Dr. Marc P. Hübner

îmbunătățește

Institutul de Microbiologie Medicală, Imunologie și Parazitologie

Spitalul Universitar din Bonn, clădirea 63

Sigmund-Freud-Strasse 25, Bonn, DE-53105 (Germania)

Articole similare pentru „”

  • Facebook
  • Stare de nervozitate
  • LinkedIn
  • E-mail

Abstract

Introducere

Studii transversale recente efectuate în India, Indonezia, China rurală și la aborigenii din Australia au arătat că prevalența infecțiilor cu helminți la pacienții cu T2D este semnificativ mai mică decât în ​​controalele nondiabetice, independent de diferențele socio-economice în ceea ce privește veniturile și nutriția, sugerând că infecțiile cu helminți pot într-adevăr preveniți sau întârziați apariția T2D [15,16,17,18]. Posibile mecanisme de protecție mediate de helminți includ reglarea descendentă a răspunsurilor imune proinflamatorii asociate cu T2D, inducerea răspunsurilor imune de tip 2, promovarea absorbției de acizi grași sau o expresie mai puternică a genelor asociate cu sensibilitatea la insulină. Acest lucru este susținut de constatarea faptului că administrarea unui antagonist al receptorului recombinant (anakinra) pentru a bloca semnalizarea citokinei pro-inflamatorii IL-1β glicemie ameliorată și secreția de insulină de la celulele β-insulă ale pacienților T2D [19]. În mod similar, terapia anti-TNFα a îmbunătățit absorbția glucozei într-un model murin de T2D [20]. Efectul benefic al absorbției îmbunătățite a acidului gras asupra îmbunătățirii sensibilității la insulină a fost demonstrat în continuare în mai multe studii [21,22].

În acest studiu, am investigat dacă L.s. infecție sau L.s. administrarea extractului de viermi adulți (LsAg) îmbunătățește toleranța la glucoză la șoarecii DIO și a analizat posibilele mecanisme de protecție.

Materiale și metode

Declarație de etică

Condițiile de adăpostire a animalelor și procedurile utilizate în această lucrare au fost efectuate în conformitate cu orientările Uniunii Europene privind bunăstarea animalelor. Toate protocoalele au fost aprobate de Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Köln, Germania (87-51.04.2010.A355 și 84-02.04.2014.A131).

Animale și îngrijirea animalelor

Experimentele au fost efectuate folosind șoareci masculi de tip sălbatic (WT) și ΔdblGATA pe un fundal BALB/c, precum și șoareci C57BL/6J WT și C57BL/6 DEREG. Șoarecii BALB/c și C57BL/6J au fost cumpărați de la Janvier Labs (Le Genest-St.-Isle, Franța). Șoarecii BdblGATA au fost inițial obținuți de la Laboratorul Jackson (Bar Harbor, Maine, SUA), iar șoarecii DEREG C57BL/6 au fost furnizați de Prof. Dr. Tim Sparwasser și Dr. Katharina Lahl (Centrul TWINCORE pentru Cercetarea Infecțiilor Experimentale și Clinice, Hanovra, Germania). Șoarecii au fost crescuți și adăpostiți la facilitățile pentru animale de la Spitalul Universitar din Bonn. Șoarecii au fost menținuți în cuști ventilate individual cu un ciclu de 12 ore zi/noapte și alimente și apă ad libitum. Începând cu vârsta de 6-8 săptămâni, subseturile de șoareci au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (HF) care oferă 60% din calorii din grăsimi (Research Diets, Inc., Brogaarden, Danemarca).

L.s. Infecţie

L.s. infecția a fost efectuată prin infecție naturală așa cum s-a descris anterior [23]. Dacă nu s-a specificat altfel, șoarecii sensibili BALB/c au fost infectați la vârsta de 8-10 săptămâni, la 1-2 săptămâni după debutul dietei IC. Pentru infecția naturală, larvele L3 infecțioase au fost transmise odată cu masa de sânge a celor infectați Ornithonyssus bacoti acarieni. Larvele L3 migrează către cavitatea toracică, unde se transformă în viermi adulți (aproximativ 30 de zile după infectare). În momentul necropsiei, starea de infecție a șoarecilor a fost confirmată prin screening pentru viermi adulți în cavitatea toracică.

