Brandon M. Chelette

1 Departamentul de Științe Biologice, Universitatea de Stat din Florida, Tallahassee, Florida,

2 programe în neuroștiințe, Universitatea de Stat din Florida, Tallahassee, Florida,

Abigail M. Thomas

1 Departamentul de Științe Biologice, Universitatea de Stat din Florida, Tallahassee, Florida,

Debra Ann Fadool

1 Departamentul de Științe Biologice, Universitatea de Stat din Florida, Tallahassee, Florida,

2 programe în neuroștiințe, Universitatea de Stat din Florida, Tallahassee, Florida,

3 Biofizică moleculară, Universitatea de Stat din Florida, Tallahassee, Florida,

Abstract

Introducere

Prevalența obezității în populația umană crește într-un ritm alarmant. În Statele Unite, procentul adulților obezi a crescut de la 15% în 1990 la peste 35% în 2012, iar obezitatea este acum descrisă în mod obișnuit ca o epidemie (Ogden și colab. 2014). Obezitatea a fost corelată cu incidența crescută a multor boli, precum și cu mortalitatea crescută (Smith și colab. 2016). Estimările impactului financiar variază, dar costul obezității a fost raportat în sute de miliarde de dolari în Statele Unite (Smith și colab. 2016). Aceste tendințe tulburătoare au necesitat un efort sporit de cercetare pentru a descoperi strategiile de prevenire și tratament pentru obezitate.

Exercițiul fizic a fost prescris mult timp pentru a trata obezitatea, dar beneficiile exercitării voluntare se extind dincolo de încercările de a pierde în greutate (Dipietro 1999). Studiile au indicat faptul că participarea la exerciții voluntare suprimă inflamația sistemului nervos central, încetinește declinul cognitiv și reducerea volumului hipocampic asociat cu îmbătrânirea, modulează microbiomul și combate rezistența la insulină (Yuede et al. 2009; Do et al. 2018; Allen și colab. 2018). Invers, inactivitatea a fost identificată ca un factor de risc pentru dezvoltarea bolilor neurodegenerative, cum ar fi boala Alzheimer și demența (Norton și colab. 2014). Având în vedere epidemia de obezitate, descoperirea mai recentă a beneficiilor suplimentare pentru sănătate ale exercițiilor fizice și a detrimentelor unui stil de viață sedentar, exercițiile voluntare primesc o atenție reînnoită a cercetării (Patten și colab. 2015; Idorn și colab. 2017).

Investigația noastră este prima care a caracterizat fenotipul în funcțiune al șoarecilor, unde am măsurat interacțiunile de acces de șase luni la exerciții voluntare, modificarea dietei și pierderea genetică a canalului Kv1.3. Am descoperit că atât șoarecii de tip sălbatic, cât și șoarecii Kv1.3 - nulați, cu o dietă moderat bogată în grăsimi, au participat la rularea roților mai des și au fugit mai departe decât șoarecii hrăniți cu control. De asemenea, am demonstrat că participarea la exerciții voluntare, așa cum era de așteptat, a protejat parțial șoareci de tip sălbatic de adipozitate crescută și insensibilitate la glucoză asociată cu dieta MHF în comparație cu șoareci sedentari hrăniți cu MHF. În cele din urmă, Kv1.3 - șoareci nuli au avut aceeași distanță și viteză ca șoarecii de tip sălbatic atunci când au fost menținuți pe aceeași dietă, dar modelele lor de odihnă și alergare au diferit atât în ​​fazele luminoase, cât și în cele întunecate.

Materiale și metode

Îngrijire animale

160 de zile). Toți șoarecii au primit două surse suplimentare de îmbogățire, care au inclus o casă și pătrate de cuibărit.

