Informații despre articol

Wei Wei, Departamentul de Gastroenterologie, Spitalul Wangjing din China Academia de Științe Medicale din China, Nr. 6 din Wangjing Central South Road, districtul Chaoyang, Beijing 100102, China. E-mail: [e-mail protejat]

adipokinei

Abstract

Obiectivul studiului este de a determina mecanismul de eficacitate asociat cu adipokine al decoctului de Si He (SHD) pentru tratarea bolilor hepatice grase nealcoolice (NAFLD). Patruzeci și cinci de șobolani Sprague-Dawley (SD) au fost împărțiți aleatoriu în grupul martor, grupul model, grupul SHD cu doză mică, grupul SHD cu doză medie și grupul SHD cu doză mare. Cu excepția grupului de control, alții au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi timp de 12 săptămâni pentru a stabili un model. Apoi, s-a efectuat colorarea cu H&E și roșu ulei și s-a folosit testul imunosorbent legat de enzimă (ELISA) pentru a detecta nivelul de expresie al moleculelor asociate adipokinei. Rezultatele colorării H&E și roșu uleios au arătat că tratamentul SHD pentru NAFLD ar putea îmbunătăți în mod eficient condițiile patologice ale ficatului comparativ cu cel din grupul model și cea mai bună eficacitate a fost observată în grupul cu doze mari SHD. Comparativ cu grupul model, tratamentul cu SHD ar putea reduce în mod eficient nivelul de expresie al factorului de necroză tumorală-alfa (TNF-α) și interleukina-6 (IL-6) și ar regla nivelul de expresie al visfatinei, adiponectinei (APN), leptinei (LEP), și rezistență la șobolani NAFLD. SHD poate îmbunătăți NAFLD prin mai multe mijloace de direcționare a adipokinelor.

Introducere

Materiale și metode

Animale experimentale

Un total de 45 de șobolani Sprague-Dawley (SD) masculi sănătoși de calitate curată (fără patogeni specifici (SPF), greutate corporală medie = 180 ± 10 g) au fost folosiți în acest studiu. Acești șobolani au fost cumpărați de la Beijing VitalRiver Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Licența nr. SCXK (Beijing) 2012-0001) și au fost crescute la Centrul Experimental pentru Animale, Spitalul Dongzhimen, Universitatea de Medicină Chineză din Beijing. Înainte de aceste experimente, acești șobolani SD au fost hrăniți în centrul experimental timp de 1 săptămână pentru a se adapta la mediu.

Dieta bogată în grăsimi

Dieta bogată în grăsimi din clasa SPF a fost achiziționată de la Beijing Keaoxieli Feed Co., Ltd. (Licența nr. SCXK (Beijing) 2009-0012). Dieta bogată în grăsimi (10 kg per ambalaj) conținea 88% furaje obișnuite, 2% colesterol și 10% untură, care a fost sterilizată cu cobalt 60 și depozitată la temperatura camerei.

Medicină tradițională chinezească

Rețeta TCM, Si He Decoction (SHD), a fost achiziționată de la farmacia spitalului Wangjing din Academia Chineză de Științe Medicină Tradițională Chineză, care a fost preparată în decoctul din camera de decoct de plante și a fost testată pentru volumul, greutatea specifică, și higiologie. Medicamentul lichid de 1 ml a echivalat cu 2 g de medicament brut. Ingredientele SHD au fost după cum urmează: 10 g de Bupleurum, 10 g de Fructus Aurantii, 30 g de pelin oriental, 9 g de gardenie, 6 g de rubarbă preparată, 30 g de rizom de pătlagină de apă orientală, 15 g de prăjit Atractylodes macrocephala, 9 g de Pinellia, 9 g de Magnolia officinalis, 20 g de semințe de coix, 6 g de semințe de cardamom rotunde, 15 g de talc, 12 g de coajă de mandarină, 9 g de rizom chuanxiong, 12 g de rizom galingale de nucă, 20 g de prăjit Radix Paeoniae Alba și 6 g de lemn dulce.