Pregătirea și administrarea LsAg

LsAg a fost preparat așa cum s-a descris anterior [24]. Scurt, L.s. viermii adulți au fost recoltați din cavitatea toracică a șobolanilor sau gerbilelor de bumbac infectați și omogenizați mecanic pe gheață în PBS fără endotoxine (PAA, Pasching, Austria) folosind un olar de sticlă steril. După centrifugare la 3.200 g, supernatantul a fost colectat și concentrația de proteină măsurată prin testul Bradford (Cytoskeleton, Denver, Colorado, SUA). Alicote de LsAg au fost stocate pentru utilizare ulterioară la -80 ° C.

Injecții intraperitoneale zilnice de 2 Lg LsAg per șoarece timp de 2 săptămâni au fost administrate șoarecilor masculi C57BL/6J PART în timpul săptămânilor 8-10 sau 12-14 din dieta HF. Controalele au primit cantități egale de PBS steril (PAA). După ultima injecție cu LsAg, toate grupurile de șoareci au fost supuse unui test de toleranță la glucoză (GTT), iar studiile imunologice au fost efectuate la o săptămână după aceea. Într-un alt experiment care utilizează șoareci DEREG C57BL/6 (epuizare în celule T reglatoare) [25,26], grupuri de șoareci au fost plasați pe dieta HF pentru o perioadă de 14 săptămâni. Între săptămânile 8 și 10 și 12 și 14, grupurile au primit fie injecții intraperitoneale zilnice de LsAg (2 μg/șoarece), fie PBS. După administrarea finală a LsAg, șoarecii au fost monitorizați pentru toleranță la glucoză.

Test GTT și de toleranță la insulină

După 6 ore de post, șoarecii au fost injectați i.p. cu 2 g soluție de glucoză pe kilogram de greutate corporală. Nivelurile de glucoză din sânge au fost măsurate din sângele venei cozii folosind un glucometru (Accu-Check Advantage; Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germania) imediat înainte și la 15, 30, 60, 90 și 120 de minute după injectarea glucozei. Zona de sub curbă (AUC) a fost obținută prin calcularea ariei dintre axa x și o curbă dată utilizând software-ul GraphPad Prism (versiunea 5.03; GraphPad Software, San Diego, California, SUA). După cum s-a menționat mai sus, într-un experiment separat folosind șoareci DEREG C57BL/6, celulele T Foxp3 + au fost epuizate de două injecții intraperitoneale consecutive de 1 dipg toxină difterică (Merck KGaA, Darmstadt, Germania) cu 3 și 2 zile înainte de GTT (folosind 1,5 g glucoză/kg greutate corporală).

Pentru testul de toleranță la insulină, alimentele au fost îndepărtate imediat înainte de injectarea insulinei. Insulina (1 U/kg greutate corporală) a fost administrată intraperitoneal, iar nivelurile de glucoză din sânge au fost luate imediat înainte și la 15, 30, 60, 90 și 120 de minute după injectarea insulinei.

