Sudathip Sae-tan

1 Departamentul de Științe Alimentare, Universitatea de Stat din Pennsylvania, University Park, PA 16802

Kimberly A. Grove

1 Departamentul de Științe Alimentare, Universitatea de Stat din Pennsylvania, University Park, PA 16802

Mary J. Kennett

2 Departamentul de Științe Veterinare și Biomedice, Universitatea de Stat din Pennsylvania, University Park, PA 16802

Joshua D. Lambert

1 Departamentul de Științe Alimentare, Universitatea de Stat din Pennsylvania, University Park, PA 16802

Abstract

(-) - Epigalocatechin-3-galatul (EGCG), polifenolul major din ceaiul verde, s-a dovedit a preveni dezvoltarea obezității la modelele de rozătoare. Aici, am examinat efectul EGCG asupra markerilor de oxidare a grăsimilor la șoareci cu conținut ridicat de grăsimi C57bl/6J. Șoarecii cu conținut ridicat de grăsimi tratați cu EGCG dietetic 0,32% timp de 16 săptămâni au avut o creștere a greutății corporale și greutatea finală redusă (19,2%, respectiv 9,4%) comparativ cu martorii cu conținut ridicat de grăsimi. Tratamentul cu EGCG a scăzut glicemia din jeun, insulina plasmatică și rezistența la insulină cu 18,5%, 25,3% și, respectiv, 33,9%. Tratamentul cu EGCG a redus, de asemenea, markerii bolilor hepatice grase legate de obezitate la șoarecii cu hrană bogată în grăsimi. Analiza expresiei genice a mușchilor scheletici a arătat că EGCG a crescut nivelurile de ARNm ale factorului respirator nuclear (nrf) 1, acil lanț mediu decarboxilază coA (mcad), proteine ​​de decuplare (ucp) 3 și elementul receptiv al proliferatorului peroxizomului (ppar) α cu 1,4 - 1,9 -depliat comparativ cu controalele bogate în grăsimi. Aceste gene sunt toate legate de oxidarea acizilor grași mitocondriale. În plus, EGCG a crescut excreția fecală a lipidelor la șoarecii cu conținut ridicat de grăsimi. Pe scurt, se pare că EGCG modulează creșterea în greutate corporală la șoarecii cu conținut ridicat de grăsimi, atât prin creșterea expresiei oxidării grăsimilor legate de gene în mușchiul scheletic, cât și prin modularea absorbției grăsimilor din dietă.

1.0 Introducere

(-) - Epigalocatechin-3-galatul (EGCG) este cea mai abundentă și mai studiată catechină din ceaiul verde (Camellia sinensis, Theaceae) 1. Studiile anterioare au arătat că ceaiul verde și EGCG inhibă dezvoltarea obezității la modelele animale de laborator și pot modula greutatea corporală la subiecții umani [revizuit în 2].

Tratamentul șoarecilor C57bl/6J cu EGCG dietetic 0,32% timp de 16 săptămâni s-a dovedit că reduce creșterea în greutate corporală indusă de o dietă bogată în grăsimi, markerii diabetului de tip II și severitatea bolii hepatice grase legate de obezitate (ORLFD) 3. Analiza conținutului de lipide fecale a arătat că tratamentul EGCG a crescut excreția de lipide fecale și că acestea au crescut puternic corelate cu scăderea creșterii în greutate corporală. Lipaza pancreatică este enzima digestivă majoră responsabilă de scindarea trigliceridelor din intestinul subțire 4. S-a demonstrat anterior că EGCG inhibă lipaza pancreatică in vitro 5, 6. Am descoperit recent că inhibarea mediată de EGCG a lipazei pancreatice nu este competitivă în ceea ce privește concentrația substratului (Grove și colab., Rezultate nepublicate).

