Pathum Dhanapala
1 Laborator de Cercetare Neuro-Alergică (NARL), Școala de Științe ale Vieții și Mediului, Facultatea de Științe, Inginerie și Mediu Construit, Universitatea Deakin, 75 Pigdons Road, Geelong 3216 VIC, Australia; ua.ude.nikaed@muhtapd sau ude.dravrah.hwb@alapanahdp (P.D.); ua.ude.nikaed@ahtiwa (D.W.-D.)
2 Laborator australian de sănătate animală (AAHL), Biosecurity Flagship, Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization (CSIRO), 5 Portarlington Road, East Geelong 3219 VIC, Australia; [email protected]
3 Păsări CRC, P.O. Box U242, Universitatea din New England, Armidale 2351 NSW, Australia
4 Departamentul de Chirurgie Ortopedică, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, 60 Fenwood Road, Boston, 02115 MA, SUA
Dulashi Withanage-Dona
1 Laborator de Cercetare Neuro-Alergică (NARL), Școala de Științe ale Vieții și Mediului, Facultatea de Științe, Inginerie și Mediu Construit, Universitatea Deakin, 75 Pigdons Road, Geelong 3216 VIC, Australia; ua.ude.nikaed@muhtapd sau ude.dravrah.hwb@alapanahdp (P.D.); ua.ude.nikaed@ahtiwa (D.W.-D.)
Mimi L. K. Tang
5 Departamentul de Alergie și Imunologie, Royal Children's Hospital, 50 Flemington Road, Parkville 3052 VIC, Australia; [email protected]
6 Alergii și tulburări imune, Institutul de cercetare pentru copii Murdoch, 50 Flemington Road, Parkville 3052 VIC, Australia
7 Universitatea din Melbourne, Parkville 3010 VIC, Australia
Tim Doran
2 Laborator australian de sănătate animală (AAHL), Biosecurity Flagship, Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization (CSIRO), 5 Portarlington Road, East Geelong 3219 VIC, Australia; [email protected]
3 Păsări CRC, P.O. Box U242, Universitatea din New England, Armidale 2351 NSW, Australia
Cenk Suphioglu
1 Laborator de Cercetare Neuro-Alergică (NARL), Școala de Științe ale Vieții și Mediului, Facultatea de Științe, Inginerie și Mediu Construit, Universitatea Deakin, 75 Pigdons Road, Geelong 3216 VIC, Australia; ua.ude.nikaed@muhtapd sau ude.dravrah.hwb@alapanahdp (P.D.); ua.ude.nikaed@ahtiwa (D.W.-D.)
3 Păsări CRC, P.O. Box U242, Universitatea din New England, Armidale 2351 NSW, Australia
Abstract
1. Introducere
Producția de Gal d 1 hipoalergenică poate fi realizată prin utilizarea mutagenezei ca instrument în două strategii diferite: prima este prin mutarea secvențelor epitopilor de legare IgE și a doua este prin țintirea structurii secundare a proteinelor. Drew și colab. (2004) [19] au produs cu succes o variantă hipoalergenică a alergenului principal la latex Hev b 6.10 prin întreruperea legăturilor cisteină-cisteină a proteinei pentru a reduce reactivitatea IgE. În acest studiu, am produs cu succes o variantă hipoalergenică a Gal d 1, vizând doar două dintre cele nouă punți cisteină-cisteină folosind mutageneză direcționată la fața locului.
2. Metode
2.1. Mutageneza dirijată de site a lui Gal d 1
Secvența de nucleotide și aminoacizi a lui Gal d 1. Reziduurile pătrate de cisteină (C) la pozițiile C192 și C210 sunt reziduurile vizate. Acestea au fost înlocuite cu alanină prin mutarea nucleotidelor la GCC.
Structura secundară a lui Gal d 1 care arată numărul total de punți de cisteină. Cele două săgeți arată cele două punți de cisteină care ar fi distruse de mutațiile prezentate în Figura 1. Figura adaptată din: Kato și colab., 1987 [1].
tabelul 1
Componentele amestecului principal al reacției în lanț polimerază mutagenă (PCR).
| 10 × QuickChange Lightning Multi tampon de reacție | 2.5 |
| Apă dublu distilată | 15.5 |
| Șablon ADN | 1 (50 ng) |
| Primeri mutageni | 1 din fiecare grund (100 ng din fiecare grund) |
| Amestec de trifosfat deoxi-nucleozidic (dNTP) | 1 |
| QuickChange Lightning Multi amestec enzimatic | 1 |
| Total | 25 |
masa 2
Condiții PCR mutagene.