Izolarea fracției vasculare stromale a țesutului adipos

Izolarea fracției vasculare stromale (SVF) din țesutul adipos a fost efectuată așa cum s-a descris anterior [3]. Pe scurt, tampoanele de grăsime epididimale de la șoarecii masculi hrăniți cu o dietă normală sau cu HF au fost excizate și tocate în DMEM/mediu cu conținut scăzut de glucoză conținând 1 g/l D-glucoză, 4 m ML-glutamină (PAA), 25 m M HEPES Gibco, Life Technologies, Carlsbad, California, SUA), 1% BSA (PAA) și 1% penicilină-streptomicină (PAA). Țesutul tocat a fost ulterior tratat cu mediu care conține 1,5 mg/ml colagenază-P (Roche) timp de 20 de minute la 37 ° C. După centrifugare, adipocitele plutitoare au fost aruncate cu supernatantul, iar peleta SVF a fost resuspendată în 1 × tampon de liză a celulelor roșii din sânge (eBioscience, San Diego, California, SUA). După o etapă de spălare, celulele au fost blocate pentru analiza FACS prin incubare cu anti-CD16/anti-CD32 (BD Biosciences, Heidelberg, Germania) în 1 × Ca 2+ - și soluție salină tamponată cu fosfat Dulbecco fără Mg 2+, inclusiv 2 m M EDTA și 1% FCS (PAA) la o concentrație finală de 0,5-1 μg/106 celule timp de 1 oră. Suspensia celulară a fost filtrată ulterior printr-un filtru de 100 μm.

Citometrie în flux

Analiza markerului de suprafață celulară a fost efectuată utilizând citometrie în flux. Pe scurt, markerii de suprafață celulară au fost colorați timp de 30 de minute la 4 ° C cu șobolan anti-șoarece F4/80 PerCP-Cy5.5, CD4 FITC, CD11c APC, CD19 PE, CD23 FITC, CD5 PE-Cy-7, Gr1 PerCp- Cy5.5 (toate eBioscience) și Siglec-F PE (BD Bioscience). Pentru colorarea intracelulară, celulele au fost fixate cu tampon de fixare/permeabilizare (eBioscience) peste noapte, spălate și blocate în PBS conținând 1% BSA (PAA) și imunoglobulină de șobolan (1 μg/ml; Sigma, St. Louis, Mo., SUA). Pentru colorarea RELMα, celulele fixe au fost incubate în tampon de permeabilizare (eBioscience) și colorate cu iepure anti-șoarece RELMα (Peprotech, Rocky Hill, N.J., SUA). După o etapă de spălare, celulele au fost colorate ulterior cu un anticorp secundar (capră anti-iepure Alexa 488; Invitrogen, Carlsbad, California, SUA). Celulele T de reglementare de la șoareci non-DEREG au fost analizate după fixare peste noapte și permeabilizare și colorare cu CD4 FITC și Foxp3 PE (eBioscience). Celulele T Foxp3 + de la șoareci DEREG au fost identificate prin nivelurile lor de expresie ale egfp care se află în cadrul promotorului Foxp3 [25].

Pentru a identifica ILC de tip 2 (ILC2), celulele SVF izolate au fost resuspendate în tampon FACS și receptorii Fc au fost blocați folosind IgG de șobolan înainte de colorare cu anticorpi monoclonali. ILC2 au fost caracterizate ca Sca-1 + KLRG-1 + și descendenți negativi. Ca markeri de linie, s-au folosit următorii anticorpi: CD4 conjugat PerCP, CD8, CD5 și F4/80 (linia 1), precum și CD11c conjugat APC, FcεR1α, CD49b, Ly6C și CD19 (linia 2).

Cifrele suplimentare online (pentru toate materialele furnizate online, vezi www.karger.com/doi/10.1159/000448401) prezintă strategiile de gating utilizate pentru identificarea AAM și CAM (supl. Online Fig. 1), eozinofile și celulele CD4 + T ( online) supl. fig. 2), subpopulații de celule B (supl. online fig. 3), celule T reglatoare (supl. online fig. 4), precum și ILC2 (supl. online fig. 5). Datele au fost achiziționate folosind un BD FACS Canto și analizate cu software-ul BD FACS DIVA (BD Bioscience).

