Departamentele de Fiziologie,

lipidic

Știința exercițiilor și sportului, Laboratorul de performanță umană,

Departamentele de Fiziologie,

Știința exercițiilor și sportului, Laboratorul de performanță umană,

Anatomie și biologie celulară și

Anatomie și biologie celulară și

Chirurgie, Școala de Medicină Brody, Universitatea din Carolina de Est, Greenville, Carolina de Nord 27858; și

Chirurgie, Școala de Medicină Brody, Universitatea Carolina de Est, Greenville, Carolina de Nord 27858; și

Departamentul de Medicină Internă, Școala de Medicină a Universității Yale, New Haven, Connecticut 06510

Departamentul de Medicină Internă, Școala de Medicină a Universității Yale, New Haven, Connecticut 06510

Departamentele de Fiziologie,

Știința exercițiilor și sportului, Laboratorul de performanță umană,

Abstract

prevalența supraponderalității/obezității și a rezistenței la insulină este în continuă creștere și este asociată cu un risc crescut de dezvoltare a diabetului zaharat non-insulino-dependent (NIDDM), a hipertensiunii și a bolilor cardiovasculare (5, 11,24). Mecanismele celulare responsabile de rezistența la insulină cu supraponderalitate și obezitate nu sunt încă clare. Datele au arătat că triacilglicerolii intramio-celulari (IMTG) cresc cu obezitatea și NIDDM (14, 19, 21). În plus, acumularea IMTG este asociată cu rezistența la insulină a mușchilor scheletici (3, 13, 15,19, 23, 28, 29, 31, 36, 39). Cu toate acestea, se crede că acumularea de IMTG nu este cauza directă a dezvoltării rezistenței la insulină, ci că IMTG este un marker inert pentru prezența altor intermediari lipidici (diacilglicerol, acil-CoA gras sau ceramidă etc.) ., care au fost direct legate de defecte ale semnalizării insulinei (8, 17, 25, 32, 37).

Subiecte umane

Douăzeci și patru de femei au participat la această investigație, care a constat din opt greutate normală [vârsta de 45,1 ± 3,1 ani; indicele de masă corporală (IMC) 23,8 ± 0,58 kg/m 2], opt supraponderali/obezi (vârsta 44,0 ± 2,8 ani; IMC 30,2 ± 0,81 kg/m 2) și opt extrem de obezi (vârsta 37,9 ± 3,3 ani; IMC 53,8 ± 3,5 kg/m 2) pacienți supuși unei intervenții chirurgicale abdominale, în principal bypass gastric și histerectomie abdominală totală. Participanții la cercetare au fost clasificați în grupurile lor respective pe baza IMC și a clasificărilor supraponderale și obezității stabilite de Institutele Naționale de Sănătate (26). Criteriile de includere a IMC pentru subiecții cu greutate normală, supraponderală/obeză și extrem de obeză au fost ≤24,9, 25,0-34,9 și, respectiv, 40 kg/m 2. Protocolul experimental a fost aprobat de către Comitetul de politici și revizuiri al Universității din Carolina de Est din cercetarea umană și s-a obținut consimțământul informat de la toți pacienții. Niciunul dintre subiecți nu a avut boli sau a luat medicamente despre care se știe că modifică metabolismul carbohidraților sau lipidelor. Toți subiecții au menținut o masă corporală constantă în timpul anului anterior intervenției chirurgicale. După un post peste noapte (12-18 ore), anestezia generală a fost inițiată cu un barbituric cu acțiune scurtă și menținută cu fentanil și un amestec oxid de azot-oxigen.

