Mihail V. Vasin

1 Centrul Științific de Stat Federația Rusă - Institutul pentru Probleme Biomedice, Academia Rusă de Științe, 76a Khoroshovskoe schuss, Moscova 123007, Rusia

Leonid F. Semenov

2 Institutul Științific de Primatologie Medicală, Academia Rusă de Științe Medicale, 1 Veseloe, Sochi 354376, Rusia

Nikolai N. Suvorov

3 Centrul de chimie al agenților medicinali, strada Zuvovskaya nr. 7, Moscova 119815, Rusia

Vsevolod V. Antipov

1 Centrul Științific de Stat Federația Rusă - Institutul pentru Probleme Biomedice, Academia Rusă de Științe, 76a Khoroshovskoe schuss, Moscova 123007, Rusia

Igor B. Ushakov

1 Centrul Științific de Stat Federația Rusă - Institutul pentru Probleme Biomedice, Academia Rusă de Științe, 76a Khoroshovskoe schuss, Moscova 123007, Rusia

Leonid A. Ilyin

4 Burnazian Medical Medical Biophysical Center, Federal Biomedical Agency, 17a Street Gamalea, Moscow 123098, Russia

Boris A. Lapin

2 Institutul Științific de Primatologie Medicală, Academia Rusă de Științe Medicale, 1 Veseloe, Sochi 354376, Rusia

Date asociate

Abstract

INTRODUCERE

MATERIALE ȘI METODE

Experimente pe animale

Experimentele au fost efectuate pe maimuțe rhesus masculi și femele juvenile (Macaca mulatta) cu vârste cuprinse între 2-3 ani, cu greutăți corporale de 2,1-3,5 kg. Greutatea medie a animalelor, cu quartile inferioare și superioare, a fost de 2,8 (2,2-3,0) kg în grupul de control al radiațiilor și de 2,7 (2,2-3,1) kg în grupul experimental de maimuțe (cele care au primit radioprotectorul). Toate animalele au fost hrănite cu o dietă standard furajeră și cu apă potabilă. Dieta consta din fructe (mere) și legume (morcovi, sfeclă roșie, varză, cartofi), precum și proteine ​​din ouă de pui. Eutanasia nu a fost utilizată în acest studiu.

Acest studiu a fost realizat luând în considerare cerințele conform actelor legale de reglementare privind procedura de lucru experimental pe animale, inclusiv la nivel național (Ordinul Ministerului Sănătății al Federației Ruse nr. 267 din 19 iunie 2003) și orientările etice internaționale pentru cercetare medicală și biomedicală care implică animale (Declarația Asociației Medicale Mondiale din Helsinki, 2000).

Iradiere

Maimuțele au fost expuse la iradiere gamma bilaterală a corpului total în instalația experimentală 60 Co a modelului GUBE-2000 (2000 Ci cu încărcare de 60 Co) (Rusia) la o doză letală de 6,8 Gy (doza de radiație cauzând 100% mortalitatea animalelor cu 30 d după iradiere = LD100/30) și o rată a dozei de 22,8 cGy min –1. Animalele au fost iradiate fără anestezie. Doza absorbită în corp (Dab) a fost calculată după cum urmează: Dab = Dex × 1,137 × 0,877, unde Dex = doza de radiație de expunere în aer, 0,877 = un coeficient de tranziție pentru calcularea dozei absorbite în aer de la doza de expunere în aer, și 1.137 = coeficient de tranziție al razei gamma 60 Co energie de 1,25 MeV pentru calcularea dozei absorbite în corp din doza absorbită în aer.

Administrarea medicamentelor

Indralin (CAS 156799-03-0, Farmzaschita, Agenția Federală Biomedicală, Moscova, Rusia) a fost administrat intramuscular (im) maimuțelor din zona coapsei la doze de 40, 60, 80 sau 120 mg kg –1 ca soluție 2,5% 5 minute înainte de expunerea la radiații. După iradiere, animalele au primit agenți antimicrobieni conform unui singur protocol de tratament: levomicetin (Ferein, Moscova, Rusia) 200 mg kg –1 administrat oral o dată pe zi în Zilele 1–10; penicilină (Biosynthes, Penza, Rusia) 150 mg kg –1 și streptomicină (Biochimic, Saransk, Rusia) 50 mg kg –1 i.m. o dată pe zi în Zilele 10-20. Patru macaci neradiați au primit doze toxice de indralină i.m. (800 și 1000 mg kg –1).

