N.M. și T.P. a contribuit în mod egal la această lucrare.

rețea

Abstract

Introducere

Obezitatea, definită ca acumulare anormală sau excesivă de grăsime care prezintă un risc pentru sănătate, a fost recunoscută ca o boală de către Asociația Medicală Americană în 2013 (1). Cu toate acestea, odată cu creșterea prevalenței sale globale, obezitatea este foarte eterogenă în ceea ce privește gradul de riscuri pe care le impune pentru sănătate și se prezintă diferit chiar și la pacienții cu IMC crescut în mod similar. Odată cu căutarea din ce în ce mai mare a asistenței medicale personalizate, este urgent să se subtipeze mai bine obezitatea (2). În comparație cu persoanele cu obezitate cardiometabolică benignă (denumită probabil „obezitate sănătoasă/sensibilă la insulină/obezitate metabolică normală”), la persoanele cu „obezitate cu risc ridicat cardiometabolic” țesuturile adipoase diferă prin distribuție, morfologie, compoziție celulară, modele moleculare și funcție ( 3). Descoperirile inițiale indică faptul că astfel de diferențe, în special morfologice (dimensiunea adipocitelor, fibroză), pot fi de ajutor în subfenotiparea obezității, nu numai în analizele transversale, ci și în predicția răspunsului clinic la intervențiile obezității (4). Cu toate acestea, amprentarea moleculară a țesutului adipos care ar putea servi pentru o mai bună stratificare, prioritizare sau chiar personalizare a îngrijirii clinice lipsește în mare măsură.

În concordanță cu această noțiune, am constatat că proteinele TVA E2F1 și nivelurile de ARNm corelate cu indicatori clinici multipli ai riscului cardiometabolic ridicat, efect mediat de legarea directă a E2F1 la regiunile promotor ale genelor ASK1 și autofagie (5,6). Cu toate acestea, analizele multivariate care s-au ajustat pentru activarea acestor gene putoare efectoare ale E2F1 au sugerat că căi suplimentare mediază legătura dintre creșterea TVA E2F1 și disfuncția metabolică (5,6). În acest studiu, am folosit analize transcriptomice imparțiale ale E2F1 ridicat față de E2F1 TVA uman scăzut (hVAT) pentru a delimita astfel de căi posibile. Am urmărit membrii superfamiliei factorului de necroză tumorală asociată E2F1 (TNFSF) pe care această analiză le-a dezvăluit și am descoperit o rețea paracrină intercelulară complicată în țesutul adipos, care implică adipocite, macrofage și celule T, care leagă expresia E2F1 a TVA ridicată cu disfuncția țesutului adipos.

Proiectare și metode de cercetare

Cohorte umane și eșantioane de TVA

Participanții au fost din Beer-Sheva, Israel (n = 123) și Leipzig, Germania (n = 421), cohorte (Tabelul 1) cu utilizarea unor proceduri coordonate așa cum s-a descris anterior (5). Pe scurt, după aprobarea de către comitetele de etică ale celor două centre și obținerea consimțământului informat scris, participanții (18-75 ani) au fost recrutați înainte de a fi supuși intervențiilor chirurgicale abdominale elective (proceduri bariatrice sau alte proceduri elective). După post peste noapte, probele de sânge au fost extrase și analizate de laboratoarele clinice de biochimie și endocrinologie. Biopsiile de țesut adipos visceral (omental) au fost obținute în timpul intervenției chirurgicale și livrate imediat la laborator, unde au fost prelucrate pentru expresia ARNm sau proteine ​​folosind proceduri coordonate, așa cum s-a descris anterior (5). Pentru obținerea explanților de țesut adipos uman, probele de țesut au fost tăiate cu atenție și cultivate în MEM-Alpha conținând 4,5 mmol/L glucoză, 10% FBS, 2 mmol/L l-glutamină și 100 unități/ml penicilină-streptomicină pentru recuperare de 24 de ore. Human TRAIL (hTRAIL) (375-TEC-010; D&R Systems) 25 sau 100 ng/ml a fost adăugat la medii proaspete fără ser pentru tratament de 24 de ore. Fracțiile adipocitare și vasculare stromale (SVF) au fost preparate prin digestie colagenază (C6885-5G; Sigma-Aldrich) așa cum s-a descris anterior (15).

