Abstract

Diabetul de tip 1 este una dintre cele mai frecvente boli cronice din țările dezvoltate, iar incidența sa a crescut brusc de la cel de-al doilea război mondial. Este cauzată de o distrugere selectivă a celulelor β producătoare de insulină în pancreas, mediată de mecanisme imunologice. Susceptibilitatea la boală este modulată de> 40 de gene de risc diferite, genele HLA contribuind la mai mult de jumătate din susceptibilitatea genetică. Factorii de mediu influențează în mod clar riscul de boală și contribuie la creșterea rapidă a incidenței.

enterovirus

Conexiunea dintre diabetul de tip 1 și infecțiile cu enterovirus a fost studiată pe scară largă. Enterovirusurile au fost găsite în sânge și pancreas la pacienții cu diabet zaharat de tip 1 în mai multe studii și, de asemenea, au fost asociate cu un risc crescut de diabet zaharat de tip 1 în studii prospective (1-7). Descoperirea recentă a polimorfismelor genetice ale genei IFIH1 ca factori de modulare a riscului diabetului a consolidat în continuare această asociere, deoarece aceste gene mediază recunoașterea enterovirusurilor de către sistemul imunitar înnăscut (8,9). Polimorfismele asociate diabetului zaharat par a fi asociate cu un răspuns imun puternic înnăscut, care poate duce la un răspuns inflamator sporit în timpul infecției cu virus (10). Alte gene ale sistemului imunitar înnăscut (rețeaua IRF7) modulează, de asemenea, riscul de T1D (11).

Detectarea frecventă a virusului la pacienții diabetici a sugerat un posibil rol al persistenței virale. Persistența enterovirusului a fost descrisă anterior, de exemplu, în cardiomiopatiile cronice (12) și în modelele animale (13-16), unde enterovirusul și alte picornavirusuri pot persista pentru perioade prelungite. Aceste studii au sugerat că enterovirusul poate persista ca ARN dublu catenar fără sinteză clară a proteinelor (15,17). Se știe din mai multe boli virale că infecția persistentă duce de obicei la un răspuns imun puternic înnăscut, la inflamații locale și la deteriorarea țesutului mediată de imunitate.

Boala celiacă se caracterizează prin inflamații intestinale subțiri, leziuni ale mucoasei și permeabilitate crescută a mucoasei. Asocierea dintre diabetul de tip 1 și boala celiacă este bine stabilită. Prin urmare, este interesant să ipotezăm dacă infecția cu enterovirus și enteropatia contribuie la această asociere.

În ciuda progreselor recente în acest domeniu de cercetare, nu se știe cum enterovirusurile ar putea provoca leziuni selective în celulele β producătoare de insulină. Locul lor principal de replicare este mucoasa intestinală, din care virusul se poate răspândi în sânge (viremia primară) și infecta organele interne. Cu toate acestea, posibila prezență a enterovirusurilor în intestinul uman nu a fost studiată în detaliu. Recent am publicat primul astfel de studiu care sugerează că enterovirusul poate fi prezent în intestinul subțire la pacienții cu diabet zaharat de tip 1 (18). Studiul actual evaluează ipoteza că mucoasa intestinală este un rezervor pentru persistența enterovirusului la pacienții cu diabet zaharat de tip 1, menținând o stare inflamatorie continuă care se poate răspândi în pancreas și poate juca un rol crucial în diabetul indus de enterovirus.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Seria de studii.

Seria de studiu a constat din 120 de persoane în total care au fost supuse gastroscopiei din cauza diferitelor afecțiuni gastro-intestinale. Biopsiile mucoasei intestinului subțire au fost luate din duodenul distal pentru analize morfologice și pentru cercetări de bază. Probele au fost prelevate în perioada 1995-2000 la Departamentul de Gastroenterologie, Spitalul Universitar Tampere. Probele fixate pe formalină au fost disponibile de la toți cei 120 de subiecți din studiu și probele înghețate de la 86 de subiecți.

Subiecții studiați cuprindeau 39 de pacienți diabetici de tip 1, 40 de pacienți cu boală celiacă care nu aveau diabet de tip 1 și 41 de subiecți martori, inclusiv subiecți care nu aveau nici una dintre aceste boli, dar simptome gastrointestinale nespecifice (25 dispepsie, 10 sindrom de colon iritabil, 3 stomatită aftoasă, 1 colită ulcerativă, 1 colită colagenă și 1 în cele din urmă sănătoasă). Mai mult, un subiect de control a avut psoriazis și o nefropatie IgA. Toți subiecții martori au fost nediabetici și nu au prezentat semne de boală celiacă (Tabelul 1).

