Sai Rashmika Velugula - Yellela

1 S.U.A. Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Office of Product Quality, Office of Biotechnology Products, Division of Biotechnology Review and Research II, Silver Spring, MD,

impactul

Abasha Williams

1 S.U.A. Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Office of Product Quality, Office of Biotechnology Products, Division of Biotechnology Review and Research II, Silver Spring, MD,

3 Adresa actuală: VPPL/VRC/NIAID/NIH, Gaithersburg, MD,

Nicholas Trunfio

1 S.U.A. Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Office of Product Quality, Office of Biotechnology Products, Division of Biotechnology Review and Research II, Silver Spring, MD,

2 Departament de inginerie chimică, Universitatea din Massachusetts, Lowell, MA,

Chih - Jung Hsu

1 S.U.A. Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Office of Product Quality, Office of Biotechnology Products, Division of Biotechnology Review and Research II, Silver Spring, MD,

Brittany Chavez

1 S.U.A. Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Office of Product Quality, Office of Biotechnology Products, Division of Biotechnology Review and Research II, Silver Spring, MD,

Seongkyu Yoon

2 Departament de inginerie chimică, Universitatea din Massachusetts, Lowell, MA,

Cyrus Agarabi

1 S.U.A. Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Office of Product Quality, Office of Biotechnology Products, Division of Biotechnology Review and Research II, Silver Spring, MD,

Date asociate

Abstract

Introducere

Anticorpii monoclonali (mAb) sunt o clasă importantă de produse medicamentoase derivate din biotehnologie, cu indicații de tratament aprobate, de la boli autoimune, complicații post-transplant, artrită și tratamentul diferitelor tipuri de cancer.1 Aproape 70% din toate procesele de producere a proteinelor recombinate utilizați celulele ovariene de hamster chinezesc (CHO) datorită capacității lor de a produce proteine ​​cu modificări post-translaționale similare cu cele ale unei proteine ​​umane înnăscute, sunt ușor de adaptat la medii fără ser și au demonstrat fiabilitatea ca gazde sigure.2

Datorită costurilor și complexităților asociate cu producția comercială de mAbs, există o cerere puternică de livrare eficientă și economică a unei substanțe medicamentoase de înaltă calitate. În timp ce randamentele comerciale pentru anticorpii monoclonali pot produce în mod regulat to5 până la 6 g/L, celulele CHO pot fi manipulate genetic pentru a crește în continuare productivitatea.3 Creșterile producției de proteine ​​au fost atribuite optimizării bioproceselor datorită progreselor în mediu, condițiile de cultură celulară și strategii de hrănire îmbunătățite. Compoziția mediului este unul dintre cei mai critici factori în producția de mAb, deoarece un aport echilibrat de micronutrienți, cum ar fi vitaminele, aminoacizii și oligo metalele, sunt necesare pentru a sprijini creșterea celulară adecvată și producția de proteine ​​de înaltă calitate.

Mai mult, alegerea agenților chimici antispumanti sau a „spumelor” este un aspect important care poate avea un impact asupra procesului bioreactorului. Spumarea excesivă poate duce la deteriorarea proteinelor din explozia bulelor, pierderea controlului asupra sterilității sistemului din spuma care se scapă și deteriorarea echipamentului cauzată de presiune prin blocarea filtrelor de ieșire.7, 8, 9 Antispumurile sunt în general compuse din hidrofobe solide. particule, un ulei sau un amestec al acestor componente.7 Particulele solide hidrofobe pot perturba spuma prin punte - mecanism de degajare în care hidrofobicitatea particulei provoacă perforații pe suprafețele spumei, provocând ruperea acesteia. în mod similar, perturbă spumele prin mecanismul de punere în funcțiune, precum și mecanismul de punere în întindere în care uleiul formează punți în lamela de spumă care se întinde și duce la ruperea spumei.

Studiile anterioare au arătat că adăugarea de antiespumant poate avea atât efecte pozitive, cât și negative asupra creșterii celulare, care pot afecta ulterior randamentul produselor proteice.11, 12, 13 S-a demonstrat că antispumantele pe bază de polimeri de silicon au un impact negativ asupra creșterii celulare în bioprocesarea din amonte călătoresc în aval, unde pot înfunda filtrele și pot crea dificultăți în etapele de purificare. celulele pot apărea, dar este considerat un scenariu cel mai rău caz.9 Cu o mare varietate de antispumante disponibile în comerț, este important să selectați o formulare care să se potrivească nevoilor bioprocesului.9

