Secția de afiliere Neonatologie, Spitalul pentru copii din Texas, Divizia de chirurgie pediatrică, Departamentul de chirurgie Michael E. DeBakey, Colegiul de Medicină Baylor, Houston, Texas, Statele Unite ale Americii

întârziată

Afiliere Departamentul de Agricultură al Statelor Unite/Serviciul de Cercetări Agricole Centrul de Cercetare în Nutriția Copiilor, Spitalul de Copii din Texas, Divizia de Chirurgie Pediatrică, Departamentul de Chirurgie Michael E. DeBakey, Colegiul de Medicină Baylor, Houston, Texas, Statele Unite ale Americii

Afiliere Departamentul de Agricultură al Statelor Unite/Serviciul de Cercetări Agricole Centrul de Cercetare în Nutriția Copiilor, Spitalul de Copii din Texas, Divizia de Chirurgie Pediatrică, Departamentul de Chirurgie Michael E. DeBakey, Colegiul de Medicină Baylor, Houston, Texas, Statele Unite ale Americii

Afiliere Departamentul de Agricultură al Statelor Unite/Serviciul de Cercetări Agricole Centrul de Cercetare în Nutriția Copiilor, Spitalul de Copii din Texas, Divizia de Chirurgie Pediatrică, Departamentul de Chirurgie Michael E. DeBakey, Colegiul de Medicină Baylor, Houston, Texas, Statele Unite ale Americii

Secția de afiliere Neonatologie, Spitalul pentru copii din Texas, Divizia de chirurgie pediatrică, Departamentul de chirurgie Michael E. DeBakey, Colegiul de Medicină Baylor, Houston, Texas, Statele Unite ale Americii

Departamentul de Afiliere Neonatologie, Spitalul Universitar La Paz, Madrid, Spania

Afiliere Spitalul de Copii din Texas, Divizia de Chirurgie Pediatrică, Departamentul de Chirurgie Michael E. DeBakey, Colegiul de Medicină Baylor, Houston, Texas, Statele Unite ale Americii

Afiliere Spitalul de Copii din Texas, Divizia de Chirurgie Pediatrică, Departamentul de Chirurgie Michael E. DeBakey, Colegiul de Medicină Baylor, Houston, Texas, Statele Unite ale Americii

Afiliere Mead Johnson Pediatric Nutrition Institute, Evansville, Indiana, Statele Unite ale Americii

Afiliere Mead Johnson Pediatric Nutrition Institute, Evansville, Indiana, Statele Unite ale Americii

Afilieri Departamentul de Agricultură al Statelor Unite/Serviciul de Cercetări Agricole Centrul de Cercetare în Nutriția Copiilor, Spitalul de Copii din Texas, Divizia de Chirurgie Pediatrică, Departamentul de Chirurgie Michael E. DeBakey, Colegiul de Medicină Baylor, Houston, Texas, Statele Unite ale Americii, Secția de Gastroenterologie, Hepatologie și nutriție, Departamentul de Pediatrie, Spitalul de Copii din Texas, Divizia de Chirurgie Pediatrică, Departamentul de Chirurgie Michael E. DeBakey, Colegiul de Medicină Baylor, Houston, Texas, Statele Unite ale Americii

  • Nada Ghoneim,
  • Caroline Bauchart-Thevret,
  • Berthe Oosterloo,
  • Barbara Stoll,
  • Madhulika Kulkarni,
  • Miguel Saenz de Pipaon,
  • Irving J. Zamora,
  • Oluyinka O. Olutoye,
  • Brian Berg,
  • Anja Wittke

