Pixu Liu și Huijun Sun.

protejează

Institutul de celule stem canceroase, Universitatea Medicală Dalian

Dalian, 116044 (China)

E-mail [email protected], [email protected]

Articole similare pentru „”

  • Facebook
  • Leziuni induse de 2O2 și inhibă ateroscleroza la șoarecii knock-out receptori de lipoproteine ​​cu densitate scăzută ovariectomizate - https://www.karger.com/Article/FullText/491537 @KargerPublisher "target =" _ blank "onclick =" javascript: window.open (this.href, '', 'menubar = no, toolbar = no, resizable = yes, scrollbars = yes, height = 400, width = 600'); return false; "title =" Tweet This Page "onclick =" ga 'trimite', 'eveniment', 'FullText', 'Social Media', 'Fix Twitter'); "> Stare de nervozitate
  • LinkedIn
  • Leziuni induse de 2O2 și inhibă ateroscleroza la șoareci knock-out cu receptor de lipoproteine ​​cu densitate scăzută ovariectomizată% 0A% 0A https://www.karger.com/Article/FullText/491537 "onclick =" ga ('send', 'event', 'FullText', 'Social Media', 'Fix Email'); "> E-mail

Abstract

Introducere

În ciuda progreselor terapeutice considerabile din ultimele decenii, ateroscleroza rămâne principala cauză de deces la nivel mondial, în special în rândul femeilor aflate în postmenopauză [1, 2]. În comparație cu femeile aflate în premenopauză, femeile aflate în postmenopauză au o incidență mai mare a bolilor cardiovasculare datorită pierderii capacității de reacție la estrogenul intern sau chiar extern [3]. S-a postulat că deficiența de estrogen contribuie la morbiditatea ridicată a aterosclerozei la femeile aflate în postmenopauză printr-un rol în numeroase procese aterogene, incluzând inflamația [4, 5], proliferarea celulară a mușchiului neted vascular [6], generarea de specii reactive de oxigen (ROS) [7] și apoptoza celulelor endoteliale vasculare [8]. Unele studii au demonstrat că terapia de substituție hormonală (HRT) poate reduce riscul bolilor cardiovasculare la femeile aflate în postmenopauză, dar numai atunci când terapia este inițiată în stadiile incipiente după menopauză [9-12].

Multe studii au arătat că inflamația și stresul oxidativ joacă un rol central în progresia aterosclerozei [2, 13, 14]. S-a raportat că stresul oxidativ, ca rezultat al generării excesive de ROS intracelulare, incluzând radicalii hidroxilici (OH -), peroxidul de hidrogen (H2O2) și anionul superoxid (O2 -), joacă un rol cheie în dezvoltarea și progresia aterosclerozei prin promovând disfuncția endotelială, inflamația și peroxidarea lipidelor [15, 16]. Familia de enzime NADPH oxidază (Nox) și subunitățile lor de reglare, inclusiv p22phox, p47phox, Noxa1 și p67phox, sunt surse importante de ROS în vasculatura declanșată de stres, hormoni și agenți vasoactivi. S-a raportat că ROS activează NF-κB [17], care joacă un rol cheie în diferite răspunsuri inflamatorii și imune și este legat de dezvoltarea aterosclerozei [18]. În plus, s-a demonstrat că NF-κB este implicat în reglarea transcripțională a expresiei subunității Nox [19, 20]. Prin urmare, agenții farmacologici care ar putea atenua inflamația și stresul oxidativ prin întreruperea căii NF-κB ar trebui să aibă efecte anti-aterogene.

Estrogenul este implicat direct sau indirect în reglarea răspunsurilor imune, proliferării celulare, inflamației și aderenței celulare [18]. S-a demonstrat că semnalizarea estrogenului reduce dezvoltarea aterosclerozei prin efecte non-genomice rapide și/sau calea clasică prin legarea la receptorii de estrogen (ERα și ERβ) [21-23]. Estrogenul are, de asemenea, proprietăți antioxidante prin inhibarea expresiei Nox și generarea de anion O2 - superoxid [24]. Mai mult, estrogenul își exercită efectele ateroprotectoare legându-se de receptorii săi pentru a genera monoxid de azot în celulele endoteliale, care tinde să aibă o funcție de protecție asupra vaselor de sânge [25-27]. Din păcate, nivelurile de expresie ale receptorilor de estrogen scad în timpul stadiului târziu al menopauzei. Ca urmare, suplimentarea cu estrogen în această etapă nu poate inversa riscul de ateroscleroză [28, 29]. Prin urmare, un agent farmacologic care ar putea promova nivelul receptorilor de estrogen ar aduce beneficii femeilor aflate în postmenopauză prin protejarea împotriva aterosclerozei.