Rezumatul subiectelor de studiu

Diagnosticul diabetului de tip 1 sa bazat pe criteriile Organizației Mondiale a Sănătății (19) și toți pacienții au fost tratați cu insulină. Șaisprezece au avut, de asemenea, boală celiacă, 10 tulburări autoimune tiroidiene, 1 nefropatie IgA, 1 boală Addison, 1 alopecie și 1 artrită reumatoidă. Durata diabetului a variat de la 0 la 38 de ani (mediană de 20 de ani; informații exacte disponibile de la numai 23 de pacienți).

Boala celiacă a fost diagnosticată la subiecții studiați printr-un rezultat pozitiv al anticorpilor endomiziali și prin atrofia viloză a mucoasei intestinului subțire și hiperplazia criptelor. Boala celiacă fusese diagnosticată recent la toți pacienții și toți urmau o dietă normală care conțin gluten în momentul biopsiei. Un pacient cu boală celiacă a prezentat nefropatie IgA, iar unul a avut hipertiroidism.

Protocolul de studiu a fost aprobat de comitetul etic al Spitalului Universitar din Tampere. Toți subiecții au dat consimțământul informat.

Hibridizare in situ.

Screeningul primar al enterovirusului a fost efectuat pe probe de biopsie fixate în formalină și încorporate în parafină (secțiuni de 5 μm) utilizând un test de hibridizare in situ (ISH) așa cum s-a descris anterior (4,18,20). Aceasta se bazează pe o singură sondă specifică enterovirusului care vizează o secvență foarte conservată, comună în grup, în regiunea 5'-necodificatoare a genomului enteroviral. Această analiză acoperă majoritatea, dacă nu toate tipurile de enterovirusuri cunoscute. Toate analizele au fost efectuate orb la starea de caz-control a subiecților. Semnalul de hibridizare pozitiv a fost semiquantificat prin numărarea celulelor pozitive pe câmp microscopic în următoarele categorii: negativ (fără celule pozitive), slab pozitiv (o medie de 1-10 celule pozitive pe câmp microscopic utilizând o mărire de 400 de ori), moderat pozitiv (10- 100 celule pozitive pe câmp) și puternic pozitiv (> 100 celule pe câmp).

Colorarea imunohistochimică.

Enterovirus RT-PCR.

Pentru RT-PCR, probele de biopsie nefixate au fost depozitate congelate în mediu optim de temperatură de tăiere la -70 ° C. Probele de biopsie au fost eliminate din mediul optim de temperatură de tăiere și omogenizate folosind un omogenizator SilentCrusher S (Heidolph, Schwabach, Germania). ARN-ul a fost extras cu RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germania). RT-PCR a fost efectuat folosind două metode independente: o metodă descrisă anterior care amplifică o secvență comună tuturor serotipurilor enterovirus cunoscute (25) și o RT-PCR în timp real utilizând aceiași primeri și sonde. Un eșantion a fost considerat enterovirus pozitiv dacă a dat un semnal pozitiv în cel puțin una dintre aceste analize.

analize statistice.

Analizele statistice au fost efectuate folosind SPSS 18.0 pentru Windows. Compararea frecvenței a fost efectuată cu testele exacte Pearson χ 2 și Fisher, iar variabilele continue au fost analizate prin testul t eșantion independent.

REZULTATE

Probele de biopsie a intestinului subțire au fost examinate mai întâi pentru prezența genomului enterovirusului utilizând metoda ISH. Șaptezeci și patru la sută dintre pacienții cu diabet zaharat de tip 1, comparativ cu 29% dintre subiecții martor, s-au dovedit a fi pozitivi la virus (P Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up
  • Descărcați PowerPoint

Subiecți pozitivi pentru ARN enterovirus de ISH în probe de biopsie a intestinului subțire

Detectarea ARN enterovirus de către ISH în biopsiile intestinale ale pacienților diabetici de tip 1, inclusiv cazuri slab pozitive (A), moderate pozitive (B) și puternic pozitive (C). D: Colorare imunohistochimică pentru proteina enterovirus VP1. Săgețile indică celulele pozitive pentru ARN enterovirus (A) și proteina VP1 (D). (O reprezentare digitală de înaltă calitate a acestei cifre este disponibilă în numărul online.)