Linii animale

Greutatea corporală și adipozitatea

Pentru a compara creșterea în greutate normală cu creșterea în greutate crescută și depunerea țesutului adipos cauzată de menținerea dietei MHF, greutatea corporală a fiecărui șoarece a fost înregistrată săptămânal. La terminare, tampoanele de grăsime au fost excizate și cântărite de un investigator care era orb de genotipul și grupul de tratament al șoarecelui. Au fost colectate și combinate țesuturi adipose epididimale, retroperitoneale, subcutanate (un subșantion din partea dreaptă) și mezenterice. Grăsimea brună nu a fost prelevată.

Comportamentul de exerciții voluntare

Șoarecii aparținând grupurilor de tratament voluntar de exerciții au primit acces ad libitum la o roată de rulare din cușca lor. După înțărcare și după o perioadă de aclimatizare de 2 zile la cușca lor individuală mai mare, o roată verticală fără fir (Med Associates, Inc., St Albans, VT, https://www.med-associates.com/product/vertical- wireless-running-wheel-for-mouse /) a fost fixat în cușcă. Senzorul roții a fost așezat deasupra capacului de sârmă și colectoarele din plastic s-au extins în cușca care a ținut roata rulantă deasupra așternutului și a permis rotirea. O roată curată a fost furnizată săptămânal, iar roțile au fost lubrifiate cu ulei de silicon non-caloric, fără gust și fără miros, după cum este necesar pentru a minimiza scârțâitul potențial stresant al roții rotative. Senzorul roții a înregistrat numărul de rotații și a transmis datele la un butuc central la fiecare 30 de secunde. Hubul a fost la rândul său conectat la un computer echipat cu programul software Wheel Manager (Med Associates, Inc., https://www.med-associates.com/product/wheel-manager/), care a arhivat datele și a permis exportul de date la încheierea perioadei curente. Datele rulate au fost exportate în Microsoft Excel (Microsoft Office 365, https://www.microsoft.com/en-us/education/products/office) prin intermediul programului software Wheel Analysis (Med Associates, Inc.). Un coș de 1 minut a fost cea mai mică dimensiune a coșului pe care software-ul a permis să fie exportat.

O majoritate a datelor de comportament de rulare raportate în acest manuscris sunt un submostru de 28 de zile pentru fiecare șoarece în loc de întreaga perioadă experimentală de 6 luni. Am concluzionat că limitarea analizei la o perioadă de 28 de zile este justificabilă deoarece (1) a permis excluderea perioadei de aclimatizare de 3 zile în care șoarecii au rulat foarte puțin și/sau inconsecvent și (2) a permis excluderea valori aberante ale comportamentului de funcționare care s-au datorat în mod evident unei erori tehnice (blocarea așternutului sau a bateriei slabe) spre deosebire de schimbările de comportament efective ale unui mouse. Datorită reproducerii eșalonate, nu toți șoarecii au inițiat tratamentul de exerciții fizice la aceeași dată calendaristică și, prin urmare, au fost afectați diferențial de disfuncționalități ale software-ului, baterii moarte sau condiții meteorologice extreme care necesită evacuarea de către cercetători. Ori de câte ori este posibil, submostrul de 28 de zile a constat din 28 de zile consecutive în mijlocul perioadei de tratament cu efort. În caz de lipsă a datelor din cauza motivelor enumerate anterior, lacunele au fost umplute cu datele de rulare înregistrate, imediat adiacente.

Distanța medie de rulare a fost calculată ca kilometri medii parcurși pe zi pe eșantionul de 28 de zile pentru fiecare șoarece. Timpul activ a fost calculat ca numărul de coșuri de 1 minut în care mouse-ul a participat la rularea roților. Viteza de rulare a fost raportată ca rotația medie a roților pe minut pentru fiecare coș de 1 minut în care șoarecii au fost activi. Rafalele de rulare au fost definite ca pubele consecutive de 1 minut în timpul cărora mouse-ul a fost activ, în timp ce repausurile au fost definite ca pubele consecutive de 1 minut în timpul cărora mouse-ul a fost inactiv. Latența de funcționare este definită ca timpul mediu de la debutul întunericului până când un mouse se angajează în roată. Latența de oprire este definită ca perioada medie de timp după apariția luminii până când un mouse a încetat să se angajeze în roată.