Acidul alfa-lipoic (ALA), cunoscut și sub numele de acid 1,2-ditiolan-3-pentanoic, acid 1,2-ditiolan-3-valeric sau acid tioctic, a fost raportat ca fiind un puternic antioxidant care poate elimina ROS intracelular [30-32]. Mai multe linii de dovezi au arătat că ALA are efecte antiinflamatorii și anti-obezitate împotriva procesului patologic al aterosclerozei [33-35]. Cu toate acestea, mecanismele funcției protectoare ale ALA și efectele sale asupra dezvoltării aterosclerozei postmenopauzale rămân necunoscute.

Materiale și metode

Materiale

Celulele endoteliale aortice umane (HAEC) au fost obținute de la Institutul de Biochimie și Biologie Celulară, Academia Chineză de Științe (Shanghai, China). Mediul de cultură celulară (DMEM, RPMI-1640) și serul bovin fetal (FBS) au fost achiziționate de la Gibco-BRL Co. (Gaithersburg, MD, SUA). ALA (la o puritate de> 99,5%) a fost achiziționată de la Fushilai Medicine & Chemical Co., Ltd. (Changshu, China). Sonda fluorescentă DCFH-DA a fost achiziționată de la Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, China). Kituri de testare a extractului de proteine ​​au fost obținute de la KeyGEN Biotechnology (Nanjing, China). Anticorpii specifici pentru Bcl-2, caspaza-3, ERα, ERβ, ICAM-1, VCAM-1, IκBα, p65 fosforilat (p-p65) și Nox4 au fost obținuți de la Proteintech Group (Wuhan, China) și anticorpi specifici pentru p65, vinculin au fost achiziționate de la Bioworld Technology (Nanjing, China). Inhibitorul NF-PDB PDTC a fost obținut de la Beyotime (Jiangsu, China), iar inhibitorul Nox4 DPI și inhibitorul receptorului de estrogen ICI182, 780 au fost achiziționați de la Sigma (St. Louis, MO, SUA).

Cultură celulară și tratament cu H2O2

HAEC au fost cultivate în DMEM conținând 10% FBS la 37 ° C și 5% CO2. După atingerea confluenței de 60%, HAEC-urile au fost tratate cu concentrații diferite de ALA (75, 150, 300μM) timp de 24 de ore înainte de tratamentul cu H2O2 (1 mM) timp de 4 ore. ALA a fost dizolvat în dimetil sulfoxid.

Analiza Western blot

Colorarea imunofluorescentă

La momentele de diferențiere indicate, celulele cultivate au fost spălate cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) de două ori și fixate cu paraformaldehidă/PBS 4% timp de 10 minute la temperatura camerei. Apoi, celulele au fost permeabilizate cu 0,5% Triton-X/PBS timp de 10 min. După spălare cu PBS, celulele au fost blocate cu 2% ser albumină bovină și incubate peste noapte la 4˚C cu anticorpi primari, inclusiv ERα (Proteintech Group, diluție 1:50) și p65 (Bioworld Technology, 1:50 diluție). Anticorpii secundari, inclusiv IgG anti-iepure conjugat Alexa Fluor 488 (capră, 1: 100, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) au fost utilizați conform instrucțiunilor producătorului. Probele au fost incubate la temperatura camerei timp de 1 oră. După spălare cu PBS și contracolorare cu DAPI, probele au fost montate cu soluție antifade Prolong Gold (Thermo Fisher Scientific). Celulele au fost vizualizate și fotomicrografiile au fost obținute utilizând un microscop vertical cu fluorescență (Olympus, Center Valley, PA, SUA). Cuantificarea intensității fluorescenței a fost efectuată folosind ImageJ. Au fost măsurate cel puțin 50 de celule din trei zone diferite pe cameră.

