Moorfield's Eye Hospital, Londra, EC1C 2PD Marea Britanie

asociat

Institutul de Oftalmologie, Londra, EC1V 9EL UK

Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare.

Laboratoarele de cercetare metabolică de la Universitatea Cambridge, Wellcome Trust - Institutul MRC de Științe Metabolice, Spitalul Addenbrooke, Cambridge, CB2 0QQ Marea Britanie

Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare.

Institutul de Oftalmologie, Londra, EC1V 9EL UK

Departamentul de biologie celulară și matricială, Institutul de Zoologie, Johannes Gutenberg, Universitatea din Mainz, Mainz, Germania

Institutul de Oftalmologie, Londra, EC1V 9EL UK

Moorfield's Eye Hospital, Londra, EC1C 2PD Marea Britanie

Institutul de Oftalmologie, Londra, EC1V 9EL UK

Laboratoarele de cercetare metabolică de la Universitatea Cambridge, Wellcome Trust - Institutul MRC de Științe Metabolice, Spitalul Addenbrooke, Cambridge, CB2 0QQ Marea Britanie

Institutul de Oftalmologie, Londra, EC1V 9EL UK

Moorfield's Eye Hospital, Londra, EC1C 2PD Marea Britanie

Institutul de Oftalmologie, Londra, EC1V 9EL UK

University College London Genetics Institute, Londra, WC1E 6BT UK

Departamentul de biologie celulară și matricială, Institutul de Zoologie, Johannes Gutenberg, Universitatea din Mainz, Mainz, Germania

Laboratoarele de cercetare metabolică de la Universitatea Cambridge, Wellcome Trust - Institutul MRC de Științe Metabolice, Spitalul Addenbrooke, Cambridge, CB2 0QQ Marea Britanie

Corespondență cu: Profesorul Sadaf Farooqi, Universitatea din Cambridge Metabolic Research, Wellcome Trust - MRC Institute of Metabolic Science, Box 289, Addenbrooke's Hospital, Cambridge, CB2 OQQ, Marea Britanie. E-mail: [email protected] Căutați mai multe lucrări ale acestui autor

Moorfield's Eye Hospital, Londra, EC1C 2PD Marea Britanie

Institutul de Oftalmologie, Londra, EC1V 9EL UK

Corespondență cu: profesorul Anthony Moore, UCL Institute of Ophthalmology and Moorfields Eye Hospital London. E-mail: [email protected]

Moorfield's Eye Hospital, Londra, EC1C 2PD Marea Britanie

Institutul de Oftalmologie, Londra, EC1V 9EL UK

Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare.

Laboratoarele de cercetare metabolică de la Universitatea Cambridge, Wellcome Trust - MRC Institute of Metabolic Science, Addenbrooke's Hospital, Cambridge, CB2 0QQ UK

Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare.

Institutul de Oftalmologie, Londra, EC1V 9EL UK

Departamentul de biologie celulară și matricială, Institutul de Zoologie, Johannes Gutenberg, Universitatea din Mainz, Mainz, Germania

Institutul de Oftalmologie, Londra, EC1V 9EL UK

Moorfield's Eye Hospital, Londra, EC1C 2PD Marea Britanie

Institutul de Oftalmologie, Londra, EC1V 9EL UK

Laboratoarele de cercetare metabolică de la Universitatea Cambridge, Wellcome Trust - MRC Institute of Metabolic Science, Addenbrooke's Hospital, Cambridge, CB2 0QQ UK

Institutul de Oftalmologie, Londra, EC1V 9EL UK

Moorfield's Eye Hospital, Londra, EC1C 2PD Marea Britanie

Institutul de Oftalmologie, Londra, EC1V 9EL UK

University College London Genetics Institute, Londra, WC1E 6BT UK

Departamentul de biologie celulară și matricială, Institutul de Zoologie, Johannes Gutenberg, Universitatea din Mainz, Mainz, Germania

Laboratoarele de cercetare metabolică de la Universitatea Cambridge, Wellcome Trust - MRC Institute of Metabolic Science, Addenbrooke's Hospital, Cambridge, CB2 0QQ UK

Corespondență cu: Profesorul Sadaf Farooqi, Universitatea din Cambridge Metabolic Research, Wellcome Trust - MRC Institute of Metabolic Science, Box 289, Addenbrooke's Hospital, Cambridge, CB2 OQQ, Marea Britanie. E-mail: [email protected] Căutați mai multe lucrări ale acestui autor

Moorfield's Eye Hospital, Londra, EC1C 2PD Marea Britanie

Institutul de Oftalmologie, Londra, EC1V 9EL UK

Corespondență cu: profesorul Anthony Moore, UCL Institute of Ophthalmology and Moorfields Eye Hospital London. E-mail: [email protected]

Sponsorii de subvenții contractuale: Wellcome Trust (077016/Z/05/Z, 098497/Z/12/Z, 096106/Z/11/Z); Institutul Național pentru Cercetări în Sănătate (Centrul de Cercetări Biomedice Moorfields și Centrul de Cercetări Biomedicale din Cambridge); Lupta pentru vedere; Fundația Fighting Blindness (SUA); Rosetrees Trust; Comunitatea Europeană (FP7/2009/241955 „SYSCILIA”); Fundația FAUN (Germania).

