Prezentare generală a proiectării experimentale. După 7 săptămâni de studiu de hrănire, peștii hrăniți cu ambele diete au fost supuși provocării imune printr-o injecție intraperitoneală (IP) de soluție salină sterilă tamponată cu fosfat (PBS), antigen bacterian Aeromonas salmonicida (ASAL) sau acid polirribocitidilic polirribinoinosinic mimic (pIC) . șabloanele pentru rinichi de cap (HK) pregătite mirVana din trei din fiecare pește injectat cu PBS-, pIC- și ASAL (numai dieta de control) au fost selectate pentru secvențierea profundă pe baza expresiei evaluate qPCR a pIC cunoscut (adică, isg15a, mxb, irf7b) și ASAL (adică, campb, tlr5a, il1b) transcrieri ale biomarkerului imun. MiARN selectivi care răspund la pIC și/sau ASAL au fost studiați prin qPCR folosind toate probele din ambele grupuri dietetice. * Analizele ARNm qPCR au fost efectuate folosind ARN total tratat cu DNază și purificat pe coloană.

imunostimulant

Analize qPCR ale miARN identificate prin secvențierea profundă ca fiind responsive atât la injecțiile pIC, cât și la cele ASAL (n = 8-9). Sunt reprezentate graficele medii log2 RQ-uri cu bare SE. Un asterisc (*) reprezintă o diferență semnificativă între diete în fiecare tratament de injecție (ppx-axă. Pentru calculul qPCR de schimbare a pliurilor, reglarea globală a pliurilor a fost calculată ca 2 A - B ca în Xue și colab. [46], unde A este media log2 RQ din grupurile pIC sau ASAL, iar B este media log2 RQ din grupul PBS potrivit dietelor. (A) miR-27d-1-2-5p; (B) miR-29b- 2-5p; (C) miR-146a-5p; (D) miR-146a-1-2-3p; (E) miR-221-5p;.

Analize qPCR ale miARN-urilor identificate prin secvențierea profundă ca fiind responsive la pIC singur (n = 8-9). Sunt reprezentate graficele medii log2 RQ-uri cu bare SE. Un asterisc (*) reprezintă o diferență semnificativă între diete în fiecare tratament de injecție (ppx-axă. Pentru calculul qPCR de schimbare a pliurilor, reglarea globală a pliurilor a fost calculată ca 2 A - B ca în Xue și colab. [46], unde A este media log2 RQ din grupurile pIC sau ASAL, iar B este media log2 RQ din grupul PBS potrivit dietelor. (A) miR-30e-1-2-3p; (B) miR-135bd- 5p; (C) miR-181a-5-3p; (D) miR-462a-3p.

Analize qPCR ale miARN identificate prin secvențierea profundă ca fiind responsive la ASAL singur (n = 8-9). Sunt reprezentate graficele medii log2 RQ-uri cu bare SE. Un asterisc (*) reprezintă o diferență semnificativă între diete în fiecare tratament de injecție (ppx-axă. Pentru calculul qPCR de schimbare a pliurilor, reglarea globală a pliurilor a fost calculată ca 2 A - B ca în Xue și colab. [46], unde A este media log2 RQ din grupurile pIC sau ASAL, iar B este media log2 RQ din grupul PBS care se potrivește cu dieta. Pentru miARN-uri reglementate în jos, valorile de schimbare a pliurilor au fost inversate (-1/fold- schimbare) (A) miR-192a-5p, (B) miR-194a-5p, (C) miR-725-5p, (D) miR-roman-16-5p, (E) miR-722-3p, ( F)) miR-727a-3p.

Analize qPCR ale expresiei bazale (eșantioane de pre-injecție) ale miARN-urilor sensibile la PIC și/sau ASAL identificate prin secvențierea profundă (n = 8). Sunt reprezentate graficele medii log2 RQ-uri cu bare SE. Un asterisc (*) indică o diferență semnificativă între diete pentru un miARN dat (p A - B ca în Xue și colab. [46], unde A este media log2 RQ din grupul CpG, iar B este media log2 RQ din grupul de control. Pentru miARN-uri reglementate în jos, valorile de schimbare a pliurilor au fost inversate (−1/fold-change). (A) miR-27d-1-2-5p; (B) miR-29b-2 -5p (C) miR-30e-1-2-3p, (D) miR-135bd-5p, (E) miR-146a-5p, (F) miR-146a-1-2-3p, (G) miR - 181a-5-3p; (H) miR-192a-5p; (I) miR-194a-5p; (J) miR-221-5p; (K) miR-462a-3p; (L) miR-722- 3p; (M) miR-725-5p, (N) miR-727a-3p, (O) miR-roman-16-5p.

