Departamentul de Afiliere pentru Biochimie și Biotehnologie, Grupul de Cercetare Nutrigenomică, Universitatea din Rovira și Virgili, Tarragona, Spania

cafenea

Unitate tehnologică de afiliere pentru nutriție și sănătate, Centrul tehnologic EURECAT din Catalonia, Reus, Spania

Unitate tehnologică de afiliere pentru nutriție și sănătate, Centrul tehnologic EURECAT din Catalonia, Reus, Spania

Affiliation Institut de Neurociències, Departament de Psiquiatria i Medicina Legal, Universitat Autònoma de Barcelona, ​​Barcelona, ​​Spain

Afilieri Departament de Bioquímica i Biotecnologia, Nutrigenomics Research Group, Universitat Rovira i Virgili, Tarragona, Spania, Unitatea tehnologică de nutriție și sănătate, EURECAT-Centrul tehnologic al Cataluniei, Reus, Spania

Departamentul de Afiliere pentru Biochimie și Biotehnologie, Grupul de Cercetare Nutrigenomică, Universitatea din Rovira și Virgili, Tarragona, Spania

  • Susana Suárez-García,
  • Josep M. del Bas,
  • Antoni Caimari,
  • Rosa M. Escorihuela,
  • Lluís Arola,
  • Manuel Suárez

Cifre

Abstract

Citare: Suárez-García S, del Bas JM, Caimari A, Escorihuela RM, Arola L, Suárez M (2017) Impactul unei diete de cafenea și a antrenamentului fizic zilnic asupra metabolomului seric al șobolanilor. PLOS ONE 12 (2): e0171970. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0171970

Editor: Guillermo López Lluch, Universitatea Pablo de Olavide, SPANIA

Primit: 22 septembrie 2016; Admis: 27 ianuarie 2017; Publicat: 13 februarie 2017

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se află în hârtie și în fișierele sale de informații de suport.

Finanțarea: Sprijinul a fost oferit de Ministerul Spaniol al Economiei și Competitivității PSI 2011-29807-C02/PSIC către Rosa María Escorihuela și de Ministerul Spaniol al Economiei și Competitivității AGL2013-40707-R către Lluís Arola.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Sindromul metabolic (MetS) este o combinație de tulburări metabolice, inclusiv rezistența la insulină, dislipidemie, obezitate și hipertensiune, care devine din ce în ce mai răspândită în societatea noastră datorită stilului de viață sedentar și a tiparelor dietetice [1-3]. Având în vedere că această tulburare poate duce la boli cardiovasculare [4] și diabet de tip II [5], se depun eforturi mari pentru a preveni dezvoltarea acesteia. S-a demonstrat că activitatea fizică oferă efecte benefice, inclusiv pierderea în greutate, modificări ale procentului de grăsime corporală și îmbunătățiri ale tensiunii arteriale, profilului lipoproteinelor, nivelului colesterolului și sensibilității la insulină [6-8]. În special la adolescenți, înlocuirea obiceiurilor sedentare, cum ar fi vizionarea la televizor timp de multe ore cu activitate fizică crescută, este principala strategie pentru prevenirea și tratamentul obezității [9].

Unii cercetători au încercat să identifice profiluri distincte de metaboliți asociați cu obezitatea la adulți [14] și tineri [15]. Toate aceste studii indică importanța descoperirii biomarkerilor pentru diagnosticul precoce, tratamentul și evaluarea bolilor legate de stilul de viață. Studii recente au aplicat metabolomică cuprinzătoare pentru a descoperi perturbațiile metabolitului la șobolanii hrăniți cu CAF [12,16] și la rozătoarele instruite [17,18]; cu toate acestea, influența combinată a CAF și a activității fizice zilnice asupra metabolomului circulant nu a fost încă investigată.

Obiectivele acestui studiu au fost (1) identificarea noilor metaboliți circulanți influențați de aportul cronic de CAF la șobolani, (2) identificarea modificărilor ulterioare ale metabolomului care ne pot ajuta să înțelegem mecanismele prin care antrenamentul periodic își exercită efectele benefice (sau dăunătoare) la animalele tinere, (3) pentru a examina dacă există diferențe între efectele exercițiilor de intensitate scăzută și înaltă și (4) pentru a verifica dacă aceste procese biochimice diferă între animalele cu și fără MetS.

Scopul nostru a fost realizat folosind cromatografia lichidă cuplată cu spectrometria de masă (LC-MS/MS), o tehnică puternică foarte potrivită pentru studiile de metabolomică care permite identificarea alterărilor moleculare în rândul grupurilor experimentale. Utilizarea metabolomicii comparative neintenționate permite identificarea biomarkerilor potențiali și a semnăturilor metabolice caracteristice care pot fi predictive pentru starea de sănătate a animalelor.