Determinarea efectului radioprotector al indralinei

Proprietățile radioprotectoare ale indralinei au fost estimate din analiza de supraviețuire a animalelor peste 60 de zile după iradiere și prin prezența simptomelor clinice ale sindromului de radiații acute (ARS). Modificările în greutatea corporală și temperatura rectală au fost monitorizate. De asemenea, am examinat regiunea abdominală prin palpare, am evaluat funcția pulmonară prin observarea respirației și am inspectat vizual pielea și membranele mucoase, inclusiv cavitatea bucală și zona anală. Numărul de leucocite, trombocite, eritrocite și reticulocite, valorile hemoglobinei și rata de sedimentare a eritrocitelor (VSH) au fost determinate din sângele periferic al animalelor. Manifestările clinice ale leziunilor acute cauzate de radiații în intestine au inclus diaree și tensiune la nivelul abdomenului. Aceste simptome au fost evidente în zilele 5-10. În timpul perioadei prodromale a fost monitorizată prin înregistrarea vărsăturilor, diareei și tulburărilor locomotorii și comportamentale în prima zi după iradiere. Dozele toxice de indralină s-au bazat pe semne clinice de otrăvire și moarte a animalelor în termen de trei zile de la tratament.

analize statistice

Datele sunt exprimate ca medie ± eroare standard. Prezența unui efect radioprotector a fost evaluată prin analiza curbei de supraviețuire utilizând metoda Kaplan-Meier (testul F al lui Cox). Analiza statistică a fost efectuată folosind programul de calculator „Statistica” versiunea 7. Probabilitatea statistică a fost determinată utilizând testul U non-parametric Mann - Whitney cu o dimensiune minimă a eșantionului de trei, un test Fisher cu două cozi și analiza factorială a varianței . Valori P Fig.1. 1. După iradiere gamma 6,8 Gy (LD100/30; rata dozei 22,8 cGy min –1), i.m. administrarea de indralin în doză de 120 mg kg –1 a protejat cinci din șase maimuțe, comparativ cu moartea tuturor celor 10 animale din grupul de radiații martor (P –1), efectul protector al radiației al indralinului a fost egal cu 50% din au supraviețuit șase maimuțe). După administrarea a 60 mg kg –1, una din patru maimuțe a supraviețuit până în Ziua 60 a experimentului. Indralina în doză de 40 mg kg -1 nu a fost eficientă, iar cele trei animale experimentale au murit din cauza ARS. ED50 al indralinei la maimuțele expuse la iradiere gamma (LD100/30) timp de 30 de minute a fost egal cu 77,3 (63,3-94,3) mg kg –1. Indralina a redus severitatea daunelor letale cauzate de radiații la maimuțe până la un curs mai ușor de ARS.

protector

Supraviețuirea maimuțelor (Macaca mulatta) după tratamentul cu doze variate de indralină (40-120 mg/kg) după iradiere gamma a întregului corp (6,8 Gy; LD100/30).

Asteriscul indică P (Fig. 2A). 2 A). Temperatura corpului nu s-a modificat semnificativ. Maimuțele expuse au scăzut activitatea motorie și au suprimat interesul pentru alimente. Greutatea corporală a animalelor scăzuse cu o medie de 10% până în ziua a 7-a și aceasta a continuat până când pierderea în greutate a fost de 15-20% când a avut loc decesul din cauza ARS (P Fig.2 2 B).