Comunicat de Ravi Savarirayan

ABSTRACT

Distrofiile retiniene moștenite sunt o cauză majoră a orbirii în copilărie. Aici, descriem identificarea unei mutații de cadru homozigot (c.1194_1195delAG, p.Arg398Serfs * 9) în CADĂ la un copil dintr-o familie caucaziană britanică consanguină, investigat utilizând cartografierea autozigozității și secvențierea întregului exom. Probandul a prezentat obezitate, orbire nocturnă, scăderea acuității vizuale și trăsături electrofiziologice ale distrofiei conului tijei. Mutația a fost găsită și la doi dintre frații probandului cu distrofie retiniană și a dus la localizarea greșită a proteinei trunchiate. Spre deosebire de formele cunoscute de distrofie retiniană, inclusiv cele cauzate de mutații ale proteinei TULP-1 ca tubby, pierderea funcției TUB în proband și doi membri ai familiei afectați a fost asociată cu obezitate cu debut precoce, în concordanță cu un rol suplimentar pentru TUB în homeostazia energetică.

Retinita pigmentară (RP) descrie un grup eterogen genetic de tulburări caracterizate prin orbire nocturnă, pierderea timpurie a câmpului vizual periferic și pierderea ulterioară a vederii centrale, ducând la insuficiență vizuală severă. RP poate fi moștenit într-o manieră autosomală - dominantă, autosomală - recesivă sau legată de X și mutații în peste 60 de gene diferite au fost identificate până în prezent [den Hollander și colab., 2010]. Cu toate acestea, o proporție semnificativă de RP rămâne inexplicabilă genetic. RP poate fi văzut în combinație cu obezitatea în sindromul Bardet-Biedl și sindromul Alstrom. Aceste tulburări și alte forme de RP sunt denumite „ciliopatii”, deoarece sunt cauzate de mutații în gene importante pentru generarea și întreținerea ciliilor [Waters and Beales, 2011].

Proteinele de tip Tubby (TUB, TULP1, TULP2 și TULP3) sunt o familie unică de proteine ​​care au un domeniu C-terminal extrem de conservat [Carroll și colab., 2004]. Ei își iau numele de la tulpina tubby a șoarecilor obezi în care o mutație recesivă, cu pierderea funcției în Cadă provoacă degenerare retiniană și cohleară, obezitate și rezistență la insulină [Coleman și Eicher, 1990; Kleyn și colab., 1996; Noben-Trauth și colab., 1996]. Mutații recesiv moștenite în TULP1, care este foarte exprimat în retină și implicat în transportul rodopsinei, se găsesc la aproximativ 1% dintre pacienții cu RP [Hagstrom și colab., 1998; den Hollander și colab., 2007]. Cu toate acestea, mutațiile asociate bolii care implică alți membri ai familiei TUB nu au fost identificate până în prezent la om.

Electroretinografia pe câmp complet (ERG) în proband a demonstrat un ERG neînregistrabil în ochiul stâng și o pierdere severă a funcției în ochiul drept, cu răspunsuri absente ale tijei și un răspuns mic al conului rezidual, în concordanță cu o distrofie tijă-con sever generalizată. Imagistica retiniană OCT a demonstrat păstrarea joncțiunii segmentului interior/segmentului exterior (IS/OS) la fovea, cu pierderea acestui strat în regiunea parafoveală (Fig. 1A). Aceasta a corespuns cu imaginea de autofluorescență a fundului (FAF), care a demonstrat un inel de hiperautofluorescență, frecvent observată la pacienții cu RP (Fig. 1A). La vârsta de 18 ani, pacientul era obez cu un indice de masă corporală (IMC) de 30 kg/m 2, glucoză aleatorie normală (5,0 mmol/L), HbA1c (39 mmol/mol), trigliceride (1,6 mmol/L ).), colesterolul total (4,3 mmol/L) și colesterolul cu lipoproteine ​​de înaltă densitate (HDL) (1,1 mmol/L). Nu au existat caracteristici clinice suplimentare care să sugereze sindromul Bardet-Biedl sau sindromul Alstrom. De remarcat, nu au fost raportate probleme de auz, deși pacientul a avut dificultăți ușoare de învățare.

Am examinat CADĂ utilizarea secvențierii Sanger în 96 de probanzi suplimentari cu RP autosomal-recesiv la debutul copilăriei, unde investigațiile genetice anterioare nu identificaseră gena cauzală și la 55 de pacienți cu obezitate severă și o varietate de fenotipuri oculare din Studiul Genetica Obezității (GOOS); nu s-au găsit variante suplimentare potențial patogene. Într-un studiu anterior, secvențierea CADĂ la 294 subiecți cu PR recesivă nu au identificat nicio mutație cauzală [Xi și colab., 2006] și CADĂ Varianta p.Arg398Serfs * 9 nu a fost, de asemenea, prezentă în peste 6.000 de exome disponibile public (NHLBI exome variant server). În plus, doar două variante de schimbare a cadrelor, care ar putea duce la pierderea completă a funcției CADĂ, au fost găsite în 12.982 alele (NHLBI exome variant server), indicând faptul că pierderea omozigotă a funcției CADĂ este rară (frecvența estimată la 7 persoane).