Caracteristicile clinice ale participanților din cohorta Leipzig și Beer-Sheva

Culturi celulare

Analiza țesuturilor și celulelor și analiza Western Blot

Pregătirea lizatelor tisulare/celulare și a anticorpilor utilizați a fost descrisă anterior (6). Pentru determinarea proteinelor E2F1, am folosit anti-E2F1 monoclonal Ab by GeneTex (GTX-70154; GeneTex, Irvine, CA).

Extracția ARN, PCR cantitativă în timp real și analiza secvențierii ARN

Alte teste

Nivelurile de leptină și adiponectină în mediul condiționat de Chub-S7 și în serul uman au fost măsurate ca anterior (6). Eliberarea lactatului dehidrogenază (LDH) din adipocitele Chub-S7 a fost măsurată utilizând setul de testare a activității lactatului dehidrogenază (MAK066-1KT; Sigma-Aldrich). LDH eliberat a fost calculat ca procent din total (mediu/mediu + celule). Secreția hTRAIL la mediul condiționat a fost măsurată folosind TRAIL ELISA imunoquantitativ (RayBio). Lipoliza a fost măsurată așa cum s-a descris anterior (22), cu adenozin deaminază (ADA) la 1 µU/mL și efectul antilipolitic al insulinei după 24 ore de foamete de insulină.

Acumularea de lipide macrofage

MDM au fost diferențiate așa cum este descris în plăci cu 96 de godeuri μClear, negre (Greiner-Bio One). M0 MDM au fost tratați cu control sau TL1A 25 ng/ml mediu fără ser timp de 24 de ore. Acumularea de lipide în condiții îmbogățite cu acizi grași s-a făcut prin adăugarea a 10 mmol/L acid oleic pentru incubarea finală de 2 ore, după cum s-a descris anterior (23). Celulele au fost fixate cu 4% formaldehidă urmată de colorare cu BODIPY 493/503 (1 μg/mL) (D3922; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) și DAPI (5 ng/mL) (62248; Thermo Fisher Scientific) timp de 20 de minute la temperatura camerei și apoi spălat cu PBS suplimentat cu Ca +2/Mg +2 (02-020-1A; Biological Industries). Imaginile au fost achiziționate într-o manieră complet automată, imparțială, folosind un microscop echipat cu lentile cu unghi larg × 40 (Operetta; PerkinElmer, Waltham, MA). Analiza statistică a fost făcută utilizând software-ul Columbus (PerkinElmer).

Citometrie de flux a TVA SVF

După 3 h de stimulare cu sau fără hTRAIL, celulele SVF au fost spălate cu tampon FACS și colorate pentru antigeni de membrană (BioLegend, San Diego, CA) anti - CD3-FITC, CD4-BV510, CD8-AF700 și colorant de viabilitate 780. după fixarea paraformaldehidei de 20 de minute, celula a fost permeabilizată și colorată cu anti - TL1A-PerCP-cy5.5 urmând instrucțiunile kitului de colorare intracelular FoxP3 al eBioscience. Probele au fost analizate de un citometru de flux Beckman Coulter CytoFLEX și de un software FlowJo.

Analize de cocultură

MDM M0 diferențiat, generat așa cum a fost descris, au fost cultivate pe inserții permeabile cu pori de înaltă densitate de 0,4-μm (353494; Falcon) și au fost tratați cu control versus TL1A 25 ng/ml mediu fără ser timp de 24 de ore. După o spălare aprofundată a PBS, inserțiile au fost transferate în plăci care conțin Chub-S7 și coculturate în medii de creștere Chub-S7 fără ser. După 24 de ore, mediul condiționat a fost colectat și nivelurile de leptină/adiponectină au fost măsurate așa cum s-a descris anterior (6).