Material si metode

Produse chimice

Acetonitrilul (Merck, Darmstadt, Germania), acidul acetic glacial (Panreac, Barcelona, ​​Spania), metanolul și acidul formic (Scharlab S.L., Barcelona, ​​Spania) au fost de calitate analitică de înaltă performanță pentru cromatografie lichidă (HPLC). Apa ultra-pură a fost obținută utilizând un sistem Milli-Q avantaj A10 (Madrid, Spania). Pentru spectrometria de masă, paracetamolul și pirocatecholul (Fluka/Sigma-Aldrich, Madrid, Spania) au fost utilizate ca standarde interne în modul de ionizare electrospray pozitiv (+ ESI) și respectiv negativ (-ESI). Ambele au fost dizolvate în metanol la 1 mg/ml și depozitate la -20 ° C.

Animale, diete și sesiuni de antrenament

Șobolanii Sprague-Dawley femele cu greutatea de 62 ± 2 g au fost înțărcați la vârsta de 21-23 de zile și au adăpostit 2 pe cușcă la 22 ° C cu o perioadă de lumină/întuneric de 12 ore. Animalele femele au fost selectate deoarece tolerează intensități mai mari de exercițiu forțat în comparație cu masculii și sunt mai active în rularea voluntară a roții [19,20]. Animalele au fost distribuite aleatoriu în 6 grupuri (n = 9-12) în funcție de dietă (ST sau CAF) și intensitatea intervenției de bandă de alergare primită pe parcursul a 8 săptămâni: control-ST (CON-ST), bandă de alergare-intensitate scăzută- ST (TML-ST), bandă de alergare-intensitate mare-ST (TMH-ST), control-CAF (CON-CAF), bandă de alergare-intensitate mică-CAF (TML-CAF) sau bandă de alergare-intensitate mare-CAF (TMH-CAF ))).

CAF a inclus următoarele componente (cantitate pe șobolan/zi): ST (6-10 g), slănină (8-12 g), biscuiți cu pateu (12-15 g) sau cremă de brânză (10-12 g), dulce rulou (8-10 g), morcov (6-9 g) și lapte cu zahăr (220 g/L; 50 mL). ST a avut o defalcare calorică de 24% proteine, 18% grăsimi și 58% carbohidrați, în timp ce CAF avea 10% proteine, 41% grăsimi și 49% carbohidrați [21]. Animalele au consumat apă de la robinet și dietă ad libitum pe tot parcursul experimentului, iar CAF a fost reînnoit zilnic.

Sesiunile de instruire au fost efectuate așa cum s-a descris anterior [13]. Pe scurt, șobolanii au fost antrenați pe o bandă de alergat 5 zile pe săptămână timp de 30 de minute. Inițial, animalele erau obișnuite cu banda de alergat (0 m/min), iar viteza a fost crescută progresiv până când a ajuns la 12 m/min în TML și 17 m/min în grupurile TMH. Aceste valori au fost menținute până la sfârșitul experimentului. Nici șocul electric, nici loviturile fizice nu au fost folosite pentru a motiva animalele. Șobolanii de control au rămas pe bandă de alergat (0 m/min) pentru o perioadă echivalentă de timp ca șobolanii instruiți.

Animalele au fost postite 12 ore și apoi sacrificate prin decapitare pentru a evita interferențele în metabolomul circulant din cauza medicamentelor. Sângele total a fost colectat și serul a fost obținut prin centrifugare la 2.000 g timp de 15 minute după 1 oră la temperatura camerei.

Declarație de etică

Toate procedurile au fost aprobate de Generalitat de Catalunya (DAAM 6836) și au fost efectuate în conformitate cu Directiva Consiliului Comunităților Europene (86/609/CEE).

Determinarea lipidelor, hormonilor și citokinelor serice

Kituri enzimatice au fost utilizate pentru a determina trigliceridele, colesterolul total (QCA, Barcelona, ​​Spania) și colesterolele lipoproteice cu densitate ridicată și joasă (HDLc și LDLc; Spinreact, Girona, Spania). Leptina, adiponectina, proteina C reactivă (CRP) (Millipore, Barcelona, ​​Spania) și proteina chimiotratantă monocitară-1 (MCP-1) (Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, SUA) au fost măsurate folosind truse ELISA de șobolan. Nivelurile de irisină au fost determinate folosind un kit ELISA uman/șobolan/șoarece (Phoenix Pharmaceuticals Inc., Burlingame, California, SUA).