Incubarea benzii musculare

Imediat după îndepărtarea chirurgicală, proba de mușchi rectus abdominus a fost plasată într-un recipient sigilat cu tampon Krebs-Henseleit răcit cu gheață pentru transport la laborator. Benzile musculare au fost incubate într-un sistem de incubare modificat, așa cum s-a descris anterior (7). Pe scurt, benzile musculare cu greutatea de ± 25 mg au fost tachinate din proba de biopsie și fixate în cleme de lucită pentru a menține lungimea și tensiunea musculară constantă în repaus pe tot parcursul preparatului. Fâșiile musculare tăiate au fost plasate imediat în 3,0 ml de tampon Krebs-Henseleit încălzit (30 ° C) gazat cu 95% O2-5% CO2 (pH = 7,4) și conținând 4% albumină serică bovină (fără acizi grași, Sigma Chemical, St. Louis, MO), 5 mM glucoză (Sigma Chemical) și 1 mM palmitat (Sigma Chemical). Acidul palmitic a fost dizolvat în etanol și s-a adăugat un volum mic (0,8% din volumul total al tamponului) la tamponul de incubație pentru a atinge concentrația finală dorită de palmitat.

După o perioadă de preincubare de 30 de minute, probele de mușchi au fost incubate timp de 1 oră la 30 ° C în același mediu de incubare specificat anterior, cu adăugarea a 0,75 μCi de [1-14 C] palmitat (New England Nuclear, Boston, MA) . Aceasta a permis monitorizarea oxidării exogene a palmitatului și încorporarea palmitatului în bazine de lipide endogene. Într-un efort de a elimina contaminarea analizelor bazinelor lipidice endogene, toate lipidele extramicelulare vizibile au fost tachinate cu atenție de pe benzile musculare.

Oxidarea și încorporarea palmitatului în lipidele musculare

Oxidare.

Oxidarea totală a palmitatului a fost determinată prin măsurarea și însumarea producției de 14 CO2 și a metaboliților solubili în apă etichetați cu 14 C. Măsurarea metaboliților solubili în 14 C-apă a reprezentat orice etichetă de 14 C care nu a dus la 14 CO2 datorită schimbului izotopic în ciclul acidului tricarboxilic.

14 CO2 gazos produs din oxidarea palmitatului [1-14C] în timpul incubației a fost măsurat prin transferarea a 1,0 ml de mediu de incubare într-un flacon de scintilație de sticlă de 20 ml conținând 1,0 ml H2SO4 1 M și o microcentrifugă Fisher de 0,5 ml tub care conține 400 μl de hidroxid de benzetoniu. 14 CO2 eliberat a fost prins în hidroxidul de benzetoniu timp de 60 de minute, iar tubul de microcentrifugă care conține 14 CO2 prins a fost plasat într-o fiolă de scintilație și numărat. 14 metaboliți solubili în apă C au fost măsurați prin prelevarea a 0,5 ml de fază apoasă a extracției lipidelor (explicat înExtragerea lipidelor musculare), care a fost plasat într-un flacon de scintilație și numărat.

Extragerea lipidelor musculare.

Analize roșu-ulei

Datorită tiparului de încorporare a palmitatului [14 C] în IMTG și IMLC, a fost efectuat un experiment suplimentar pentru a examina IMLC total (TLC) într-un mușchi locomotiv într-un set separat de subiecți de sex feminin. Analiza Oil-Red-O (30) a fost efectuată pe probe de biopsie vastus lateralis din greutate normalăn = 6, IMC 22,1 ± 0,8 kg/m 2), supraponderal/suspendatn = 6, IMC 32,9 ± 0,8 kg/m 2) și extrem de obezn = 7, IMC 42,8 ± 0,9 kg/m 2) femele.

Probele de mușchi au fost obținute prin biopsierea mușchiului vastus lateralis cu un ac Bergstrom și o seringă de aspirație, cu subiecți sub anestezie locală. Probele de biopsie au fost fracționate și preparate pentru microscopie în câmp luminos și analize de ulei roșu-O. Pe scurt, probele de mușchi au fost fixate în Formalin tamponat 10% timp de 24 de ore, urmată de o incubație de 24 de ore în zaharoză 30%. Probele au fost montate într-un compus cu temperatură optimă de tăiere (OCT) · amestec de gumă tragacant și congelate în izopentan răcit pe lichid N2. Probele de mușchi au fost secționate în felii longitudinale de 10 μm și plasate într-o soluție de alcool izopropilic 60% timp de 1 s, urmată de o incubare de 1 oră în colorant Oil Red-O. Probele au fost apoi clătite scurt (1-3 s) cu 60% alcool izopropilic și spălate timp de 3 minute sub apă curentă de la robinet. S-a efectuat o contrapătare în hematoxilina lui Harris timp de 5 minute, care a fost urmată de o spălare de 3 minute sub apă curentă de la robinet, o spălare de 3 minute cu clorură de litiu și o spălare suplimentară de 5 minute cu apă de la robinet.