Analize statistice

Pentru experimentele in vitro/ex vivo, calculele au fost făcute folosind GraphPad. Diferențele semnificative statistic între grupuri au fost evaluate folosind testul Student t nepereche/Mann-Whitney. Corelațiile au fost evaluate fie prin teste de corelație Pearson, fie prin Spearman, conform indicațiilor. Pentru datele despre cohorta umană, analiza statistică a fost făcută folosind SPSS Statistics (versiunea 20). Corelațiile au fost evaluate utilizând testul de corelație Pearson. Diferențele semnificative statistic în parametrii clinici între grupuri au fost evaluate folosind testul t Student nepereche.

Disponibilitatea datelor și a resurselor

Seturile de date generate în studiul actual sunt disponibile de la autorii relevanți la cerere.

Rezultate

TVA-ul pacienților cu obezitate și expresie ridicată E2F1 afișează un transcriptom unic

Pentru a identifica căile reglementate diferențial asociate cu fenotipul dismetabolic al E2F1 obez cu TVA ridicată, am folosit ARN-seq. Pentru a evalua intervalul de exprimare a TVA E2F1, am măsurat nivelurile de proteine ​​E2F1 în eșantioane TVA (așa cum s-a descris anterior [6]) de la n = 67 pacienți supuși operațiilor abdominale elective. Nivelurile de TVA E2F1 au fost împărțite în chintile, iar cele două chintile inferioare și superioare (cea mai mică și cea mai mare 40%) au fost definite ca E2F1 scăzut și respectiv E2F1 ridicat (quintila de expresie medie E2F1 a fost exclusă pentru a minimiza înclinația de clasificare greșită) (Fig. 1A) . Am asociat perechi de pacienți cu IMC ≥30 kg/m 2 din subgrupurile E2F1 scăzut și E2F1 ridicat pentru vârstă, sex și IMC (Fig. 1B - D). Pacienții cu TVA E2F1 scăzut și E2F1 ridicat (n = 8 în fiecare grup, cu un raport 3: 5 bărbat: femeie) (subcohortul 1 [Tabelul 2]) au fost, respectiv, 41,25 și 40,25 ani (în medie), au avut o medie IMC de 40,5 și 41,5 kg/m 2 și au fost comparabile în ceea ce privește tensiunea arterială și starea de diabet.

TVA-uri care exprimă scăzut vs. nivelurile ridicate de proteine ​​E2F1 prezintă transcriptom diferențial îmbogățit în gene TNFSF. A: Proteina E2F1 a fost măsurată în probe hVAT de la n = 67 de pacienți pentru a estima intervalul nivelurilor de proteine ​​E2F1 adipos. Nivelurile de proteine ​​E2F1 corespunzătoare celor care exprimă cel mai scăzut vs. cele mai mari 40% (chintilele Q1-2 vs. Q4-5, respectiv) au fost desemnate E2F1 low vs. E2F1 ridicat. B - D: Au fost identificate opt perechi potrivite IMC, vârstă și sex (subcohortul 1 [Tabelul 2]). E: analiza pereche de date ARN-seq folosind corecția FDR a relevat 73 de gene DE (schimbare de pliuri> 1,3, P ≤ 0,05) dintre șapte perechi potrivite (adică, n = 14 persoane) de TVA E2F1 scăzut/înalt (o pereche trebuia exclusă [căutare proiectare și metode]). Gruparea ierarhică a fost făcută utilizând funcția de hartă a căldurii în R. F și G: rezultatele ARN-seq pentru TRAIL (TNFSF10) și respectiv DR3 (TNFRSF25). Linii roșii, creștere> 10% în E2F1; liniile verzi, scăderea> 10% a E2F1; linii negre, Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up