Măsurători ale anticorpilor

Nivelurile de IgG2a au fost măsurate prin ELISA conform protocolului producătorului. Wells (Nunc, Roskilde, Danemarca) au fost acoperite cu 2 µg/ml anticorp primar IgG2a (BD Pharmingen, San Diego, SUA) în tampon de acoperire [0,1 M Na2HPO4 (Merck) în apă distilată, pH 7,0] peste noapte la 4 ° C. Pentru blocare, plăcile ELISA au fost incubate cu PBS/1% BSA timp de minimum 2 ore la temperatura camerei și ulterior au fost spălate cu 1 × PBS și 0,05% Tween 20 (Sigma-Aldrich); 50 g de ser diluat 1: 2.000 au fost adăugați la godeuri și incubați la 4 ° C peste noapte. După o etapă de spălare, detectarea anticorpilor a fost adăugată timp de 2 ore. După o altă etapă de spălare, s-a adăugat peroxidază de hrean-streptavidină (sisteme R&D) timp de 30 de minute. După spălare, s-a adăugat TMB (tetrametilenebenzidină) (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germania) și s-a incubat timp de 20 min la temperatura camerei. Ulterior, reacția de culoare a fost oprită cu H2SO4 1 M (Merck), densitatea optică a fost măsurată la 450 nm folosind cititorul de microplacă SpectraMAX 340 și datele au fost analizate folosind software-ul SoftMax Pro (ambele dispozitive moleculare, Sunnyvale, California, SUA).

Măsurarea anticorpilor specifici LsAg a fost efectuată analog măsurării nivelurilor totale de IgG2a, cu excepția faptului că plăcile au fost acoperite cu 10 µg/ml LsAg peste noapte la 4 ° C și anticorpi secundari împotriva IgG2a/b de șoarece (diluție serică 1: 100) precum și IgG1 (1: 10.000 diluție serică) (BD Biosciences).

Colorarea histologică a țesutului adipos

Țesutul adipos epididimal (EAT) a fost fixat în paraformaldehidă 4% (Otto Fischar GmbH, Saarbrücken, Germania) timp de cel puțin 24 de ore. După fixare, țesutul a fost deshidratat cu etanol și apoi încorporat în parafină pentru tăiere. Colorarea hematoxilinei-eozinei a fost efectuată urmând proceduri standard.

Izolarea ARN și PCR cantitativă în timp real

Au fost colectate aproximativ 30 mg de grăsimi epididimale, congelate rapid în azot lichid și depozitate la -80 ° C până la izolarea ARN. Țesutul adipos înghețat a fost omogenizat în tuburi de liza innuSPEED W (Analytic-Jena, Jena, Germania) inclusiv TRIzol (Invitrogen) folosind un omogenizator Precellys (BERTIN Corp., Rockville, Md., SUA) timp de 10 s (6.000 rpm). ARN-ul a fost apoi extras cu mini kit-ul RNeasy (Qiagen, Hilden, Germania). Concentrația de ARN a fost cuantificată de NanoVue (GE Healthcare Lifesciences, Chalfont St Giles, Marea Britanie). ARN-ul total a fost transcris invers cu un kit Omniscript RT (Qiagen) conform instrucțiunilor producătorului cu primeri oligo-d (T) (Roche). PCR cantitativă în timp real a fost efectuată utilizând un cicler Rotorgene (Qiagen). Pentru cuantificarea relativă a expresiei genice, a fost aplicată metoda (ΔΔCt). Următoarele secvențe au fost următoarele: arginaza 1: înainte - CCTATGTGTCATTTGGGTGGA, invers - CAGGAGAAAGGACACAGGTTG; Foxp3: înainte - TCTTGCCAAGCTGGAAGACT, invers - GGGGTTCAAGGAAGAAGAGG; IL-10: înainte - GGTTGCCAAGCCTTATCGGA, invers - ACCTGCTCCACTGCCTTGCT; GATA3: înainte - GTCATCCCTGAGCCACATCT, invers - AGGGCTCTGCCTCTCTAACC și β-actină: înainte - AGAGGGAAATCGTGCGTGAC, invers - CAATAGTGATGACCTGGCGGT.