Toleranță la glucoză

Un test intraperitoneal de toleranță la glucoză (IPGTT) a fost efectuat pe șoareci la vârsta de aproximativ 6 luni după finalizarea a 5 din cele 6 luni de exerciții voluntare (pentru șoareci cu acces la roată). Șoarecii au fost posti timp de 12 h prin faza lor întunecată (0800-2000 h) înainte de administrarea IPGTT. Șoarecii au fost injectați cu un volum de soluție de glucoză 25% echivalent cu 1 g glucoză pe kg de greutate corporală (Universitatea din Virginia Vivarium Protocols, Susanna R. Keller). O mică incizie a fost făcută pe coadă, iar probele de sânge au fost colectate cu un sistem de monitorizare a glicemiei Ascensia CONTOUR TM (Bayer Healthcare, Whippany, NJ, https://www.contournext.com/products/contour-next/) asociat cu CONTOUR Benzi de testare a glucozei din sânge (Bayer Healthcare) pentru a determina nivelurile de glucoză din sânge la momentul inițial (înainte de injecție) și la punctele de timp stabilite 10, 20, 30, 60, 90 și 120 de minute după injectare. Șoarecii din grupurile voluntare de tratament cu exerciții fizice și-au păstrat accesul la roata lor de rulare pe durata IPGTT.

analize statistice

Greutatea corporală finală, greutatea țesutului adipos, analiza integrată a zonei sub curbă (iAUC) a toleranței la glucoză și toate comportamentele de rulare calculate (distanță, viteză, explozii etc.) au fost comparate utilizând o analiză a varianței (ANOVA) ). Toate testele statistice au folosit α = 0,05 ca interval minim de încredere pentru semnificație și toate valorile raportate sunt media ± abaterea standard (s.d.). Toate analizele post-hoc au utilizat testul de comparație multiplă al lui Tukey și comparațiile semnificativ diferite au fost indicate prin litere diferite în cifre. Organizarea și analiza datelor au fost efectuate cu Microsoft Excel și sistemul de calcul statistic R Project (R Core Team 2018). Actogramele dublate au fost generate folosind Fiji și pluginul asociat ActogramJ (http://actogramj.neurofly.de/) (Schmid și colab. 2011; Schindelin și colab. 2012). Graficele au fost proiectate și generate utilizând software-ul Origin Student 2018b (versiunea b9.5.5.409 OriginLab Corporation, Northhampton, MA, https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/OriginStudentVersion). Testele statistice au fost efectuate cu Graphpad Prism (versiunea 7.04, Graphpad Software, La Jolla, CA, https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/).

Rezultate

Toate datele, care stau la baza rezultatelor și raportate în acestea, sunt disponibile la cererea autorilor.

Rularea roților oferă o protecție parțială împotriva efectelor dietei MHF

Rularea roților este constantă în timp, independent de genotip sau dietă

După perioada de aclimatizare de 3 zile și cu excepția oricăror erori tehnice, șoarecii din toate grupurile de tratament cărora li s-a furnizat o roată au funcționat foarte constant pe parcursul întregii perioade de 120-160 zile. Evaluarea calitativă a actogramelor cu grafic dublu a arătat că șoarecii participă la rularea roților într-un mod care este destul de antrenat la ciclul lor de lumină/întuneric, fără abatere brută (Fig. (Fig.3). 3). S-a constatat că cuantificarea latenței pentru a opri funcționarea la încheierea ciclului întunecat descoperă diferențe între genotipuri în comportamentul blocat în timp la actogramă, care nu este legat de dietă (Fig. (Fig. 5, 5, vezi rezultatele de mai jos). Urmărirea distanței medii zilnice de funcționare în timp a arătat că săptămânal și lunar șoarecii au funcționat constant (Fig. (Fig. 4C - D). 4 C - D). Datele din Figurile Figurile 4, 4, 5, 5, 6 6 conțin analize de rulare rafinate și, prin urmare, am eliminat prefixul „RW” (roată de rulare) din grafice și text pentru claritate, deoarece toți șoarecii din aceste figuri sunt alergători de roți.