Diapozitivele au fost vizualizate utilizând un microscop Nikon Microphot FX (Nikon, Tokyo, Japonia) la o mărire de × 10 și cuantificate cu Spot Advanced 3.2.4 (Instrumentele de diagnosticare, Sterling Heights, MI) și Image-Pro Plus 4.1 (Media Cybernetics LP, Silver Spring, MD). Spot Advanced 3.2.4 a fost folosit pentru a captura și digitaliza imagini din lamele de microscopie cu lumină. Imaginile au fost salvate ca fișier cu format de imagine etichetat (TIFF-32 biți). Image-Pro Plus 4.1 a fost utilizat pentru a cuantifica TLC în imaginile digitalizate. Pe scurt, imaginea a fost mărită pentru a permite vizualizarea pixelilor individuali care indică zone de colorare cu ulei roșu-O. Prin utilizarea unui instrument de pointer, s-au evidențiat pixeli roșii, care au inițiat un răspuns automat al programului care a evidențiat alți pixeli din imagine cu aceeași intensitate de colorare. După ce această procedură a fost repetată de mai multe ori, imaginea a fost demagnificată la dimensiunea inițială și inspectată pentru a vedea dacă toate zonele de colorare au fost luate în considerare. În acest moment, imaginea a fost, de asemenea, inspectată pentru a se asigura că nu au fost evidențiate eronat lipide extramicelulare sau artefacte de colorare. În plus, suprafața totală a mușchilor scheletici a fost, de asemenea, determinată utilizând aceeași procedură.

Analize acil-CoA grase

Din aceeași probă rectus abdominus în care s-au obținut probele incubate, a fost fracționată o probă separată (50-100 mg) și toate grăsimile vizibile și/sau țesutul conjunctiv au fost îndepărtate și congelate în lichid N2 pentru analize ulterioare. Acil-CoA cu catenă lungă au fost extrase din proba musculară prin extracție în fază solidă și s-a adăugat CoA cu 17 carbonii ca standard intern, așa cum s-a descris anterior (2, 27). Pentru analiza MS-MS a fost utilizat un spectrometru de masă tandem API 3000 (Perkin-Elmer Sciex) interfațat cu o sursă de ionizare TurboIonspray (27). Acil-CoA-uri grase au fost ionizate într-un mod de pulverizare negativă, iar perechile de tranziție [M-2H] 2-/[M-H-80] - au fost monitorizate în modul de monitorizare a reacțiilor multiple. Ionii încărcați în mod dublu și ionii de produs corespunzători (precursor minus grupul fosfat) au fost aleși ca pereche de tranziție pentru monitorizarea reacțiilor multiple pentru cuantificare (27). Conținutul total de acil-CoA cu catenă lungă a fost calculat ca suma speciilor acil-CoA cu catenă lungă măsurată.

Calcule și statistici

Cantitatea absolută de palmitat oxidat (nmol) a fost determinată prin măsurarea radioactivității (dpm) în flacoane conținând metaboliții 14 CO2 și 14 C-solubili în apă prinși. Pe baza activității specifice a palmitatului marcat în mediul de incubație [adică palmitat radiomarcat (dpm)/palmitat total (nmol)], dpm au fost transformate în palmitat total oxidat. Cantitatea de palmitat încorporată în bazinele lipidice endogene a fost calculată în același mod după ce s-a determinat radioactivitatea în diferitele fracțiuni lipidice. Un raport între încorporarea palmitatului și oxidarea palmitatului a fost utilizat pentru a examina diferențele în partiția acizilor grași ai mușchilor scheletici între grupuri. Toate datele sunt raportate ca mijloace ± SE. Rezultatele au fost analizate folosind procedurile de analiză a varianței (ANOVA), iar testul post hoc al lui Tukey a fost utilizat pentru a testa diferențele semnificative relevate de ANOVA. Analizele corelaționale Pearson au fost utilizate pentru a examina asociațiile dintre metabolismul palmitatului, caracteristicile subiectului și conținutul de acil-CoA gras. Semnificația a fost acceptată la P

