calcul descrisă mai sus într-un format compatibil GenMAPP. Rezultate din împerechere t-testele și analiza varianței au fost trimise către software-ul GenMAPP (Gene Microarray Pathway Profiler, versiunea 1.0, http://www.GenMAPP.org). MAPPFinder (versiunea 1.0, http://www.GenMAPP.org) a fost apoi utilizat pentru a identifica căile metabolice cele mai afectate de tratament.

Acest raport este conform cu standardele MIAME ale MGED (http://www.mged.org). O copie a setului complet de date de microarray a fost depusă în NCBI Gene Expression Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) sub forma GSE868.

Șoarecii normali au avut în medie 13,5 g la începutul dietelor experimentale, iar Hyp șoarecii au avut în medie 11,2 g. Ca răspuns la alimentarea dietelor experimentale, ambele normale (2,7 ± 0,2 (15) g, medie ± SE) n în paranteze), P

FIG. 3.Expresia genei mARN pentru gene care răspund la o dietă cu conținut scăzut de fosfat la șoareci normali, dar nu la Hyp șoareci. Datele sunt prezentate ca în Fig. 1.

Hyp șoarecii au răspuns, de asemenea, la o dietă săracă în fosfați. Un total de 86 de gene (semnificativ mai mult decât efectul aleatoriu al 57 de gene, P

FIG. 4.Expresia genei mARN pentru gene care răspund la o dietă cu conținut scăzut de fosfat atât în ​​mod normal, cât și în Hyp șoareci. Datele sunt prezentate ca în Fig. 1.

Hyp mutația scade conservarea fosfatului la rinichi, în timp ce dieta cu conținut scăzut de fosfat stimulează conservarea fosfatului. Astfel am emis ipoteza că unele gene ar fi crescute prin dieta cu conținut scăzut de fosfat la șoareci normali, dar ar scădea în Hyp șoareci la dieta de control. (Sau invers poate să apară: scăzut cu diete cu conținut scăzut de fosfat la șoareci normali, dar crescut cu Hyp mutaţie). Acest lucru s-a întâmplat doar pentru patru gene (3 au scăzut și 1 au crescut la șoarecii normali pe dietă cu conținut scăzut de fosfat), care a fost la nivelul unui eveniment aleatoriu. Transstiretina (Fig. 2) și dezoxiribonucleaza I (Fig. 4) sunt exemple în acest sens.

Interacțiunea genotip-după-dietă.

Pentru a căuta în continuare gene afectate diferențial de dieta cu conținut scăzut de fosfat în mod normal și Hyp șoareci, statistica de interacțiune genotip-dietă a fost calculată prin analiza varianței. Această analiză a utilizat toate cele patru mijloace de grup de tratament. A testat dacă răspunsul la dieta cu conținut scăzut de fosfat în Hyp șoarecii au diferit semnificativ de răspunsul șoarecilor normali. Rezultatul numeric a fost un test F pentru interacțiunea genotip-dietă. Cele mai puternice interacțiuni (cele de la P

FIG. 5.Expresia genei mARN pentru genele legate de microtubuli care răspund la dieta cu conținut scăzut de fosfat la șoareci normali, dar nu Hyp șoareci. Datele sunt prezentate ca în Fig. 1 cu comparații individuale de tratament de către pereche t-Test. Valoarea probabilității asociată cu interacțiunea semnificativă între genotip × dietă (PI) în tabelul de analiză a varianței este prezentat pentru fiecare genă.

GenMAPP "Mm_antioxidant" a subliniat modificări ale nivelurilor de ARNm pentru gene legate de activitatea antioxidantă. Nivelurile de expresie pentru glutation reductaza 1 (AI851983, Tabelul suplimentar 8), peroxiredoxina 2 (U20611, Tabelul suplimentar 8) și sequestozomul 1 (Fig. 3) au fost crescute prin dieta cu conținut scăzut de fosfat la șoareci normali, dar nu și în Hyp șoareci.