dieta

Comportamentul de alergare poate fi vizualizat și evaluat calitativ prin utilizarea unei actograme dublă. (A) Reprezentant al unui eșantion de 28 de zile de activitate a roții de rulare pentru un șoarece în fiecare grup de tratament. Fiecare vârf corespunde unui bloc de timp de 1 minut și amplitudinea vârfului este determinată de câte rotații au avut loc în acel coș de 1 minut. (B) Cutie de inserare din (A) Vizualizare mărită a 3 zile de activitate a roții de rulare pentru fiecare grup de tratament. Cutie deschisă = ciclu luminos, cutie închisă = ciclu întunecat.

Viteza și distanța de rulare sunt consistente în timp pentru șoarecii WT și KO menținuți în mod cronic CF și MHF. Șoarecii menținuți pe dieta MHF rulează mai departe, dar nu cu o viteză mai mare, indiferent de genotip. Grafic cu bare de (A) Distanța de rulare și (B) Viteza calculată pe un interval de 28 de zile. (C și D) Grafic liniar al distanței medii zilnice de funcționare în timp în (C) săptămâni și, respectiv, (D) luni. Datele sunt raportate și aplicate metrice statistice, iar notațiile sunt ca în Figura Figura1. 1. Șoareci (numai bărbați) pe grup de tratament după cum urmează: (A - D) 15, 10, 10 și 8.

Modele de funcționare a fazelor deschise și întunecate la șoareci WT și KO menținute pe dietele CF versus dietele MHF. (A și B) Graficele cu bare ale roții active care rulează în faza (A) întunecată și respectiv (B) luminoasă, pe un eșantion de 28 de zile. (C) Grafic cu bare ale latenței pentru a rula mai întâi după debutul întunecat (D) Grafic cu bare pentru latența pentru a opri rularea după debutul luminos. Datele sunt raportate și aplicate metrice statistice, iar notațiile sunt ca în Figura Figura1. 1. Șoareci (numai bărbați) pe grup de tratament (A - D) 15, 10, 10 și 8.

Rafale de desfășurare și intervale de odihnă observate la șoareci WT și KO menținuți pe dietele CF versus dietele MHF. Compararea graficului cu bare (A) Numărul de rafale de rulare, (B) Lungimea rafalei, (C) Numărul de intervale de repaus și (D) Lungimea de repaus calculată pe un interval de 28 de zile. (E și F) Grafic liniar care trasează timpul de odihnă față de faza întunecată de 12 h într-o cohortă de șoareci cu (E) CF‐ și (F) MHF -, respectiv, la momentul de 4 luni. Datele sunt raportate și aplicate metrice statistice, iar notațiile sunt ca în Figura Figura1. 1. Șoareci (numai bărbați) pe grup de tratament (A - D) 15, 10, 10 și 8. (E) 15 și 10. (F) 12 și 8.

Ablația Kv1.3 și dieta grasă afectează activitatea de rulare a roților

Șoarecii WT și KO menținuți pe dieta MHF au depășit mai mult decât cele două grupuri alimentate cu CF (WT - CF = 7,16 km (SD 2,85); KO - CF = 7,51 (SD 2,0); WT - MHF = 11,58 (SD 4,85); KO-MHF = 11,91 (SD 1,12); F (3,39) = 7,23, P = 0,0006) (Fig. (Fig. 4A). 4 A). Șoarecii WT-MHF și KO-MHF au funcționat ușor mai repede decât WT-CF și WT-MHF, dar acest lucru nu a atins semnificația statistică (Fig. (Fig. 4 4 B).