Caracteristicile clinice ale participanților din subcohortele Beer-Sheva din biobanca Beer-Sheva

Tipuri de celule de țesut adipos care exprimă TRAIL și TL1A și receptorii lor

Impactul funcțional al TL1A în adipocite și macrofage

TL1A induce rezistența la insulină și disfuncția secretorie la adipocite umane

TL1A induce polarizarea macrofagelor și acumularea de lipide

În plus, în MDM uman, TL1A a indus niveluri crescute de mARN de gene tipice de polarizare M1 (IL6, MCP1) (Fig. 5A) și markeri M2 inferiori (CD206, CD209) (Fig. 5B). În cele din urmă, am evaluat dacă macrofagele prestimulate TL1A pot induce disfuncția adipocitelor: MDM uman pretratat timp de 24 de ore cu TL1A a fost spălat și coculturat cu adipocite umane (Fig. 5C) și a indus scăderea raportului adiponectină-leptină în mediul condiționat adipocit (Fig. . 5C). .5D). Împreună, în macrofagele umane, TL1A induce acumularea de lipide, susține un profil proinflamator și perturbă comunicarea macrofag-adipocite, așa cum este evidentă de un profil secretor adipocitar disfuncțional.

O rețea tripartită paracrină TNFSF propusă care implică adipocite, limfocite și macrofage în țesutul adipos. Supraexpresia TRAIL (TNFSF10) mediată de E2F1 (TNFSF10), în special în adipocite (cerc 1) (Fig. Suplimentară 3A - C), crește secreția TRAIL (cerc 1) (Fig. 1J). Celulele T ale țesutului adipos reglează în sus TL1A (TFFSF15) ca răspuns la TRAIL (cercul 2) (Fig. 2G - J) și cresc expresia DR4/DR5 (cercul 3 [Fig. Suplimentar 4]). TL1A derivat din limfocite reglează în sus adipocitul E2F1 (cercul 4) (Fig. 3I), afectează semnalizarea insulinei adipocite și acțiunea antilipolitică (cercul 5) (Fig. 3E - H) și induce un fenotip secretor adipokinic advers (cercul 5) (Fig. 3). 3I - H). 3B - D). În paralel, TL1A induce acumularea de lipide în macrofage (cercul 6) (Fig. 4) și susține fenotipul lor proinflamator (cercul 6) (Fig. 5A și B). În cele din urmă, mediată de macrofage, TL1A induce un fenotip secretor adipocin advers adipocit (cerc 7) (Fig. 5C și D). AT, țesut adipos.

În concluzie, descriem o rețea paracrină complexă de factori TNFSF în țesutul adipos într-un subfenotip de obezitate cu risc ridicat caracterizat printr-o expresie ridicată a E2F1. Modelul nostru, legând E2F1, TRAIL și TL1A într-o singură cale fiziopatologică, extinde înțelegerea atât a activității E2F1, cât și a activității TRAIL, fiecare arătând anterior că induce disfuncția țesutului adipos și evidențiază complexitatea și importanța citokinelor TNFSF în fiziopatologia țesutului adipos. De asemenea, studiul nostru propune că atunci când este crescut într-un subgrup de pacienți cu obezitate, TL1A este un mediator al țesutului adipos și al disfuncției metabolice a întregului corp. Rezultatele noastre sugerează noi oportunități terapeutice în căutarea unei abordări mai precise/personalizate pentru a gestiona mai bine complicațiile cardiometabolice ale subfenotipurilor obezității definite molecular.

Informații despre articol

Finanțarea. Acest studiu a fost susținut parțial de subvenții de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (Fundația Germană pentru Cercetare), numărul de proiect 209933838 SFB1052: „Mecanisme de obezitate” și Fundația științifică Israel (ISF 2176/19).

Dualitatea interesului. Nu au fost raportate potențiale conflicte de interese relevante pentru acest articol.