Leucopenie severă și trombocitopenie au fost observate în probele de sânge periferic (Fig. (Fig. 3A, 3 A, A, 3B). 3 B). Sindromul hemoragic a dus la scăderea acută și profundă a numărului de eritrocite și a nivelurilor de hemoglobină cu până la 50% din nivelurile inițiale (Fig. 3C, 3 C, C, 3D). 3 D). La maimuțele din grupul martor, numărul leucocitelor și al eritrocitelor în sângele periferic a fost de 0,7 (0,4-0,9) × 10 9 l -1 și 2,5 (2,1-2,9) × 10 12 l -1 respectiv, până în a 14-a zi a ARS (Tabel suplimentar S1, Fig. Fig. 3A, 3 A, A, 3 3 C).

Diferențele de sex în ceea ce privește radiosensibilitatea maimuțelor nu au fost evaluate în acest studiu. Durata medie de viață a animalelor decedate după iradiere a fost de 13,4 ± 1,4 zile pentru femele (n = 5) și 14,8 ± 1,0 zile pentru bărbați (n = 5). În a șaptea zi după expunerea la radiații, numărul leucocitelor a fost de 1,53 ± 0,82 × 10 6 l -1 pentru femele (n = 5) și 1,31 ± 0,23 × 10 6 l -1 pentru bărbați (n = 5).

Examinarea anatomică a leziunilor cauzate de radiații pe corpurile maimuțelor

Autopsia a determinat că cauza decesului la aceste animale a fost ARS, cu aplazie severă a măduvei osoase, splinei și ganglionilor limfatici și hemoragii multiple în mucoasa intestinală, endocard, pericard, mușchiul inimii și țesutul pulmonar; au fost de asemenea observate caracteristici ale gastroenteritei catarale și ale colitei ulcerative hemoragice. A existat un caz de pneumonie cu lob scăzut cu hemotorax, care a fost detectată la maimuța care a murit în ziua 21 a ARS după tratamentul cu 80 mg kg -1 de indralină.

Efectele radioprotectoare ale indralinei asupra manifestărilor clinice ale ARS

În acel moment, s-a înregistrat o creștere moderată a temperaturii corpului și a VSH (Fig. (Fig. 2E, 2 E, E, 3E). 3 E). În general, modificările numărului de trombocite și eritrocite, conținutului de hemoglobină, VSH și temperatura corpului au fost corelate cu manifestările clinice ale sindromului hemoragic asociat cu ARS, inclusiv melena (Fig. (Fig. 2C, 2 C, D și E și 3B, 3 B, C, D și E). Au fost observate creșteri remarcabile ale numărului de leucocite și reticulocite începând cu a treia săptămână. Anemia a persistat în acel moment, dar în a 45-a zi după expunerea la radiații, maimuțele protejate cu indralină și-au revenit atât din leucopenie, cât și din anemie În plus, numărul de trombocite a crescut la 340 × 10 9 l –1 până la sfârșitul perioadei de observație (Fig. 3B).

Toxicitatea acută a indralinei la maimuțe

Toleranța la indralină la maimuțele rhesus a fost evaluată după i.m. administrarea radioprotectorului la doze toxice de 800 și 1000 mg kg –1. Toate cele trei maimuțe care au primit o doză de 800 mg kg –1 au supraviețuit. O maimuță a murit în urma otrăvirii la 20 de minute după administrarea de indralină în doză de 1000 mg kg –1. Acest animal a prezentat semne de suferință respiratorie semnificativă.

Tabloul clinic al acțiunii indralinei administrată în doză de 800 mg kg –1 a fost după cum urmează. Indralina, fiind un alfa1-adrenomimetic direct [22, 23], a provocat piloerecție în locul animalului se ofilește la câteva minute după administrare, care a persistat timp de 3 ore. Vărsături repetate au fost observate la fiecare 2 minute (de șase ori) la una dintre cele trei maimuțe. Efectul deprimat al protectorului a fost observat la 5 minute după administrare. Maimuțele se așează pe spate, păstrând capacitatea de a răspunde la stimuli externi, deși demonstrează în mod clar o coordonare motorie afectată. Animalele au continuat să fie într-o stare de ușoară somnolență cu ochii pe jumătate închiși și au fost adesea neliniștite. O oră mai târziu, maimuțele au preferat să stea, cu ataxie severă persistentă.