Pregătirea probelor pentru analiza metabolomică

Metaboliții au fost extrasa din ser folosind o soluție hidroalcoolică. S-au adăugat 800 μL de metanol: apă (8: 1 vol/vol) la 100 μL de ser și s-au adăugat ca standarde interne 50 μL de pirocatechol (1 ppm) și 50 μL de paracetamol (1 ppm). Amestecul a fost omogenizat prin vortexare (30 s) și ultrasunete (30 s). Apoi, probele au fost incubate pe gheață timp de 10 min pentru a precipita proteinele și centrifugate la 19.500 g timp de 10 minute la 4 ° C. Supernatantul a fost colectat și uscat sub flux de azot pentru a elimina solventul. În cele din urmă, probele uscate au fost re-dizolvate în 200 μL de metanol: apă (8: 1 vol/vol) înainte de injectare.

Analiza LC-MS și LC-MS/MS

Pentru analize țintite, extracte au fost injectate într-o serie UHPLC 1290 cuplată la un Q-TOF 6550, de asemenea de la Agilent Technologies, operat fie în modurile MS, fie MS/MS. Analizele LC-MS/MS au fost efectuate utilizând aceleași condiții analitice descrise mai sus. Datele au fost colectate în intervalul m/z 100-1000 cu o rată de scanare de 1,5 spectri/s. Spectrele MS/MS ale metaboliților au fost obținute prin diferite energii de coliziune (10, 20 și 40 eV).

Prelucrarea datelor neidentificate și identificarea metabolitului

Toate programele software utilizate pentru procesarea datelor provin și de la Agilent Technologies. Datele ne țintite au fost achiziționate folosind MassHunter Data Acquisition, în timp ce Analiza calitativă a fost utilizată pentru a obține caracteristicile moleculare ale probelor utilizând algoritmul „Molecular Feature Extractor”, care elimină ionii de fundal și grupează ionii înrudiți într-o caracteristică unică bazată pe prezența aductelor și dimerii, distribuția izotopică și învelișul de stare de încărcare. Mass Profiler Professional a fost folosit pentru a efectua alinierea caracteristicilor prezente în cromatograme și pentru a efectua analize statistice multivariate. Datele din fiecare mod de ionizare, pozitive și negative, au fost analizate separat. A fost obținută o listă de entități chimice și au fost selectate numai acele caracteristici cu minimum 2 ioni înrudiți pentru analiza chimiometrică ulterioară. Nu au fost luate în considerare stările de încărcare multiple. Timpul de retenție și fereastra de masă utilizate pentru aliniere au fost de 0,5% ± 0,15 min și respectiv 10,0 ppm ± 2,0 mDa. Valorile abundenței corespunzătoare fiecărei entități au fost transformate într-un logaritm de bază-2 și normalizate la standardul intern. Caracteristicile mai puțin frecvente au fost aruncate și au fost selectate doar cele care au fost găsite în cel puțin 75% din probele din același grup.

Analiza statistică univariată

Animalele au fost distribuite în 6 grupuri (n = 9-12) pe baza dietei și a condiției de antrenament: dietă standard control (CON-ST), dietă standard cu bandă de alergare cu intensitate scăzută (TML-ST), dietă standard cu bandă de alergare cu intensitate ridicată (TMH-ST), dieta de control-cafenea (CON-CAF), banda de alergat cu intensitate redusă-dieta de cafenea (TML-CAF) și banda de alergat-intensitate ridicată-dieta de cafenea (TMH-CAF). Dietele și sesiunile de antrenament au început după perioada de înțărcare și au fost prelungite timp de 8 săptămâni. Concentrațiile serice de lipide au fost determinate la sfârșitul experimentului după 12 ore de post. Datele sunt date ca medie ± SEM. Comparația statistică între grupuri a fost realizată utilizând ANOVA cu două și un sens. D: efectul dietei; E: efectul exercițiului; DxE: interacțiunea dintre cei doi factori principali. abc Valorile medii cu litere mici diferite indică diferențe semnificative între grupuri (ANOVA unidirecțional și contrastul post-hoc al Dunnett T3, p Fig 2. Nivelurile circulante ale hormonilor asociați bolilor legate de stilul de viață.

Animalele au fost hrănite cu chow standard (ST) sau dietă de cafenea (CAF) timp de 2 luni și antrenate periodic pe o bandă de alergat la diferite intensități (CON: 0; TML: 12; TMH: 17 m/min). Nivelurile serice de adiponectină, leptină și irisină au fost determinate la sfârșitul experimentului după 12 ore de post. Datele sunt date ca medie ± SEM (n = 9-12). Comparația statistică între grupuri a fost realizată utilizând ANOVA cu două și un sens. D: efectul dietei; E: efectul exercițiului. abc Valorile medii cu litere mici diferite au fost semnificativ diferite (ANOVA unidirecțional și contrastul post-hoc T3 al lui Tukey/Dunnett, p Fig 3. Markeri inflamatori circulanți.