CADĂ Varianta p.Arg398Serfs * 9 se încadrează în domeniul extrem de conservat C - terminal tubby care se găsește în toți membrii familiei TUB și are ca rezultat o formă trunchiată de TUB (Fig. 1, Sup. Fig. S2). De fapt, s-ar prevedea că va duce la o trunchiere și mai severă decât cea cauzată de mutația identificată inițial la șoarecele pătrat. Am constatat că atunci când a fost transfectată în celule HEK293, varianta p.Arg398Serfs * 9 a fost exprimată, dar la un nivel redus în comparație cu TUB de tip sălbatic (WT) (Fig. 2B). În timp ce GFP-TUB WT a fost detectat în citoplasmă și la nivelul membranei plasmatice, GFP-TUB p.Arg398Serfs * 9 s-a localizat predominant la nucleu (Fig. 2C). Fracționarea subcelulară a confirmat, de asemenea, această localizare greșită; nivelul GFP - TUB p.Arg398Serfs * 9 a fost redus în fracțiunea membranei plasmatice, dar a crescut în fracția legată de cromatină (Fig. 2D). GFP - TUB p.Arg398Serfs * 9, dar nu WT, a fost găsit și în fracțiunea insolubilă a peletei, indicând potențial că poate forma agregate în celule.

De asemenea, am analizat distribuția TUB în retina umană prin imunohistochimie pe criozecții folosind un anticorp ridicat împotriva capătului N-terminal al TUB. Am găsit o expresie puternică a TUB în nucleele stratului ganglionar - celular, precum și în stratul nuclear interior și exterior, și colorarea moderată în segmentul interior al celulelor fotoreceptoare (Fig. 2E). Acest lucru contrastează cu expresia membruului familiei Tub înrudit, TULP1, care este raportat a fi limitat doar la celulele fotoreceptoare [Hagstrom și colab., 1999, 2001; Ikeda și colab., 1999]. Etichetarea cu imunofluorescență dublă a TUB și a markerilor moleculari ai compartimentelor ciliare, și anume anti-centrin3 (conectarea ciliului, corpul bazal și markerul adiacent al centriolului [Trojan și colab., 2008]) și anti-rootletin (marcator al radiculelor ciliare fotoreceptor [Yang și colab., 2002]), a relevat localizarea TUB la baza ciliului fotoreceptor și a rădăcinii ciliare, proiectându-se prin segmentul interior al celulei fotoreceptoare (Fig. 2E).

Prezența TUB la baza ciliară și rădăcina ciliară a celulelor fotoreceptoare este similară cu cea descrisă în studiile anterioare privind TULP1 [Hagstrom și colab., 1999, 2001; Ikeda și colab., 1999]. Se crede că ambele compartimente participă la transportul mărfurilor ciliare [Nachury și colab., 2010; Gilliam și colab., 2012] și există dovezi din ce în ce mai mari că TUB și alți membri ai familiei TUB joacă un rol în furnizarea receptorilor cuplați de proteine ​​G (GPCR) către cili [Mukhopadhyay și Jackson, 2011; Sun și colab., 2012]. Transportul defectuos al rodopsinei este mecanismul probabil prin care apare degenerarea fotoreceptorului [Sun și colab., 2012]. TULP-3 reglează traficul GPCR către cilii primari prin interacțiunea sa cu componentele complexului IFT-A și mutația domeniului C-terminal în TULP-3 la șoareci are ca rezultat localizarea ciliară redusă a GPCR, MCHR1 [Mukhopadhyay și colab., 2010]. În timp ce studii comparabile nu sunt posibile la om, este plauzibil ca varianta p.Arg398Serfs * 9, care perturbă domeniul C - terminal, să afecteze traficul GPCR.

În rezumat, descriem o nouă ciliopatie caracterizată prin distrofie retiniană și obezitate cu debut precoce datorită unei variante homozigote în CADĂ. Deși vor fi necesare studii suplimentare pentru a elucida pe deplin funcțiile moleculare ale TUB, este izbitor faptul că CADĂ variantă raportată aici și toate TULP1 mutațiile descrise până în prezent, perturbă domeniul C-terminal găsit în toți membrii familiei TUB. Vor fi necesare studii suplimentare pentru a testa dacă, la fel ca la șoareci, TUB uman joacă un rol în traficul de GPCR către cili și în modularea semnalizării de către GPCR hipotalamici implicați în homeostazia energetică.

Mulțumiri

Dorim să-i mulțumim doamnei. Gabi Stern - Schneider pentru asistența sa tehnică abilă și Dr. Tiansen Li pentru furnizarea de anticorpi împotriva rooletinului.