Analiza biochimică a HAEC și a serului

Am folosit un kit de testare colorimetrică (Beyotime, Nanjing, China) pentru a măsura dehidrogenaza lactică (LDH), malondialdehidă (MDA), superoxid dismutază (SOD) și eliberarea L-glutationului (GSH). HAEC-urile au fost cultivate în plăci cu 6 godeuri la o densitate de 1x105 per godeu și tratate cu diferite concentrații de ALA (75, 150, 300μM) timp de 24 de ore înainte de stimularea cu H2O2 (1mM) timp de 4 ore.

Biomarkerii stresului oxidativ și antioxidanții din ser, inclusiv LDH, MDA, SOD și GSH, au fost detectați folosind kiturile de testare menționate mai sus. Biomarkerii metabolismului lipidic în ser, inclusiv colesterolul total (CHO), trigliceridele (TG), colesterolul lipoproteinelor cu densitate ridicată (HDL-C) și colesterolul lipoproteinelor cu densitate mică (LDL-C), au fost măsurați folosind seturi de testare (Beyotime, Nanjing, China).

Test de adeziune monocitară

Celulele THP-1 (o linie celulară de leucemie monocitară acută umană) au fost marcate cu sonda fluorescentă BCECF-AM (Beyotime, Jiangsu, China) apoi incubate cu HAEC confluente timp de 1 oră la 37oC. Celulele THP-1 neaderente au fost îndepărtate ușor cu PBS. Imagini ale celulei THP-1 aderente au fost obținute folosind microscopia cu fluorescență (Olympus; mărire x100).

Măsurarea ROS intracelulară

Nivelul ROS a fost detectat utilizând sonda fluorescentă, diacetat de 2, 7-diclorofluoresceină (DCFH-DA). O concentrație finală de 10 μM DCFH-DA a fost adăugată la HAEC și celulele au fost spălate de două ori cu mediu fără ser și apoi incubate timp de 20 de minute la 37 ° C în întuneric. Nivelurile relative de fluorescență au fost cuantificate folosind un citometru de flux FACScalibur (Becton, Dickinson și Compania, Franklin Lakes, NJ, SUA).

Colorarea TUNELULUI

Apoptoza celulară din plăci a fost examinată folosind TUNEL ApopTag Fluorescein in Situ Apoptosis Detection Kit (Biotool, Houston, TX, SUA). Criosecțiile proaspăt tăiate au fost fixate cu paraformaldehidă 1% în PBS timp de 10 min la temperatura camerei, clătite cu PBS și permeabilizate cu un amestec de etanol și acid acetic (2: 1) timp de 5 minute la -20 ° C. Diapozitivele au fost incubate cu tampon de reacție conținând enzima TdT timp de 1 oră la 37 ° C într-o cameră umidificată și apoi incubate cu un anticorp anti-digoxigenină conjugat FITC timp de 30 de minute la temperatura camerei. În cele din urmă, lamele au fost montate într-un mediu DAPI/antifade. Diapozitivele au fost observate și fotografiate cu un microscop de fluorescență Olympus BX61.

Histologie și imunohistochimie

Secțiuni succesive au fost colectate pe același diapozitiv și au fost examinate cel puțin 15 diapozitive de la 5 aorte toracice consecutive de șoarece pe zonă per șoarece. Aortele au fost disecate și separate de țesutul gras. După colorarea cu ulei-roșu-O, am folosit analiza Image-Pro Plus pentru a măsura proporția depunerii de lipide. Aortele de șoareci au fost fixate în 10% formalină, încorporate în parafină și secționate (5 μm grosime). Secțiunile au fost tratate cu xilen pentru a îndepărta parafina și au fost rehidratate, incubate cu 3% H2O2 timp de 10 minute și apoi spălate de trei ori cu PBS. Apoi, secțiunile au fost blocate cu ser timp de 30 de minute și incubate cu anticorpi primari peste noapte împotriva Nox4 (Proteintech Group, diluție 1: 100), p-p65 (Proteintech Group, diluție 1: 100), ICAM-1 (Proteintech Group, 1: 50 diluție), VCAM-1 (Proteintech Group, 1:50 diluție) și CD68 (Abcam, Cambridge, MA, SUA diluție 1: 200). Imaginile au fost capturate folosind Leica Microsystems.