Principalele analize de coordonate (PCoA) ale genelor miRNA analizate de qPCR (valori RQ) în probe de pre-injecție (de exemplu, probe T0; A) și probe de rinichi cap de 24 de ore după injectare (B).

Abstract

1. Introducere

50% în 2016), continuă să crească din cauza unei producții globale de pescuit sălbatic plat sau în scădere, în fața creșterii populației umane [1,2,3]. În consecință, există un potențial mare pentru industria acvaculturii de a se extinde. Cu o varietate de specii cultivate, somonul Atlantic (Salmo salar) este una dintre cele mai importante specii din punct de vedere economic în acvacultură [4]. Bolile infecțioase au avut ca rezultat o mortalitate substanțială și pierderi pentru acvacultura somonului din întreaga lume, afectând creșterea și durabilitatea industriei [5]. Mai mulți viruși cunoscuți care cauzează boli severe la somonul atlantic sunt virusurile ARN [6]. Acestea includ virusuri cu genomuri de ARN monocatenar (de exemplu, alphavirusul salmonid (SAV), virusul anemiei infecțioase a somonului (ISAV) și virusul septicemiei hemoragice virale (VHSV)) și genomurile ARN-ului cu dublă catenă (de exemplu, virusul necrozei pancreatice infecțioase (IPNV) ) [6]. Agenții patogeni bacterieni care au un impact sever asupra acvaculturii salmonidelor includ Piscirickettsia salmonis (care cauzează piscirickettsioza sau septicemia rickettsială salmonidă) [7], Aeromonas salmonicida (cauza furunculozei) [8], Renibacterium salmoninarum (cauza bolii renale bacteriene) [9] ] și Moritella viscosa (cauza bolii ulcerului de iarnă) [10].

2. Materiale și metode

2.1. Producția de furaje

2.2. Încercarea de hrănire, provocarea imună și eșantionarea peștilor

10-11 ° C, oxigen dizolvat ≥ 10 mg L -1) într-o fotoperioadă luminoasă de 24 de ore. Peștii au fost hrăniți până la saturație aparentă folosind hrănitoare automate (AVF6 Vibratory Feeder; Pentair Aquatic Eco-Systems, Inc., Nanaimo, BC, Canada), care au fost setate să vibreze timp de 3 s pe oră de la 5 pm la 3 am. Rația zilnică a fost stabilită la 1% din greutatea corporală medie (BW) a somonului în fiecare rezervor, care a fost estimată folosind greutatea inițială a acestora (pentru fiecare rezervor, individual) și presupunând o creștere exponențială de 1% BW/zi. Saturația a fost evaluată prin monitorizarea cantității de pelete nemâncate în dimineața următoare. O imagine de ansamblu asupra proiectului experimental, incluzând procesul de hrănire, provocările imune și analizele moleculare ulterioare (discutate mai jos), este ilustrată în Figura 1.

2.3. Izolarea ARN-ului

2.4. Pregătirea bibliotecii și secvențierea profundă

2.5. Analiza datelor secvențiale profunde

2.6. Predicția genelor țintă și a adnotărilor lor funcționale

2.7. qPCR Analiza expresiei miARN

2.8. Analize statistice

3. Rezultate

3.1. Secvențierea profundă și identificarea miARN-urilor exprimate diferențial

3.2. Validarea qPCR a miRNA-urilor responsive PIC și/sau ASAL identificate prin DESeq2

De 2 ori) (Tabelul 2 și Tabelul 3; Figura 2). Dintre miARN-urile care au răspuns doar la stimularea pIC, inducerea miR-462a-3p (5,7 ori) a fost mai mare decât miR-30e-1-2-3p (2,7 ori) și miR-181a-5-3p 2,2 -fold) (Tabelul 2; Figura 3A, C, D). Pentru miARN-urile identificate în secvențare profundă care au răspuns doar la ASAL, miR-727a-3p a fost demonstrat de qPCR că este semnificativ reglat în jos în somonul injectat cu ASAL în comparație cu controlul PBS (Tabelul 3; Figura 4F). Este demn de remarcat faptul că miR-725-5p a fost semnificativ reglat în sus (de 2,3 ori) prin stimularea PIC la peștii hrăniți cu dieta de control (Figura 4C).