Obiectivul acestei cercetări a fost de a evalua mai multe combinații de medii disponibile comercial și antispumă pentru impactul lor asupra creșterii celulare și a productivității specifice a unei linii de celule interne CHO-DG44 care produce un model himeric IgG1. Am folosit un microbioreactor automat ambr®15 (Sartorius, Hertfordshire, Marea Britanie), format din 48 de microbioreactoare paralele care s-au dovedit a fi comparabile cu reactoarele cu rezervor agitat clasic în studii de amplificare.17 Am evaluat cinci medii CHO definite chimic și cinci antispumuri pentru determina impactul asupra cresterii celulare si asupra productiei de anticorpi. Pe baza loturilor preliminare, mediile și selecțiile antispumante au fost restrânse la trei antispumante și trei medii, păstrând OptiCHO ca referință/mediu de referință. În timp ce optimizarea strategiilor media necesită o înțelegere profundă a procesului și a nevoilor de hrănire, este extrem de valoros să eliminați performanții slabi și antispumele dăunătoare care ar fi putut face publicitate aplicațiilor pentru o gamă largă de linii celulare CHO (cum ar fi DG-44 sau suspensia CHO) . și restrângeți rapid candidații media pentru sistemul nostru specific de cultură celulară.

Materiale și metode

Reactivi de cultură celulară

Mediul OptiCHO definit chimic (CD) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) a fost mediul original în care a fost propagată linia celulară. Celulele au fost adaptate la alte patru medii disponibile comercial, inclusiv CD Dynamis (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA), ProCHO 5 fără proteine ​​(Lonza, Walkersville, MD), CD PowerCHO 2 (Lonza, Walkersville, MD) și CD EX - Cell Advanced (SAFC, Lenexa, KS). Toate mediile studiate au fost suplimentate cu 8 mM de L-glutamină (Corning, Manassas, VA) și 1X Penicilină/Streptomicină (Corning, Oneonta, NY). Concentrația inițială de glucoză în fiecare mediu a variat, în funcție de formularea proprie a producătorului, și a variat între 5 și 8 g/L. ProCHO 5 și EX - Cell Advanced au avut cea mai mare concentrație de glucoză, în timp ce OptiCHO a avut cea mai mică concentrație de glucoză. Au fost studiate cinci antispumuri disponibile comercial (Sigma Life Sciences, St. Louis, MO): Antifoam C, Antifoam EX - Cell, Antifoam 204, Antifoam SE-15 și Antifoam Y-30. PH-ul culturii celulare a fost controlat utilizând NaOH 1M (Thermo Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ).

Extinderea trenului de semințe

O linie celulară CHO DG44 producătoare de IgG1 internă a fost cultivată în cele cinci medii de testare. Culturile de baloane cu agitare (30 ml) au fost menținute într-un incubator controlat la 37 ° C și 8% CO2 și au fost agitate la o viteză de 130 rpm. În ziua a treia, celulele din fiecare mediu au fost subcultivate într-un balon de 125 ml de unică folosință (Corning) conținând mediu proaspăt. Culturile de filare au fost incubate în aceleași condiții ca și baloanele de agitare și agitate la o viteză de 70 rpm. Mijloace proaspete suplimentare au fost adăugate culturilor de filare în ziua a treia (cu o zi înainte de preparatele de inoculare) pentru a menține viabilitatea celulară peste 90% cu un volum maxim de 125 ml.

Procesul lot al sistemului microbioreactor

Culturile în loturi pentru toate experimentele au fost menținute într-un sistem de bioreactor avansat la microscop de 15 ml, format din 48 de vase de unică folosință (spargate sau nepargate) în 4 stații de lucru. Punctele de setare ale procesului în fiecare vas au fost identice: oxigen dizolvat (DO) 50%, pH 7,1 ± 0,05, temperatură 37 ° C și viteză de agitare 1000 rpm. Un dispozitiv de manipulare a lichidului a furnizat încărcarea automată a mediului, inocularea, prelevarea de probe și adăugarea de anti-spumă și NaOH. După inoculare fie la 0,5 × 106 celule/ml, fie la 1 × 106 celule/ml, volumul de cultură a fost menținut peste 10 ml. Densitatea celulelor viabile și viabilitatea celulelor au fost măsurate zilnic folosind un analizor de viabilitate a celulei Vi - Cell XR automat și integrat (Beckman Coulter, Brea, CA). Probele zilnice au fost prelevate din fiecare vas pentru analiza nutrienților (glucoză, glutamină și lactat) cu un analizor BioProfile FLEX (Nova Biomedical, Waltham, MA). Baza (1 M NaOH) a fost adăugată în funcție de necesități pentru fiecare vas individual spargat pe toată durata culturii (8-9 zile).

Consumul de substanțe nutritive și metabolice și ratele de producție au fost calculate numai pentru regiunea liniară a fazei de creștere exponențială; această regiune a fost determinată de evaluarea vizuală a evoluției temporale a densității celulare de către un expert în cultură celulară. A fost apoi efectuată o regresie liniară la toate măsurătorile care se încadrează în această regiune, iar panta liniei de regresie rezultată este considerată rata consumului de nutrienți sau rata de acumulare a produsului secundar. Figura suplimentară S3 prezintă un exemplu al acestei proceduri.