Animalele au fost hrănite cu chow standard (ST) sau dietă de cafenea (CAF) și antrenate 5 zile pe săptămână timp de 30 de minute pe o bandă de alergat la intensități diferite (CON: 0; TML: 12; TMH: 17 m/min). Dietele și sesiunile de antrenament au fost continuate timp de 8 săptămâni. Nivelurile serice ale citokinelor monocite proteine ​​chemoattractante-1 (MCP-1) și proteine ​​C-reactive (CRP) au fost determinate la sfârșitul experimentului. Datele sunt date ca medie ± SEM (n = 9-12). D: efectul dietei; E: efectul exercițiului (p Fig. 4. Diagramele Venn care arată numărul de entități semnificative din fiecare parametru experimental.

Datele din fiecare mod de ionizare, pozitive și negative, au fost analizate folosind ANOVA bidirecțională. Pentru a gestiona ratele de descoperire falsă din comparații multiple, punctul limită pentru semnificație a fost calculat în funcție de corecția Benjamini-Hochberg la un nivel de 5%. D: efectul dietei; E: efectul exercițiului; DxE: interacțiunea dintre cei doi factori principali. Zonele în care cercurile se suprapun arată numărul de entități semnificative partajate de parametri.

Extractele serice au fost analizate folosind LC-ESI-MS atât în ​​moduri de ionizare pozitive cât și negative. (A, D) Reprezentări pe hartă de căldură a grupării ierarhice a entităților semnificative găsite în fiecare grup de animale. Fiecare rând reprezintă o masă exactă colorată de intensitatea abundenței sale, normalizată la un standard intern și bazată pe media tuturor probelor. Scara de la -10 (albastru) la +10 (roșu) reprezintă această abundență normalizată în unități arbitrare. Graficele PCA (B, E) și PLS-DA (C, F) arată că efectul dietei de la cantină a avut prevalență asupra antrenamentului periodic pe bandă de alergat la intensități diverse. Abrevieri: ST, chow standard; CAF, cafenea dietetică; CON, control animale; TML, alergători cu bandă de alergare cu intensitate redusă; TMH, alergători cu intensitate mare de bandă de alergat.

Metaboliți asociați cu consumul de dietă la cantină.

După determinarea entităților care au fost modificate semnificativ prin dietă, a fost efectuată o identificare provizorie a naturii lor. Această identificare a fost efectuată de LC-ESI-MS/MS utilizând o comparație a masei exacte, a timpului de retenție și a informațiilor spectrale și de fragmentare cu cele din bazele de date cu metaboliți (Tabelul 1). Rezultatele indică faptul că CAF a modificat nivelurile a șapte din cele opt categorii de lipide incluse în LAPID MAPS: glicerofosfolipide, în principal lizofosfatidilcoline (Lyso-PC); sfingolipide și glicerolipide, ambele crescute la animalele hrănite cu CAF; steroli cum ar fi acizii biliari, lipidele prenolice incluzând derivații și retinoizii vitaminei E și un flavonoid numit equol care aparține categoriei polichetide, toate scăzute după aportul cronic de CAF; și o categorie de acil gras constând din acizi grași liberi nesaturați și acilcarnitine, care au scăzut și au crescut, respectiv, în serul animalelor hrănite cu CAF. Lyso-PC a fost cea mai reprezentată familie influențată de dietă, cu o reglare eterogenă ca răspuns la alimentarea cu CAF.

Modificări ale metabolomului legate de activitatea fizică.

Concentrându-ne pe metaboliții pe care exercițiul fizic a avut un efect semnificativ, au fost identificați patru biomarkeri (Fig. 6A, 6B, 6D și 6E). Dintre aceștia, trei au fost modificați direct prin exerciții (retinoil glucuronid, o lizofosfatidiletanolamină și un acid biliar), deoarece concentrațiile lor serice au scăzut semnificativ odată cu practica alergării atât la șobolani ST, cât și la șobolani hrăniți cu CAF. O interacțiune semnificativă între dietă și exerciții fizice a fost găsită pentru nivelurile de stearoilcarnitină, care au fost semnificativ mai mici la șobolanii TML-CAF comparativ cu cei din grupurile CON-CAF și TMH-CAF (Fig 6D).