Markeri de inflamație la ISH + și ISH - subiecți

Subiecții cu densitate crescută de celule T CD3, αβ și γδ, expresie HLA-DR și transglutaminază 2 - depozite de IgA vizate în mucoasa intestinală

DISCUŢIE

Studiul actual sugerează că mucoasa intestinală a pacienților cu diabet zaharat de tip 1 este frecvent infectată de enterovirusuri. Constatările se potrivesc bine cu persistența virală, un fenomen observat frecvent în infecțiile cu picornavirus și care poate duce la inflamații prelungite și leziuni tisulare (26). Această observație confirmă, de asemenea, studiul nostru anterior care arată un fenomen similar la un subgrup mai mic de pacienți diabetici și subiecți martori (18).

Este posibil ca persoanele sensibile la diabetul de tip 1 să fie predispuse la infecții cu enterovirus și la persistența lor. În teorie, o astfel de susceptibilitate ar putea fi mediată de factori genetici care conferă susceptibilitate la diabetul de tip 1. Se știe că unele dintre aceste gene de susceptibilitate, cum ar fi genele HLA și IFIH1, influențează răspunsurile imune împotriva enterovirusurilor (9,31). Cu toate acestea, nu există studii disponibile cu privire la rolul posibil al acestor gene în dezvoltarea persistenței enterovirusului. În studiul actual, detectarea ARN enterovirus nu a fost asociată cu genele de risc HLA pentru diabetul de tip 1, argumentând împotriva unui efect major al genelor HLA. Pe lângă factorii genetici, se știe că hiperglicemia predispune la infecții. Prin urmare, nu putem exclude posibilitatea ca diabetul în sine să predispună la infecții prelungite cu enterovirus. Cu toate acestea, detectarea enterovirusului nu a fost asociată cu durata diabetului de tip 1, ceea ce se opune indirect acestei posibilități.

Intensitatea colorării și numărul de celule pozitive din ISH au variat între grupurile de studiu, pacienții cu diabet de tip 1 prezentând o pozitivitate semnificativ mai puternică decât pacienții cu boală celiacă și subiecții martor. Acest lucru sugerează că virusul se reproduce la un nivel mai ridicat la subiecții diabetici, producând mai multe molecule de ARN și infectând mai multe celule. Pozitivele foarte slabe au fost relativ frecvente și în rândul subiecților de control al bolii, sugerând că o infecție de grad scăzut ar fi putut contribui la simptomele gastrointestinale nespecifice la unii dintre ei.

Virusul ARN a fost găsit folosind diverse tehnici, inclusiv teste ISH și RT-PCR. Chiar dacă au dat rezultate paralele, a fost evident că pozitivitatea enterovirusului a fost mai frecventă în ISH decât în ​​RT-PCR. Acest lucru s-ar putea explica prin faptul că pentru aceste două metode au fost necesare două probe de biopsie separate, precum și prin diferențele metodologice în pretratarea probelor și posibila prezență a inhibitorilor PCR, care afectează sensibilitatea PCR (18).

În concluzie, propunem că infecția persistentă cu enterovirus în mucoasa intestinală poate juca un rol în patogeneza diabetului de tip 1. Mucoasa intestinală poate fi un important rezervor de virus din care virusul se poate răspândi în pancreas, care este anatomic foarte apropiat și are rețele limfatice și vasculare comune. De asemenea, persistența virală în mucoasa intestinală poate menține mediul de inflamație cronică în această rețea, care poate promova autoreactivitatea insulelor prin mecanismul de activare al spectatorilor. De exemplu, celulele T γδ +, care au fost în mod clar asociate cu prezența enterovirusului în mucoasa intestinală, facilitează autoimunitatea în miocardita indusă de enterovirus prin inhibarea activității celulelor T reglatoare (32).

MULȚUMIRI

Acest studiu a fost susținut financiar de subvenții de la Juvenile Diabetes Research Foundation, Sohlberg Foundation, Sigrid Juselius Foundation, Academia din Finlanda și finanțarea pentru cercetare competitivă a Spitalului Universitar din Tampere. În plus, o parte a studiului a fost finanțată de proiectul PEVNET (al șaptelea program-cadru european GA-261441-PEVNET).