Alte studii recente au sugerat că EGCG și ceaiul verde pot modula expresia genelor legate de metabolismul lipidelor. De exemplu, Klaus și colab. au raportat că tratamentul șoarecilor negri din Noua Zeelandă cu 1% EGCG dietetic timp de 4 săptămâni a redus creșterea greutății corporale și a masei grase corporale induse de dietă bogată în grăsimi 7. Analiza conținutului de energie fecală a arătat că șoarecii tratați cu EGCG aveau niveluri mai ridicate de energie în fecale decât controalele cu conținut ridicat de grăsimi, indicând faptul că EGCG a cauzat malabsorbția aportului de energie din dietă. Autorii au raportat, de asemenea, că EGCG a crescut expresia ARNm a proteinei de decuplare (ucp) 2 și ucp3 în ficat și, respectiv, în mușchiul scheletic. Aceste gene sunt legate de oxidarea acizilor grași, iar expresia crescută poate explica unele dintre efectele EGCG asupra creșterii în greutate corporală. Tratamentul EGCG a reglat de asemenea mai multe gene legate de sinteza și stocarea acizilor grași în ficat și țesutul adipos alb, inclusiv: stearoil coA dehidrogenază 1, enzimă malică și glucokinază. Efecte similare asupra expresiei genice în țesutul adipos au fost observate și la șoarecii C57bl/6J hrăniți cu grăsimi tratați cu EGCG 8 .

S-a raportat relativ puțin despre efectul EGCG asupra expresiei genelor legate de obezitate în mușchiul scheletic. Tratamentul câinilor beagle obezi cu 80 mg/kg, p.o. extractul de ceai verde înainte de hrănire timp de 12 săptămâni nu a avut niciun efect semnificativ asupra greutății corporale sau a masei grase corporale, dar a redus nivelul trigliceridelor plasmatice și a îmbunătățit sensibilitatea la insulină. Analiza expresiei genei a arătat că tratamentul cu ceai verde a crescut expresia ARNm a receptorului activat cu proliferatorul peroxizomului (ppar) α și lipoprotein lipazei din mușchi. Nu s-a observat niciun efect semnificativ asupra nivelului de ARNm al transportorului de glucoză [9]. În schimb, Chen și colab., Nu au găsit niciun efect semnificativ al EGCG al ceaiului verde asupra expresiei pparα sau ucp3 în mușchiul scheletic al șobolanilor cu conținut ridicat de grăsimi tratați timp de 27 săptămâni 10 .

Diferențele dintre efectele observate la câine și cele observate la șobolan pot fi rezultatul diferențelor în biodisponibilitatea polifenolilor de ceai la aceste specii 11, 12. Biodisponibilitatea orală absolută a EGCG la șobolan este de numai 1,6%, în timp ce la câine biodisponibilitatea orală este mult mai mare. Studiile noastre anterioare arată că șoarecele este mai asemănător cu oamenii decât șobolanul în ceea ce privește biotransformarea și biodisponibilitatea EGCG 13, 14. Din acest motiv și datorită utilizării pe scară largă a modelelor de șoareci pentru studiul prevenirii obezității, am examinat expresia mai multor gene legate de oxidarea lipidelor în mușchiul scheletal al șoarecilor cu conținut ridicat de grăsimi. Am comparat aceste modificări cu efectele observate asupra markerilor fiziologici ai obezității, diabetului de tip II și ORLFD. Aici, raportăm rezultatele studiului nostru.

2.0 Experimental

2.1 Produse chimice și dietă

EGCG (93% pur) a fost cumpărat de la Taiyo Green Power Company (Jiangsu, China). Dietele au fost pregătite de Research Diets, Inc. (New Brunswick, NJ) și formulările au fost raportate anterior 3. Grundele pentru PCR în timp real au fost sintetizate de Genomics Core Facility de la Universitatea de Stat din Pennsylvania (University Park, PA). Toate celelalte substanțe chimice erau de cea mai înaltă calitate disponibile în comerț.

2.2 Animale și tratament

2.3 Glucoza din sânge în post, insulina plasmatică și rezistența la insulină

Măsurătorile glicemiei la jeun au fost înregistrate în săptămânile 0, 4, 8, 10, 12 și 14 pentru fiecare grup de tratament, utilizând un monitor de mână de glucoză Contour (Bayer Healthcare, Tarrytown, NY). Șoarecii au fost posti timp de 7 ore după schimbarea așternutului în cușcă (pentru a preveni coprafagia) și sângele a fost prelevat din vena cozii. Insulina plasmatică în repaus alimentar a fost determinată la finalizarea experimentului utilizând un ELISA pentru insulină de șobolan/șoarece (Millipore, Billerica, MA) conform protocolului producătorului. Rezistența la insulină a fost estimată din valorile finale ale glicemiei și ale insulinei prin evaluarea modelului Homeostaziei a rezistenței la insulină (HOMA-IR) 15:

2.4 Analiza bolilor hepatice grase legate de obezitate

ORFLD a fost evaluat utilizând atât metode biochimice, cât și metode histopatologice. Trigliceridele hepatice au fost determinate prin omogenizarea țesutului hepatic (50-100 mg) în 2 ml de izopropanol. Omogenatul a fost centrifugat la 2000 × g timp de 10 min și supernatantul a fost analizat cu kitul de trigliceride M de tip L (Wako Diagnostics, Richmond, VA). Concentrațiile de lipide au fost normalizate la greutatea umedă a țesutului. Nivelurile de alanină aminotransferază plasmatică (ALT) au fost determinate folosind o metodă spectrofotometrică (Catachem, Inc., Bridgeport, CT).

Pentru diagnosticul histopatologic, secțiunile hepatice fixate în formalină au fost deshidratate și încorporate în blocuri de parafină. Secțiunile (6 μm) au fost tăiate și colorate cu hematoxilină și eozină. Probele au fost orbite și citite de un medic veterinar de laborator certificat de bord, cu experiență în patologia rozătoarelor (MJK). Lipidozele hepatice, vacuolizarea și necroza focală au fost determinate ca criterii pentru boala hepatică. Severitatea lipidozei a fost determinată semi-cantitativ pe baza gradului de acumulare a lipidelor și a zonei de implicare. Lipidoza a fost marcată pe o scară de 0 = fără leziuni semnificative, 1 = minimă (1 - 20%), 2 = ușoară (21-40%), 3 = moderată (41-60%), 4 = marcată (61 - 80 )%), 5 = sever (81-100%).

2.5 Analiza PCR în timp real a expresiei genei

ARN-ul total a fost izolat din probele de mușchi ale piciorului utilizând reactivul Tri (Sigma) conform instrucțiunilor producătorului. ARN izolat a fost cuantificat utilizând spectrofotometrul NanoDrop ND-1000 și ADNc a fost sintetizat folosind transcriptaza inversă. După sinteza ADNc, PCR în timp real a fost efectuat utilizând SYBR Green PCR Master Mix conform protocolului producătorului și amplificat pe sistemul de detectare a secvenței ABI Prism 7000. Nivelurile de ARNm au fost normalizate la β-actină. Curbele standard au fost realizate utilizând diluții seriale din probe de ADNc combinate. Secvențele pentru grundele utilizate sunt enumerate în Tabelul 1 .

tabelul 1

Secvențe primare utilizate pentru analiza PCR în timp real a expresiei genelor în mușchiul scheletic al șoarecilor cu conținut ridicat de grăsimi.

Grund GeneForward Grund invers
mcadGAGCCTGGGAACTCGGCTTGAGCCAAGGCCACCGCAACTTT
nrf1TGCAGCAGGGAGCCACTGTCATGGGCGGCAGCTTCACTGT
ucp3GAGCGGACCACTCCAGCGTCTCACCACATCCGTGGGCTGG
pparαATCGGCCTGGCCTTCTAAACTCCCCTCCTGCAACTTCTCA

2.6 Analiza lipidelor fecale

Probele fecale au fost combinate cu apă deionizată (1: 2, w: v) și incubate peste noapte la 4 ° C. Probele au fost vortexate și extrase de două ori cu volum egal de metanol: colorform (2: 1, v: v). Faza organică a fost filtrată prin membrană PTFE de 0,45 μm și uscată sub vid. Reziduul a fost cântărit și normalizat la greutatea fecală.