FIG. 1.[14 C] oxidarea palmitatului în benzi rectus abdominus de la femele cu greutate normală, supraponderale/obeze și extrem de obeze. Datele sunt exprimate ca mijloace ± SE. * Extrem de obezi au statistic (P

Nu s-au observat diferențe semnificative statistic între grupuri pentru încorporarea palmitatului în IMTG sau IMLC; cu toate acestea, încorporarea palmitatului în IMTG a fost cu 40 și 37% mai mare la persoanele extrem de obeze comparativ cu pacienții cu greutate normală și, respectiv, supraponderali/obezi. IMLC a fost cu 22% mai mare la persoanele extrem de obeze comparativ cu pacienții cu greutate normală și, respectiv, supraponderali/obezi. Incorporarea palmitatului în IMTG (R = 0,54,P = 0,007) și IMLCR = 0,53,P = 0,009) a fost semnificativ corelat cu IMC.

Pacienții extrem de obezi au prezentat un raport de partiționare a acidului gras cu 94 și 105% mai mare (raportul dintre încorporare și oxidare) comparativ cu pacienții cu greutate normală și, respectiv, supraponderali/obezi (Fig. 2). Nu s-au observat diferențe în partiționarea acizilor grași între grupurile cu greutate normală și cele cu supraponderalitate/obezi.

FIG. 2.Împărțirea acizilor grași (raportul dintre încorporarea palmitatului și palmitatul oxidat) în benzile rectus abdominus de la femele cu greutate normală, supraponderale/obeze și extrem de obeze. Datele sunt exprimate ca rapoarte medii ± SE. * Extrem de obezi au un raport de partiționare semnificativ mai mare (P

Analize roșu-ulei

Nu au existat diferențe în TLC (figura 3) între pacienții cu greutate normală și cei supraponderali/obezi obezi. Mușchiul scheletic de la pacienții extrem de obezi conținea 224 și 201% mai mult TLC comparativ cu pacienții cu greutate normală și, respectiv, supraponderali/obezi.

FIG. 3.Conținutul de lipide intramiocelulare în vastus lateralis pe baza analizelor Oil Red-O. Datele sunt exprimate ca mijloace ± SE. * Extrem de obezi au statistic (P

Analize acil-CoA grase cu lanț lung

Datele acil-CoA cu lanț lung sunt prezentate în Fig.4. Concentrațiile de palmitoil-CoA (C16: 0), oleat-CoA (C18: 1), linoleat-CoA (C18: 2) și acil-CoA gras total au fost semnificativP

FIG. 4.Concentrații grase de acil-CoA: palmitoil-CoA (C16: 0), palmitoleat (C16: 1), stearoil-CoA (C18: 0), oleat-CoA (C18: 1), linoleat-CoA (C18: 2). Datele sunt exprimate ca mijloace ± SE. * Statistic diferit (P

Au existat două constatări majore din prezentul studiu.1) Oxidarea in vitro a palmitatului este redusă semnificativ în mușchiul scheletal la pacienții extrem de obezi; și 2) concentrațiile de acil-CoAs cu catenă lungă totală și subfracțiuni de acil-CoA cu catenă lungă au fost semnificativ mai mari la pacienții supraponderali/obezi și extrem de obezi comparativ cu pacienții cu greutate normală, în ciuda unei reduceri a oxidării acizilor grași numai la cei cu obezitate extremă.