Cifre

Abstract

Hrănirea cu formulă enterală este un factor de risc pentru enterocolita necrozantă (NEC) la sugarii prematuri, totuși studiile sunt contradictorii în ceea ce privește momentul cel mai sigur pentru introducerea și avansarea furajelor. Scopul nostru a fost să testăm efectele timpurii vs. inițiere târzie și bruscă vs. avansarea treptată a hrănirii enterale a unui intact vs. formula proteică hidrolizată asupra incidenței și severității NEC la porcii prematuri. În Experimentul 1, porcii prematuri au primit nutriție parenterală totală (TPN) la naștere cu inițierea bruscă a hranei cu formulă enterală (50% aport total) pe zi de viață (DOL) 2 (EA) sau 5 (LA) în timp ce PN a continuat. Porcii au fost, de asemenea, hrăniți cu formule care conțin fie proteine ​​intacte, fie proteine ​​hidrolizate. În Experimentul 2, porcii prematuri au primit TPN la naștere cu hrană de formulă proteică hidrolizată enterală introdusă pe DOL 2 fie brusc (EA; 50% hrană completă), fie treptat (EG; 10-50% hrană completă peste 5 zile) în timp ce PN a continuat . Incidența și severitatea NEC au fost evaluate pe baza scorurilor macroscopice și histologice. În Experimentul 1, incidența NEC (41% vs. 70%, P Figura 1. Proiectarea studiului Experimentului 1, EA vs. LA și Experiment 2, EA vs. EG.

La DOL 0, porcii au fost livrați prematur 12-d prin secțiune C și au fost implantați chirurgical cu catetere orogastrice și jugulare. (A) În Experimentul 1, formula enterală (hrănirea IG cu proteine ​​intacte sau hidrolizate) a fost introdusă brusc la 50% din aportul total de hrănire fie pe DOL 3 după 2 zile de TPN (grup EA), fie pe DOL 6 după 5 zile al TPN (grupul LA). (B) În experimentul 2, formula enterală (hrănirea IG cu cazeină hidrolizată) a fost introdusă fie brusc (grup EA) la 50% din aportul total de hrănire pe DOL 3 după 2 zile de TPN, fie avansată treptat (grup EG) începând cu 10% din aportul total de hrănire pe DOL 3 până la 50% pe DOL 7 cu o creștere zilnică de 10%. Porcii au fost cântăriți la fiecare două zile și aportul lor a fost ajustat în consecință. Semnele NEC au fost monitorizate la fiecare alimentare. Porcii au fost eutanasiați la semne de NEC sau la 5 zile după începerea hrănirii IG și au fost colectate țesuturi. EA, brusc devreme; LA, târziu brusc. EG, gradual devreme.

Porcii au fost cântăriți la fiecare două zile și aportul lor a fost ajustat în consecință. La fiecare hrănire, porcii au fost verificați pentru simptome clinice ale NEC, inclusiv prezența reziduurilor gastrice, vărsături, diaree, scaune sângeroase, distensie abdominală și suferință respiratorie. Porcii au fost eutanasiați când au dezvoltat semne de NEC sau după 5 zile de hrană enterală (DOL 7 pentru grupul EA și DOL 10 pentru grupul LA).

Proiectarea studiului: experimentul 2 (hrănire bruscă vs. hrănire treptată)

Un total de 43 de porci din 5 litri au fost incluși în Experimentul 2. Pe baza greutății corporale, porcii au fost repartizați aleatoriu la introducerea EA (Early Abrupt) sau EG (Early Gradual) a furajelor enterale. Porcii din grupul EA (n = 27) au primit același protocol de hrănire și TPN ca în Experimentul 1; cu toate acestea, a fost utilizată doar formula proteică hidrolizată. Porcii din grupul EG (n = 16) au început, de asemenea, hrăniri enterale (hrănire IG) cu formulă proteică hidrolizată pe DOL 2, dar au fost începute cu 10% necesară zilnică totală (3 ml/kg la fiecare 3 ore) și PN (hrănire IV) la 70% (7 ml/kg * h). În fiecare zi ulterioară, rata de hrănire IG a fost crescută cu 10% până la un maxim de 50% necesară zilnică totală de DOL 6, iar PN a fost ajustat în consecință pentru a menține 100% necesarul nutrițional zilnic total (Figura 1B). La fel ca în Experimentul 1, porcii au fost cântăriți la fiecare două zile și aporturile au fost ajustate în consecință, iar porcii au fost monitorizați pentru semne de NEC la fiecare 3 ore în momentul fiecărui furaj. Porcii au fost eutanasiați când au dezvoltat semne de NEC sau după 5 zile de hrănire enterală (DOL 7 pentru ambele grupuri).