2.7 Analiza statistică

Toate graficele arată media ± eroarea standard a mediei (SEM). ANOVA unidirecțional cu post-testul lui Tukey a fost utilizat pentru a compara câștigul BW, insulina, HOMA-IR, trigliceridele hepatice, ALT, lipidele fecale și hepatomegalia. ANOVA bidirecțional cu testul lui Bonferroni a fost utilizat pentru BW și glicemie pe parcursul studiului. Semnificația statistică a fost atinsă la p 16. În general, nu a existat nicio diferență semnificativă în aportul de alimente între grupurile de tratament (datele nu sunt prezentate). Tratamentul cu HF a crescut semnificativ greutatea corporală finală și rata creșterii în greutate corporală în comparație cu șoarecii hrăniți cu LF (Tabelul 2). În schimb, șoarecii cu hrană bogată în grăsimi tratați cu EGCG au arătat o reducere cu 21,7% a ratei creșterii în greutate corporală și o scădere cu 9,4% a greutății corporale finale (p. Tabelul 1). Interesant este că nu a existat niciun efect semnificativ al EGCG asupra greutății plăcuțelor de grăsime retroperitoneale și epididimale (datele nu sunt prezentate). Aceste efecte asupra greutății corporale finale și a creșterii în greutate corporală sunt similare cu rezultatele raportate anterior, deși nu sunt la fel de dramatice în magnitudinea 3. Motivele diferențelor sunt neclare, dar se poate datora abaterii standard relativ mari observate în experimentele cu acest model. Nici depozitele de grăsimi intestinale, nici cele subcutanate nu au fost examinate, deci este posibil ca modificările observate ale greutății corporale să se coreleze cu modificările din aceste depozite de grăsime.

masa 2

Efectul tratamentului EGCG asupra markerilor biologici ai obezității și tipului II la șoarecii C57BL/6J cu conținut ridicat de grăsimi hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi. *

LF (n = 16) HF (n = 22) HFE (n = 22)
Greutatea corporală inițială (g)19,1 ± 0,3 a 18,8 ± 0,2 a 18,8 ± 0,3 a
Greutatea corporală finală (g)31,8 ± 0,7 a 49,6 ± 0,5 b 44,9 ± 1,1 c
Rata de creștere în greutate (g/săptămână)0,9 ± 0,1 a 2,3 ± 0,1 b 1,8 ± 0,1 c
Glucoza din sânge (mg/dl)119,1 ± 5,1 a 206,7 ± 6,9 b 168,6 ± 6,1 c
Insulină plasmatică (ng/ml)1,2 ± 0,1 a 6,6 ± 0,3 b 4,9 ± 0,5 c
HOMA-IR6,5 ± 0,8 a 57,2 ± 3,2 b 37,8 ± 4,4 c

epigalocatechin-3-galat

Efectul EGCG asupra ORFLD la șoarecii C57bl/6J cu conținut ridicat de grăsimi. Suplimentarea EGCG a redus ALT (A) plasmatic, hepatomegalie (B) și trigliceride hepatice (C) după un tratament de 15 săptămâni, comparativ cu șoarecii martor HF. Barele reprezintă media lui n = 16 - 22. Barele de eroare reprezintă SEM. Diferite litere superscriptate indică diferențe semnificative statistic prin ANOVA unidirecțională cu post-testul lui Tukey. Analiza histopatologică (D) a arătat că tratamentul cu EGCG a redus severitatea și aria lipidozei hepatice. Micrografiile foto ale probelor reprezentative de ficat sunt prezentate la mărire 100X.

Analiza histopatologică a confirmat diagnosticul biochimic al ORFLD (Fig. 2D). Șoarecii HF au avut lipidoză hepatică centrilobulară severă cu necroză focală. Șoarecii HFE au avut vizibil mai puțină acumulare de grăsime și zone mai mici de implicare. Analiza semicantitativă a lipidozei hepatice a arătat o scădere a scorului de severitate de la 4,8 ± 0,1 la 3,5 ± 0,5 la șoareci HFE (p 2). Deși studiile anterioare au examinat rolul modificărilor exprimării genei mediate de EGCG în ficat și țesutul adipos în prevenirea obezității, mușchiul scheletal a fost în mare parte ignorat. Consumul de ceai verde s-a arătat atât la modelele umane, cât și la cele animale, pentru a crește consumul de energie și a reduce coeficientul respirator 7, 17, 18 .

Studiile anterioare au arătat că tratamentul pe termen lung cu EGCG poate crește excreția fecală a lipidelor. Am determinat conținutul de lipide fecale gravimetric și am constatat o concentrație medie de lipide fecale de 8,6 și respectiv 10,8 mg/g în HF și, respectiv, HFE. Conținutul mediu de lipide fecale a crescut semnificativ cu 20,4% cu tratamentul EGCG comparativ cu grupul de control HF (p Balentine DA, Wisemanand SA, Bouwens LC. Chimia flavonoidelor din ceai. Crit Rev Food Sci Nutr. 1997; 37: 693-704. [ PubMed] [Google Scholar]