| 1 | 1 | 95 ° C | 2 min |
| 2 | 30 | 95 ° C | 20 s |
| 55 ° C | 30 s | ||
| 65 ° C | 3 min (30 s/kb lungime plasmidă) | ||
| 3 | 1 | 65 ° C | 5 |
2.2. Transformarea chimică în E. coli
2.3. Expresia în timp a cursului Gal d 1 mutant pentru a determina timpul optim de expresie
O singură colonie de mutant Gal d1 a fost crescută peste noapte în mediu LB cu 50 pg/ml ampicilină. Cultura peste noapte a fost apoi subcultivată în 10 ml de mediu LB proaspăt și crescută până la faza mediană a logului (OD600 0,4-0,6). O probă de 1 ml de celule a fost peletizată pentru a fi utilizată ca control neexprimat (0 h) al expresiei în timp. Expresia a fost apoi indusă cu 40 uL de IPTG și celulele au fost incubate timp de 6 ore la 37 ° C cu agitare la 250 rpm. O probă de 1 ml a fost colectată la fiecare o oră pentru perioada de 6 ore. Peletele colectate la punctele de timp 0, 2, 4, 5 și 6 au fost lizate folosind 400 de l de reactiv de liza Cell Lytic B (Sigma Aldrich, Natick, MA, SUA) și centrifugate la 13.000 × g timp de 5 minute pentru a separa peleta ( fracția insolubilă) și supernatantul (fracția solubilă). Cele două fracții au fost analizate folosind SDS-PAGE și western blot conform metodelor descrise în Dhanapala și colab. 2015 [20].
2.4. Exprimarea și imunoblotarea Gal d 1 de tip sălbatic și mutant folosind trei anticorpi de detecție diferiți
Gal d 1 de tip sălbatic și mutant au fost exprimate în E. coli până la punctele lor optime de timp, determinate de expresiile de timp (cursul de timp sălbatic Gal d 1 a fost determinat în Dhanapala și colab. 2015 [20]). Celulele au fost peletizate și lizate folosind Cell Lytic B așa cum s-a descris anterior. Fracțiile solubile ale ambelor proteine au fost rulate pe SDS-PAGE în cantități egale (15 uL), împreună cu un marker de greutate moleculară. S-a lăsat o bandă între cele două proteine pentru a evita orice contaminare încrucișată între cele două variante. Gelul SDS a fost apoi transferat pe o membrană de nitroceluloză pentru a fi utilizat pentru Western Blot. Un total de cinci membrane de nitroceluloză au fost preparate în acest fel, dintre care două ar fi utilizate în analiza descrisă în secțiunea 2.5. Trei membrane de nitroceluloză preparate au fost supuse Western blot folosind trei anticorpi diferiți care pot detecta proteina exprimată (de exemplu, anticorp anti-Xpress, anticorp tetra-His și anticorp penta-His).
2.5. Analiza imunologică a tipurilor sălbatice vs. Mutant Gal d 1 Folosind Western Blot
Cele două membrane de nitroceluloză rămase din secțiunea 2.4 au fost utilizate pentru imunoblotare folosind serul pacienților alergici și non-alergici din ouă pentru a testa reactivitatea IgE. Într-un studiu anterior, am folosit o serie de seruri ale pacienților alergici la ouă și o serie de seruri ale pacienților non-alergici pentru analiza imunologică a proteinelor albușului de ou recombinante [20]. În acest studiu am folosit aceleași preparate serice combinate și am incubat o membrană cu seruri de pacienți alergici și cealaltă cu seruri de pacienți non-alergici și am incubat peste noapte la 4 ° C. Bloturile au fost apoi incubate cu IgE anti-uman (fosfatază alcalină conjugată) anticorp secundar produs la capră la o diluție de 1: 1000. Benzile au fost detectate folosind un substrat cromogenic așa cum este utilizat în Western blot descris în secțiunea 2.4.
3. Rezultate
3.1. Mutageneza lui Gal d 1
În urma mutagenezei direcționate la locul modificării C192 și C210, șase clone au fost secvențiate pentru a confirma mutațiile. Cinci din cele șase clone au prezentat o singură mutație. O clonă a avut ambele mutații în locațiile așteptate ale secvenței. Când secvența Gal d 1 de tip sălbatic a fost aliniată cu secvența mutantă Gal d 1 pe NCBI BLAST, s-a văzut că codonii TGC (cisteină) pentru C192 și C210 au fost schimbați în GCC, care la rândul său codifică alanina.