În acea perioadă, animalele au refuzat să mănânce mere și zahăr atunci când se desfășoară ataxia. Ataxia severă a durat până la 2 ore. Maimuțele stăteau cocoșate cu capul coborât și ochii închiși. La a patra oră, mișcările lor au rămas incomode. Cu toate acestea, interesul lor pentru mediu a crescut, cu un răspuns rapid restabilit la semnalul sonor sub forma unei posturi agresive. Starea animalelor a fost satisfăcătoare după 24 de ore; au luat mâncare și au răspuns rapid cercetătorului fără a demonstra ataxie. Am observat scăderi moderate ale greutății corporale la maimuțele expuse la radiații și am primit administrare profilactică de indralină în doză de 120 mg kg –1. Această scădere a greutății s-a datorat probabil apetitului scăzut, care este un efect secundar al unei doze mari de radioprotector.

DISCUŢIE

Indralina are efecte radioprotectoare asupra țesutului hemapoietic, intestinelor, pielii, testiculelor și glandelor salivare [26, 27, 32-34]. Efectele radioprotectoare ale indralinei au fost studiate la șapte specii de animale experimentale (șoareci, șobolani, hamsteri, cobai, iepuri, câini și maimuțe) [21, 23, 26, 32, 35]. Indralina este un agent adrenomimetic direct care îi induce efectele protectoare prin intermediul receptorilor alfa1-adrenergici [22]. Acțiunile radioprotectoare ale indralinei sunt inhibate de tropafen și clorpromazină (care sunt adrenoblocanți neselectivi [21, 23]), prazosin (care este un alfa1-adrenoblocant selectiv [22]) și teofilină (care este un inhibitor al adenozinei monofosfat ciclic) ). (AMP) degradare [21]). Efectul radioprotector al indralinei administrate oral a durat până la 1 oră [35]. S-a constatat că iproniazida, inhibitorul monoaminooxidazei (MAO), dublează durata acțiunii indralinei [21]. În cele din urmă, indralina este un alfa-adrenomimetic direct care crește presiunea arterială și reduce frecvența pulsului [35].

Mecanismul de protecție al indralinei este rezultatul efectelor hipoxice acute în țesuturile radiosensibile. Ca alfa-adrenomimetic direct, indralina provoacă modificări ale microcirculației datorită vasoconstricției pre-capilare și creșterii simultane a consumului de oxigen de către celule prin stimularea respirației tisulare [21, 23-25]. Respirația a 100% oxigen în timpul iradierii scade efectele radioprotectoare ale indralinei [23, 24]. Ca radioprotector, indralina, împreună cu ecranarea parțială a abdomenului, protejează câinii iradiați cu o doză triplă letală de radiații [35]. Ca atenuant al efectelor radiațiilor, indralina crește supraviețuirea câinilor cu mai mult de 50% atunci când este administrată după iradiere [36]. Proprietatea de reducere a daunelor indralinei crește dramatic în condiții de iradiere neuniformă [37].

Pe baza datelor prezentate în acest studiu, indicele terapeutic (TI) al acțiunii radioprotectoare a indralinei la maimuțe a fost stabilit ca raportul dintre doza maximă tolerată de indralină și ED50 de indralină administrată înainte de expunerea la doza letală absolută de radiații. În acest caz, TI a egalat 10. TI-ul indralinei în experimentele pe câini în aceleași condiții ar fi puțin mai mult de 10 [2]. Pe baza datelor publicate privind toxicitatea și proprietățile de protecție împotriva radiațiilor amifostinei în experimente pe câini [12, 13, 20, 38] și folosind același principiu pentru calculul său, TI sa dovedit a fi aproape de trei. Având în vedere potențialul ridicat al eficacității de protecție împotriva radiațiilor a amifostinei și a indralinei în experimentele pe câini, acesta din urmă are un TI de trei ori mai mare. TI mare pentru indralină în experimentele pe câini și maimuțe se datorează specificității și potențialului ridicat al acțiunii receptorului alfa1-adrenergic radioprotector în comparație cu cea a radioprotectorilor din familia aminotiolilor, care își pun efectul protector prin procese biofizice și biochimice în celule [2].