Analiza țesuturilor și evaluarea NEC

La momentul decesului, fiecare porc a fost cântărit și s-a efectuat necropsie. Conținutul stomacului a fost cântărit, iar stomacul, jejunul, ileonul și colonul au fost inspectate pentru semne de NEC. Fiecăreia dintre aceste zone i s-a atribuit un scor clinic de severitate NEC (1-6) pe baza liniilor directoare stabilite din studiile anterioare [24]. Scoruri de 5 sau 6 au fost date dacă au fost prezente necroze brute și/sau pneumatoză. Porcilor cu un scor clinic de severitate NEC de 3 sau mai mare în oricare dintre cele 4 țesuturi li s-a dat un diagnostic preliminar de NEC.

Probele de țesut intestinal (jejun, ileon și colon) au fost colectate și înghețate la -80 ° C pentru analiza expresiei genice și fixate în 10% formalină pentru analize histologice. Secțiunile fixate pe formalin au fost încorporate în parafină, tăiate în secțiuni de 4 µm grosime și colorate cu H&E. Aceste secțiuni au fost utilizate pentru măsurători morfometrice (înălțimea vilozității și adâncimea criptei) folosind Scion Image Software (Scion Corporation 2000–2001, versiunea Alpha 4.0.3.2, Maryland, SUA) și scorurile histologice NEC. Scorarea histologică a NEC sa bazat pe un sistem de notare stabilit anterior pentru NEC, dezvoltat în modelul rozătoarelor [25]. Țesuturile intestinale au fost inspectate microscopic și li s-a atribuit un scor histologic de severitate NEC (0-4) pe baza gradului de afectare epitelială și/sau mucoasă. Țesuturile cu leziuni mai mari au primit scoruri de 3-4 indicând prezența necrozei și/sau pneumatozei. Observatorul a fost orbit de diagnosticul preliminar NEC al fiecărui porc care a fost atribuit prin punctaj clinic. Porcilor cu un scor histologic de severitate NEC de 2 sau mai mare li s-a dat un diagnostic definitiv de NEC. Imagini cu câmp luminos ale secțiunilor transversale histologice ale jejunului, ileonului și colonului colorate cu H&E au fost realizate utilizând software-ul Picture Frame Application 2.3.

PCR cantitativă în timp real a țesutului ileal

Analiza PCR cantitativă în timp real (RT-qPCR) a fost efectuată pe probe ileale ale tuturor porcilor pentru a evalua expresia următoarelor gene implicate în imunitatea înnăscută și implicate în dezvoltarea NEC: IL1-β, IL-6, S100A9, TLR-4, TNFa. ARN total a fost izolat folosind kitul RNeasy Midi (Qiagen) și a fost tratat cu ADNse folosind kitul fără DNază de la Ambion (# AM1906). ARN-ul tratat cu ADNs a fost utilizat pentru reacțiile de transcripție inversă folosind kitul de transcripție inversă cADN de mare capacitate (Applied Biosystem), iar produsele ADNc au fost stocate la 4 ° C până când RT-qPCR a fost efectuat utilizând kitul qPCR Superscript III Platinum în SYBR Green (Invitrogen) pe mașinile PCR în timp real Bio Rad CFX96. Secvențele de primer oligonucleotidic au fost proiectate folosind NCBI Primer Blast (Tabelul S2). Cuantificarea relativă a expresiei țintă a ARNm a fost calculată și normalizată la expresia β-actinei. Toate reacțiile au fost efectuate în următoarele condiții de ciclare termică: 10 minute la 95 ° C, urmate de 40 de cicluri de 95 ° C timp de 15 secunde și 60 ° C timp de 60 de secunde. Metoda 2 −ΔΔCT a fost utilizată pentru a compara nivelurile de expresie a genelor între probe, care au fost analizate pentru a determina inducerea ori a expresiei ARNm.

analize statistice

Scorurile incidenței și severității NEC și simptomelor clinice NEC.

Incidența NEC determinată de scorurile clinice ale severității NEC a fost aceeași cu cea determinată de scorurile histologice ale severității NEC în ambele grupuri (adică 70% în EA și 41% în LA). Incidența NEC a fost mai mică (-41%, P Figura 2. Incidența clinică a NEC, scorurile de severitate a NEC și greutățile conținutului stomacal în Experimentul 1.