3.2. Expresia în timp a cursului Gal d 1 mutant pentru a determina timpul optim de expresie
Proteina Gal d1 mutantă a fost exprimată în E. coli după inducerea IPTG timp de 6 ore și peletele au fost colectate la fiecare 1 oră, inclusiv una înainte de inducția IPTG. Peletele din punctele de timp 0, 2, 4, 5 și 6 au fost lizate și fracțiile solubile și insolubile au fost analizate folosind SDS-PAGE și Western blot. Rezultatele arată că punctul optim de expresie pentru Gal d 1 mutant este de 5 h (Figura 3 B), comparativ cu 2 h pentru Gal d 1 de tip sălbatic (Figura 3 A) [20]. Se poate vedea, de asemenea, că nivelul de expresie al Gal d 1 mutant a scăzut după 5 ore.
Expresia în timp a mutantului Gal d 1. O expresie în timp a Gal d 1 de tip sălbatic (A) a fost publicat anterior în Dhanapala și colab. 2015 [20]. Mutantul Gal d 1 (B) a fost supus unei expresii în timp pentru a determina timpul și condițiile sale optime de exprimare și a fost comparat cu expresia Gal d 1 de tip sălbatic prezentată în (A).
3.3. Exprimarea și imunoblotarea de tip sălbatic și mutant Gal d 1 folosind trei anticorpi de detectare diferiți
Proteinele Gal d 1 recombinante de tip sălbatic și mutant au fost exprimate în LB până la punctele lor de timp optime respective prin inducție cu IPTG. Proteinele au fost analizate prin SDS-PAGE și Western blot folosind trei anticorpi diferiți (anticorpi anti-Xpress, Tetra-His și Penta-His). SDS-PAGE arată că cantități similare de ambele proteine au fost încărcate pe gel (Figura 4). Western blots arată că a existat o cantitate ușor mai mare de proteină mutantă prezentă pe membrana nitrocelulozei (Figura 4).
Compararea imunoblot a Gal d 1 de tip sălbatic și mutant imobilizat pe nitroceluloză. Trei Western blot au fost efectuate folosind anticorpi specifici His-tag (Tetra-His & Penta-His) și anticorpi anti-Xpress pentru a compara nivelul de expresie al tipului sălbatic și al mutantului (PM7/9) Gal d 1. SDS-PAGE arată profilul proteinelor încărcate.
3.4. Analiza imunologică a tipurilor sălbatice vs. Mutant Gal d 1 Folosind Western Blot
Două membrane de nitroceluloză au fost preparate folosind aceleași probe utilizate pentru pete prezentate în Figura 4. Cele două membrane au fost supuse Western blot folosind serurile pacienților alergici la ouă și serurile non-alergice. Serul blot al pacienților alergici la ou a prezentat o legare redusă (o culoare mai deschisă) pentru banda mutantă Gal d 1 în comparație cu Gal d 1 de tip sălbatic (Figura 5). Blotul serului non-alergic nu a prezentat benzi detectabile în niciuna dintre benzile reprezentând Gal d 1 de tip sălbatic sau mutant (Figura 5).
Compararea imunologică a reactivității IgE de tip sălbatic și a mutantului Gal d 1. S-au efectuat Western blots, exact cu aceeași cantitate de proteine încărcate împotriva serurilor pacienților alergici la ovule și alergice non-alergice. IgE anti-uman produs la capră a fost folosit ca anticorp secundar. Controalele nealergice au fost utilizate pentru a testa orice legare nespecifică a anticorpului secundar. Bloturile arată o pierdere a reactivității IgE în PM7/9 mutant.
4. Discutie
Alergiile alimentare, inclusiv alergia la ouă de pui, pot provoca uneori reacții severe, cum ar fi anafilaxia. La astfel de pacienți, utilizarea alergenilor naturali pentru diagnostic sau imunoterapie poate fi asociată cu reacții alergice nedorite. Prin urmare, versiunile hipoalergenice sau mai puțin alergenice ale alergenilor ar fi utile la acești pacienți cu reacții alergice severe. Producția de variante hipoalergenice a fost urmărită cu rigurozitate în cercetarea alergică, de exemplu producerea unei variante hipoalergenice a alergenului principal la latex Hev b 6.01 prin mutageneză dirijată de către site de Drew și colab., 2004 [19] și dezvoltarea unui vaccin. folosind derivați hipoalergenici ai alergenului de polen de mesteacăn Bet V 1 de Niederberger și colab., 2004 [23]. În acest studiu, am dezvoltat o variantă hipoalergenică a alergenului principal albușului de ou Gal d 1 (Gal d 1) care a demonstrat o reactivitate IgE redusă în comparație cu omologul său de tip sălbatic.