Colorarea elastinei

Elastina din peretele arterial murin a fost colorată folosind metoda de colorare a aldehidei-fucsinei Gomrori, cu un kit de colorare a fibrelor elastice (Maixin Bio, Fuzhou, China). Pe scurt, după deparafinare și rehidratare, secțiunile au fost incubate timp de 5 minute în soluție de iod Lugol, spălate cu PBS și incubate cu tiosulfat de sodiu timp de 5 minute. După spălare cu PBS și 70% etanol, secțiunile au fost incubate cu aldehidefucsină timp de 10 min și acid portocaliu G timp de câteva secunde.

Animale și design experimental

analize statistice

FIG. 1.

ALA a inversat ateroscleroza indusă de OVX și HFD. La sfârșitul tratamentului de 16 săptămâni, șoarecii au fost postiti peste noapte și sacrificați, aortele au fost disecate și separate de țesutul gras. (A) Efectul ALA asupra greutății corporale a șoarecilor. ** P # P ## P -/- model animal. Am constatat că OVX și HFD au suprimat nivelurile de activitate SOD și GSH, ridicând în același timp nivelurile de LDH și MDA în Ldlr -/- șoareci, sugerând menopauză și un HFD au contribuit la stresul oxidativ. De remarcat, tratamentul ALA a scăzut semnificativ nivelurile de biomarkeri ai stresului oxidativ, dar a îmbunătățit nivelul enzimelor antioxidante din serul șoarecelui (Fig. 2E-H). Luate împreună, datele noastre indică faptul că administrarea ALA a împiedicat dezvoltarea aterosclerozei prin inhibarea hiperlipidemiei și a stresului oxidativ în HFD/OVX Ldlr -/- șoareci.

ALA a reglat expresia receptorilor de estrogen la șoarecii OVX

ER pot activa mai multe kinaze celulare prin inducerea unei cascade de semnalizare non-nucleară „rapidă” independent de estrogen [36]. Am constatat că nivelurile de proteine ​​ale ERα și ERβ au fost semnificativ îmbunătățite după tratamentul cu ALA într-o manieră dependentă de doză și timp (Fig. 3A-C). Apoi am confirmat această observație cu un test imunofluorescent, în care ALA a inversat reglarea descendentă a expresiei ERα indusă de tratamentul cu H2O2 (Fig. 3D). Pentru a valida în continuare constatările noastre, am examinat expresia ER în Ldlr -/- șoareci. Am constatat că expresia ERα și ERβ a scăzut semnificativ în HFD/OVX Ldlr -/- șoareci. Cu toate acestea, tratamentul cu ALA a crescut semnificativ expresia receptorilor de estrogen într-o manieră dependentă de doză, ceea ce este în concordanță cu al nostru in vitro constatări (Fig. 3E-F). Aceste rezultate sugerează că ALA poate regla în sus expresia ERα și ERβ care a fost diminuată în timpul dezvoltării aterosclerozei.

FIG. 3.
FIG. 4.
FIG. 7.

ALA a protejat HAEC împotriva leziunilor oxidative în prezența H2O2.

LDH este o enzimă stabilă prezentă în mod normal în citosolul majorității celulelor eucariote, dar se eliberează rapid în supernatant la moartea celulei din cauza deteriorării membranei plasmatice [45]. Am constatat că tratamentul cu ALA a inhibat în mod semnificativ activitatea LDH a HAEC indusă de stimularea H2O2 (Fig. 8A). Pentru a evalua în continuare efectele antioxidante ale ALA, am măsurat nivelurile de MDA, SOD și GSH în HAEC ca răspuns la stimularea H2O2. Am arătat că tratamentul cu ALA a suprimat semnificativ nivelurile de MDA în timp ce a crescut activitatea SOD și nivelurile de GSH în HAEC în timpul leziunii oxidative (Fig. 8B-D). Luate împreună, constatările noastre sugerează că ALA a oferit protecție și prevenire antioxidantă împotriva morții celulelor endoteliale cauzate de daune oxidative.

FIG. 8.