(A) Valorile incidenței clinice NEC sunt suma tuturor cazurilor clinice NEC și exprimate în procente. Incidența clinică a NEC a fost aceeași cu incidența histologică a NEC. Combinat, n = 22 (LA) -40 (EA); Proteină hidrolizată, n = 11 (LA) -27 (EA); Proteină intactă, n = 11 (LA) -13 (EA); * P Figura 3. Secțiuni transversale intestinale din Experimentul 1.

Greutatea conținutului de stomac a fost comparată la porcii cărora li s-au administrat hidrolizați vs. formula proteică intactă. Conținutul de stomac a fost mai mare (+ 76% în EA, P Figura 4. Analiza supraviețuirii și analiza de regresie liniară a scorurilor severității NEC față de supraviețuirea în Experimentul 1.

(A) Estimările supraviețuirii Kaplan-Meier determinate după prima hrănire IG și exprimate în procente. Rezultatele nu au fost semnificative. EA, n = 40; LA, n = 22. (B) Analiza de regresie liniară a scorurilor clinice ale severității NEC vs. supraviețuirea după prima hrănire IG efectuată pe grupuri combinate de EA și LA. Pentru fiecare porc, scorul clinic al severității NEC reprezintă suma scorurilor clinice ale severității NEC (scor total) în stomac, jejun, ileon și colon. Scorurile clinice ale severității NEC au fost corelate negativ cu supraviețuirea (n = 62; P Figura 5. Expresia genei proinflamatorii în ileonul porcilor din Experimentul 1.

Valorile expresiei genice sunt exprimate ca schimbare de pliuri vs. grupul EA - proteine ​​intacte (fără NEC + NEC). β-actina a fost utilizată ca control intern. n = 19-39; * P Figura 6. Incidența clinică și histologică a NEC și scorurile de severitate a NEC în experimentul 2.

(A) Valorile incidenței NEC sunt suma tuturor cazurilor NEC clinice sau histologice și exprimate în procente. Rezultatele nu au fost semnificative. EA, n = 27; EG, n = 16. (B) Scorurile clinice ale severității NEC determinate în stomac (Stom), jejun (Jej), ileon (Ile), colon (Col) și toate cele 4 țesuturi combinate (Tot). Pentru fiecare țesut, clasele 1–2 reprezintă „Fără NEC”, iar clasele 3–6 reprezintă „NEC”. Pentru țesuturile combinate, scorul maxim clinic al severității NEC este de 24. EA, n = 27; EG, n = 16. (C) scoruri histologice de severitate NEC determinate în jejun (Jej), ileon (Ile), colon (Col) și toate cele 3 țesuturi combinate (Tot). Pentru fiecare țesut, clasele 0-1 reprezintă „NEC” și clasele 2-4 reprezintă „NEC”. Pentru țesuturile combinate, scorul maxim histologic al severității NEC este de 12. EA, n = 27; EG, n = 16; * P Tabelul 3. Morfometria intestinală în experimentul 2.

Analiza supraviețuirii.

Analiza supraviețuirii Kaplan-Meier a arătat că supraviețuirea nu a fost diferită între porcii din EG vs. Grupul EA (Figura 8A). Cu toate acestea, așa cum s-a observat în Experimentul 1, porcii din Experimentul 2 cu un scor clinic și histologic ridicat de severitate NEC au avut supraviețuire mai micăFigura 8B - C).

(A) Estimările supraviețuirii Kaplan-Meier determinate după prima hrănire IG și exprimate în procente. Rezultatele nu au fost semnificative. EA, n = 27; EG, n = 16. (B) Analiza de regresie liniară a scorurilor clinice ale severității NEC vs. supraviețuirea după prima hrănire IG efectuată pe grupe combinate EA și EG. Pentru fiecare porc, scorul clinic al severității NEC reprezintă suma scorurilor clinice ale severității NEC (scor total) în stomac, jejun, ileon și colon. Scorurile clinice ale severității NEC au fost corelate negativ cu supraviețuirea (n = 43; P Figura 9. Expresia genei proinflamatorii în ileonul porcilor din Experimentul 2.