Tablou PCR

ARN-ul din EAT a fost digerat cu DNAse (Ambion, Carlsbad, California, SUA). Integritatea ARN-ului și calitatea ARN-ului au fost analizate utilizând sistemul de electroforeză pe gel Experion și cipurile ARN StdSens (Bio-Rad, Hercules, California, SUA). Sinteza ADNc a fost efectuată cu RT 2 PreAMP cADN Synthesis Kit (Qiagen). Amplificarea PCR a fost efectuată în conformitate cu protocoalele SABioscience în formate de disc de 100 de godeuri ale matricei PCR de rezistență la insulină de șoarece (PAMM-156Z) (Qiagen). Expresia genică a fost normalizată la gene de menaj (B2m și Gapdh) și datele matricei PCR au fost analizate folosind analiza datelor matricei RTR Profiler RT 2 (versiunea 3.5) de la SABioscience. O listă completă a genelor incluse în matricea PCR este furnizată în tabelul suplimentar 1 online.

Statistici

Datele au fost testate pentru semnificația statistică utilizând software-ul GraphPad Prism (versiunea 5.03; GraphPad Software, San Diego, California, SUA). Testul Mann-Whitney U a fost aplicat pentru a testa diferențele dintre două grupuri nepereche cu distribuție nonparametrică pentru semnificație statistică. Datele care au fost distribuite în mod normal au fost testate pentru semnificația statistică folosind testul t nepereche pentru comparații a două grupuri sau testul ANOVA urmat de testul de comparație multiplă Newman-Keuls pentru a compara mai mult de două grupuri. Valorile valorilor p -ΔΔC t pentru fiecare genă din grupul martor și grupul de tratament și valorile p 6; control: 5,82 × 10 4), macrofage RELMα +L.s.Stk #: 6,31 × 10 5; control: 1,53 × 105) și celule T CD4 +L.s.Stk #: 2.67 × 10 5; martor: 2,77 × 10 4), în timp ce nu s-au observat diferențe în numărul de macrofageL.s.Stk #: 2,38 × 10 6; control: 1,37 × 106) sau neutrofileL.s.Stk #: 6,94 × 10 4; control: 2,78 × 10 4) (fig. 2b).

FIG. 2
FIG. 5

Administrarea LsAg crește frecvența eozinofilelor și AAM în cadrul EAT. A Numărul total de celule (n) în SVF al EAT și numărul absolut de eozinofile, macrofage, macrofage RELMα + (AAM), macrofage care exprimă CD11c (CAM), celule T CD4 +, celule T CD4 + Foxp3 + și ILC2 din SVF din EAT. b Frecvența eozinofilelor, macrofagelor, celulelor T CD4 + și ILC2 în cadrul SVF al EAT. c Frecvențele macrofagelor care exprimă CD11c (CAM) sau RELMα (AAM) în cadrul SVF al EAT. d Frecvențele celulelor T care exprimă Foxp3. e Frecvența celulelor T CD4 + Foxp3 + din celulele totale din EAT. a-e Date reprezentative pentru 1 din 2 experimente independente cu cel puțin n = 5 animale/grup (experiment unic pentru ILC2). Mijloace + SD. * p 1.3 sunt prezentate în figura 6, iar lista completă a genelor, inclusiv valorile p și modificările ori sunt date în tabelul suplimentar 1 online.

FIG. 6

Grafic vulcanic reprezentând date despre expresia genelor din probe EAT individuale de șoareci DIO care au fost tratați cu LsAg (n = 10) și comparate cu controalele DIO tratate cu PBS (n = 8). Axa x reprezintă modificarea pliului, în timp ce axa y reprezintă valoarea p pentru semnificația statistică (ca -log10). Linia orizontală mijlocie indică p = 0,05 cu genele enumerate deasupra liniei având p 1,3, cercurile din cadranul inferior stâng indică gene care au o schimbare de pliuri, $ Diferențe semnificative statistic între șoarecii WT tratați cu LsAg și șoarecii DEREG DIO în comparație cu Controalele PBS WT PART, respectiv. * p