Rafalele de rulare au fost calculate ca numărul de coșuri consecutive de 1 minut pe care un șoarece a fost implicat activ în rularea roților în timpul fazei întunecate. Resturile au fost calculate în mod similar cu numărul de coșuri consecutive de 1 minut în timpul cărora mouse-ul nu a funcționat activ în timpul fazei întunecate. Astfel, lungimea unei explozii sau repausuri ar putea varia de la 1 - min lung la ore. Toate cele patru grupuri de tratament au participat la același număr de rafale (WT - CF = 1227 rafale (SD 252); WT - MHF = 1218 (SD 93); KO - CF = 1282 (SD 194), KO - MHF = 1093 150); F (3,39) = 1,48, P = 0,23), dar lungimea rafalelor de rulare a fost semnificativ mai mare pentru șoarecii hrăniți cu MHF comparativ cu șoarecii hrăniți cu CF pentru ambele genotipuri (WT - CF = 8,6 min pe rafală 1.6), KO - CF = 7.6 (SD 0.8), WT - MHF = 11.5 (SD 2.0), KO - MHF = 13.5 (SD 2.3); F (3.39) = 23.2, P (Fig.6A) + B). 6 A + B). Șoarecii KO-MHF angajați în cele mai puține repausuri, semnificativ mai mici decât grupurile hrănite cu CF, dar nu semnificative statistic în comparație cu grupul WT-MHF (WT-CF = 1.217 (SD 208), WT-MHF = 1156 (SD 87), KO-CF = 1315 (SD 136); KO-MHF = 1005 (SD 134); F (3,39) = 6,1, P = 0,002) (Fig. (Fig. 6C). 6 C). Ambele grupuri alimentate cu MHF angajate în repausuri mai scurte comparativ cu cele două grupuri alimentate cu CF (WT - CF = 7,9 min pe repaus) (SD 2.0); KO - CF = 7,4 (SD 2.0); WT - MHF = 5,0 (SD 1,0) ), KO - MHF = 5,1 (SD 0,9); F (3,39) = 8,8, P 6 D). Am examinat distribuția comportamentului de odihnă pe toată faza întunecată, combinând activitatea în ore. Independent de dietă, ambele grupuri WT au avut o perioadă medie de odihnă de vârf de aproximativ 40 min pe oră la 10 ore în faza întunecată, care s-a scurtat spre sfârșitul fazei întunecate, cu o activitate concomitentă crescută. Șoarecii KO, totuși, nu au prezentat niciodată un astfel de platou și și-au crescut în mod constant perioadele de odihnă în mod progresiv pe parcursul fazei întunecate până la trecerea la faza luminoasă unde au fugit rar (Fig. Fig.5 5 B + D).

Discuţie

În cele din urmă, rezultatele noastre sugerează că ar putea fi important pentru cercetătorii care folosesc modele de rozătoare transgenice să monitorizeze comportamentul de funcționare al animalelor lor în detalii mai fine decât se raportează de obicei. Cantitatea de exerciții fizice efectuate de șoareci în fiecare zi este foarte variabilă în funcție de linia transgenică utilizată (Castilla - Ortega și colab. 2013). Mai mult, unele studii nici măcar nu raportează cantitatea de exercițiu și par să presupună că toți șoarecii rulează normal pur și simplu pentru că o roată este prezentă în cușca lor. Dacă investigatorii cuantifică doar activitatea zilnică (sau nu cuantifică activitatea deloc), ar putea lipsi diferențele în tiparele de exerciții care sunt potențial relevante fiziologic.

Conflict de interese

Autorii nu au conflicte de interese, științifice sau financiare.

Mulțumiri

Mulțumim lui Daniel Gonzalez, Margaret Vinson și Kassandra Ferguson pentru asistența lor tehnică în menținerea roților în funcțiune, măsurarea greutăților corporale și o colecție de țesuturi adipoase. Îi mulțumim lui Carley Huffstetler pentru gestionarea de rutină a laboratorului și creșterea șoarecilor.