ALA a protejat HAEC împotriva leziunilor oxidative în absența H2O2. HAEC-urile au fost cultivate în plăci cu 6 godeuri la o densitate de 1X105 per godeu și tratate cu diferite concentrații de ALA (75, 150, 300μM) timp de 24 de ore înainte de stimularea cu H2O2 (1mM) timp de 4 ore. Am folosit un kit de testare colorimetrică pentru a măsura eliberarea LDH, MDA, SOD și GSH. Activitate ALA LDH (A), nivel MDA (B), reglementat în jos, dar activitate SOD (C) și nivel GSH în HAEC. Toate experimentele au fost efectuate independent de trei ori. ## P -/- șoareci. Ca atare, unul dintre mecanismele moleculare responsabile de efectele ateroprotectoare ale ALA implică probabil reprimarea căii apoptotice celulare în timpul patogeniei aterosclerozei.

ICAM-1 și VCAM-1 sunt molecule de adeziune endotelială care joacă un rol cheie în acumularea/aderența monocitelor la endoteliu și sunt importante în toate etapele aterogenezei. Aici, am arătat în mod clar că ALA a suprimat expresia ICAM-1 și VCAM-1 ambele in vivo și in vitro, ceea ce înseamnă că ALA ar putea perturba unul dintre elementele cheie în fiziopatologia bolii aterosclerotice, aderența monocitelor, prin inhibarea expresiei ICAM-1 și VCAM-1.

Un corp semnificativ de dovezi a arătat că femeile aflate în postmenopauză au o incidență mai mare a aterosclerozei decât femeile aflate în premenopauză [3]. Dintre speculațiile și ipotezele multiple, se consideră că estradiolul joacă un rol central [3]. În studiul de față, am arătat că tratamentul cu ALA a reglat nivelul proteic al ambilor receptori de estrogen in vivo și in vitro. De asemenea, am arătat că stimularea H2O2 a reglat în jos atât expresia ERα, cât și ERβ în HAEC. Între timp, expresiile ER au fost scăzute în țesutul patologic aterosclerotic indus de HFD și/sau OVX. Rezultatele noastre sunt în concordanță cu lucrările anterioare care arată că expresiile ER sunt modulate de stresul oxidativ și inflamația bolilor cardiovasculare [62]. Foarte important, am constatat că tratamentul cu ALA nivelurile de proteine ​​ale receptorilor de estrogen în mod semnificativ reglate în sus in vivo și in vitro, sugerând că ALA exercită efecte ateroprotectoare, cel puțin parțial, prin promovarea expresiei receptorilor de estrogen.

S-a raportat anterior că NF-κB și Nox4 reglează împreună expresia angiotensinogenului indus de sulfat de indoxil în celulele tubulare proximale [63]. În prezentul studiu, supraexpresia Nox4 indusă de H2O2 a fost reglată în jos de inhibitorul NTC-κB PDTC, sugerând că activarea NF-κB a ridicat expresia Nox4. Modificările p-p65 induse de H2O2 au fost inversate de inhibitorul Nox4 DPI, indicând faptul că Nox4 a promovat activarea NF-κB. Expresia scăzută a ERα și ERβ indusă de H2O2 a fost restaurată de PDTC și DPI, sugerând că Nox4 și NF-κB inhibă expresia ER. Luate împreună, Nox4 și NF-κB vor coopera probabil pentru a inhiba expresia receptorilor de estrogen și pentru a promova în comun dezvoltarea aterosclerozei. ALA poate elimina un astfel de efect inhibitor prin reglarea în sus a expresiei ER, activând în consecință mai multe kinaze celulare prin inducerea unei cascade de semnalizare „rapidă” non-nucleară independentă de estrogen.

Pe scurt, descoperirile noastre sugerează că receptorii de estrogen „comunică” cu NF-κB și Nox4 sub formă de reținere reciprocă pentru a participa la reglementarea inițierii și dezvoltării aterosclerozei. ALA, un puternic antioxidant natural care poate îmbunătăți expresia receptorilor de estrogen și inhiba activarea semnalizării NF-κB, poate fi valorificat ca potențial candidat terapeutic pentru tratarea aterosclerozei la femeile aflate în postmenopauză.

Mulțumiri

Acest studiu a fost susținut parțial de Grantul de la Fundația Națională pentru Științe Naturale din China (nr. 81372853 și nr. 81572586 către Pixu Liu; nr. 81273508 către Huijun Sun; nr. 81600037 către Tingting Shen); Programul de sprijinire a cercetătorilor provinciali de alpinism Liaoning din China (2012, către Pixu Liu).

Declarație de divulgare

Autorii declară că nu au interese financiare sau comerciale concurente care ar putea duce la un conflict de interese.