Un mecanism potențial pentru reducerea oxidării acizilor grași cu obezitate extremă poate fi o capacitate oxidativă tocită. Această noțiune este susținută de lucrările anterioare din laboratorul nostru (22) în care s-a demonstrat că două enzime cunoscute a fi etape de limitare a vitezei în oxidarea acizilor grași (β-hidroxiacil dehidrogenază și citrat sintază) au o activitate semnificativ mai scăzută în țesutul muscular rectus abdominus din subiecți extrem de obezi în comparație cu martorii cu greutate normală. În plus, activitatea carnitinei palmitoiltransferazei I, care este o etapă de limitare a ratei de intrare a acil-CoAsului gras în mitocondrii pentru oxidare, a fost, de asemenea, semnificativ mai mică în mușchii scheletici extrem de obezi, comparativ cu martorii nonobezi (21). Mai mult, Hickey și colab. (18) au demonstrat că procentul de fibre musculare de tip I în țesutul rectus abdominus a fost semnificativ mai mic la extrem de obezi comparativ cu subiecții cu greutate normală. Astfel, se pare că reducerea oxidării acizilor grași observată cu obezitate extremă se poate datora, cel puțin parțial, unei scăderi a capacității oxidative a mușchilor scheletici.

O dependență scăzută de lipide ca sursă de energie a fost identificată anterior ca un factor de risc metabolic pentru creșterea în greutate (40). În plus, Kelley și colab. (21) au sugerat că afectarea oxidării acizilor grași ai mușchilor scheletici ar putea fi un factor predispozant care să contribuie la dezvoltarea obezității, precum și la recâștigarea greutății după pierderea în greutate. Mai mult, datele recente din laboratorul nostru (16) au demonstrat persistența reducerii oxidării acizilor grași în timpul efortului la pacienții foști extrem de obezi după pierderea în greutate, comparativ cu controalele potrivite pentru vârstă, rasă și IMC. Aceste descoperiri indică faptul că, chiar și într-o stare de greutate redusă, femeile care erau în trecut extrem de obeze demonstrează un defect în capacitatea de a utiliza grăsimile pentru energie și oferă astfel un sprijin suplimentar pentru teoria conform căreia oxidarea deficitară a lipidelor poate predispune persoanele la obezitate extremă.

Pe scurt, constatările din investigația actuală indică un defect al oxidării acizilor grași ai mușchilor scheletici cu obezitate extremă, dar nu și la subiecții supraponderali/obezi. Pe baza acestor date, presupunem că obezitatea extremă se poate datora, în parte, unor defecte inerente în metabolismul lipidic al mușchilor scheletici. Este important să discernem mecanismele celulare care pot contribui la obezitatea extremă, deoarece indivizii extrem de obezi cuprind aproximativ 5% din populație și contribuie semnificativ la costurile de îngrijire a sănătății (12). În plus, pe baza rezultatelor acestui studiu, acumularea de acil-CoA-uri cu lanț lung intramio-celular nu pare a fi rezultatul unei oxidări lipidice defecte. Astfel, acumularea de acil-CoA cu grăsime cu lanț lung implicată în patogeneza rezistenței la insulină în mușchii scheletici obezi trebuie să se datoreze unui alt mecanism, încă de definit,.

Mulțumim cu recunoștință consultării valoroase de la Dr. David J. Dyck în dezvoltarea metodelor de cercetare utilizate pentru a examina oxidarea acizilor grași în această investigație.

NOTĂ DE PICIOASĂ

Această cercetare a fost susținută de finanțarea acordată de un grant al Institutului Național de Diabet și Boli Digestive și Rinice (DK-56112, JA Houmard), un grant de Cercetare Clinică de la Asociația Americană a Diabetului (GL Dohm) și un Premiu al Serviciului Național de Cercetare (F32- DK-6260501, MW Hulver).

Adresa pentru cereri de reimprimare și alte corespondențe: M. W. Hulver, Dept. of Physiology, The Brody School of Medicine, 3E-100 Brody Medical Sciences Bldg, East Carolina University, Greenville, NC 27858 (E-mail: [email protected] ecu. edu).

Costurile de publicare a acestui articol au fost suportate parțial prin plata taxelor de pagină. Prin urmare, articolul trebuie marcat prin prezenta „publicitate”În conformitate cu 18 U.S.C. Secțiunea 1734 doar pentru a indica acest fapt.

Publicat pentru prima dată 27 decembrie 2002; 10.1152/ajpendo.00514.2002