Pentru mutageneză, s-a decis utilizarea alaninei ca înlocuitor al reziduurilor de cisteină la C192 și C210 deoarece este cel mai comun aminoacid care nu are efecte electrostatice sau sterice extreme asupra conformării proteinei [24]. Rezultatul secvențierii celor șase clone post-mutageneză a arătat că cinci clone au prezentat doar una dintre mutațiile dorite. Trusa de mutageneză utilizată în acest studiu a permis introducerea mutațiilor multiple într-o singură reacție. Prin urmare, eficiența scăzută poate fi atribuită unor factori precum calitatea șablonului ADN sau eficiența primerilor mutageni. Cu toate acestea, o clonă a avut ambele mutații dorite la C192 și C210, înlocuind codonii TGC (cisteină) cu GCC (alanină). Structura secundară Gal d 1 este alcătuită din trei domenii tandem (I - III), cu domeniul III prezentând reactivitate IgE ridicată [25]. Prin vizarea C192 și C210, ne-am propus să distrugem două punți disulfură cisteină-cisteină din domeniul III, modificându-i astfel conformația. Am emis ipoteza că modificarea conformației domeniului III poate avea un efect semnificativ asupra reactivității IgE a întregii proteine.
Mutantul Gal d1 a fost exprimat cu succes în E. coli. A fost efectuată o expresie în timp pentru a determina punctul optim de timp pentru exprimarea proteinei mutante. Am raportat anterior că Gal d1 recombinant de tip sălbatic a fost cel mai bine exprimat la 2 ore postinducție cu IPTG [20]. Cu toate acestea, modelul de expresie al proteinei mutante a fost diferit de cel al tipului sălbatic, așa cum se arată în Figura 3. Nivelul de expresie al proteinei mutante a crescut cu timpul până la 5 ore, spre deosebire de proteinele de tip sălbatic care au arătat o reducere a expresiei după 2 ore. Similar cu tipul sălbatic, mutantul a fost extrem de exprimat în fracția insolubilă, indicând faptul că expresia proteinei determină formarea corpurilor de incluziune în E. coli. Cu toate acestea, cantitatea exprimată în fracția solubilă a fost suficientă pentru restul acestui studiu.
5. Concluzii
În rezumat, am produs cu succes o variantă hipoalergenică a alergenului principal de albuș de ou Gal d 1 prin întreruperea a două punți cisteină-cisteină utilizând mutageneză direcționată la fața locului. Această variantă hipoalergenică, după purificare și analize imunologice suplimentare, poate fi utilizată ca un component excelent în viitoarele vaccinuri imunoterapice pentru alergia la ouă.
Mulțumiri
Dorim să mulțumim Centrului de Cercetare Cooperativă Poultry (CRC) (înființat și susținut în cadrul Programului Centrelor de Cercetare Cooperativă al Guvernului australian) și Centrului de cercetare strategică (MMR) al Universității Deakin pentru cercetarea strategică (SRC) pentru furnizarea acestui studiu cu cercetările necesare. finanțare, Laboratorul australian de sănătate animală (AAHL) al Organizației de cercetare științifică și industrială a Commonwealth-ului (CSIRO) pentru furnizarea de țesuturi animale necesare pentru studiu și Institutul de cercetare pentru copii Murdoch (MCRI) de la Royal Children's Hospital Melbourne pentru furnizarea de pacienți alergici la ouă „ser care a fost crucial pentru analiza imunologică. Institutul de cercetare pentru copii Murdoch este susținut de Programul de sprijinire a infrastructurii operaționale a guvernului victorian. Autor P.D. a fost susținut de o bursă de cercetare postuniversitară a Universității Deakin și o bursă de doctorat CRC pentru creșterea păsărilor.
Abrevieri
| IgE | imunoglobulină E |
| OIT | imunoterapie orală |
| SPT | teste de înțepare a pielii |
Contribuțiile autorului
C.S. și T.D. a conceput și a supravegheat studiul. P.D. și D.W.-D. a efectuat experimente, a colectat date și a pregătit manuscrisul. M.L.K.T. au furnizat reactivi esențiali pentru analiza imunologică. Toți autorii au examinat și editat manuscrisul.
Conflicte de interes
Autorii nu declară niciun conflict de interese.
- Cum funcționează blocanții pentru carbohidrați, cum ar fi extractul de fasole albă de rinichi?
- Influența factorilor nedietetici asupra prevalenței obezității abdominale ca componentă majoră a
- Rețetă Brownies alb-negru cu conținut scăzut de calorii
- Postul intermitent - o metodă pentru pierderea grăsimii; Antrenor Alma White
- Intervieți Michael Jai White Talks Training, filme și experiența sa reală de luptă musculară;