Reactivi principali

Formaldehidă (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.), 10% hidrat de clor, xilen, eozină și hematoxilină (Beijing Chemical Reagent Co., Ltd.), roșu ulei O (Sigma) și soluție salină (Beijing Double-Crane Pharmaceutical Co. ), Ltd.) au fost utilizate. Mai mult, kitul de testare imunosorbentă enzimatică (ELISA) pentru visfatină de șobolan (bază albastră), APN de șobolan și LEP, kit ELISA pentru rezistină de șobolan (Senxiong Technologies) și kituri ELISA pentru factorul de necroză tumorală la șobolan-alfa (TNF-α) și interleukina-6 de șobolan (IL-6) (Beijing Huanya Tektronix Biomedical Technology Co. Ltd.) au fost de asemenea utilizate.

Principalele instrumente

Principalele instrumente utilizate au fost mașina automată de încorporare a parafinei, microtomul semiautomatic ultra-subțire, microtomul de îngheț (Leica), un microscop și sistemul său corespunzător de fotografie (Olympus), un frigider criogenic de –80 ° C (Sanyo), balansul electronic Factory), un cititor de plăci multifuncțional complet automat (ThermoFisher), un incubator cu temperatură constantă (instrumentul Tianjin TAISITE) și o masă de agitare (QILINBEIER).

Metode experimentale

Protocolul experimental a respectat strict principiile experimentale de bază (randomizare, control și repetabilitate) și a fost aprobat de Comitetul de Etică al Spitalului Dongzhimen al Universității de Medicină Chineză din Beijing.

Gruparea animalelor și stabilirea modelului NAFLD

Observarea patologică a țesuturilor hepatice de șobolan

După 6 săptămâni de tratament și post cu apă potabilă timp de 24 de ore, trei șobolani au fost selectați aleatoriu din fiecare grup și li s-a administrat eutanasie. Apoi, ficatul a fost recoltat rapid, plasat pe gheață și spălat cu soluție salină normală. Apoi, jumătate din lobul drept al ficatului a fost obținut, înfășurat cu o folie de tablă și trimis rapid la secția de patologie a spitalului nostru pentru secțiunea înghețată, urmată de colorarea cu roșu de ulei. Ulterior, jumătatea rămasă a ficatului drept a fost fixată cu 4% paraformaldehidă, încorporată în parafină, feliată în mod obișnuit și a suferit colorare H&E pentru a observa modificările patologice ale ficatului.

Detectarea nivelurilor de visfatină, APN, LEP, rezistină, TNF-α și IL-6 de către ELISA

Metoda experimentului pe animale a fost aceeași cu cea din secțiunea „Animale experimentale”. După 6 săptămâni de tratament și post cu apă potabilă timp de 24 de ore, probe de ficat au fost obținute de la șobolani din fiecare grup, spălate cu soluție salină normală și cântărite. Aceste probe au fost adăugate cu 10 ori volumul de soluție salină tamponată cu fosfat (PBS), împământate, centrifugate și s-a obținut supernatantul. S-a efectuat ELISA sandwich cu dublu anticorp și s-au efectuat pași specifici în conformitate cu instrucțiunile de utilizare de pe cutia reactivului.

Analiza statisticilor

Datele au fost analizate folosind software-ul statistic SPSS13.0. Rezultatele au fost prezentate ca medie ± deviație standard (x ¯ ± SD). Distribuția normală și omogenitatea varianței datelor au fost mai întâi evaluate. Datele de măsurare au fost evaluate utilizând testul t sau analiza varianței, iar datele de numărare au fost evaluate utilizând testul chi-pătrat sau testul non-parametric. P-valoarea din Figura 1 (a)): țesuturile hepatice au structuri intacte și clare, celulele hepatice au fost aranjate regulat, structura nucleară a celulelor hepatice a fost intactă, citoplasma a fost colorată în roz și nu s-a găsit nicio inflamație.

Grup model (Figura 1 (b)): s-a găsit acumularea severă de grăsime în țesutul hepatic, structura a fost dezordonată, s-a observat umflarea și deformarea celulelor hepatice, s-a găsit o cantitate mare de picături de lipide în citoplasmă, nucleele au fost deviate, s-a observat infiltrarea unei cantități mari de celule inflamatorii și s-au găsit focare necrotice în lobuli.

Grup cu doze mici SHD (Figura 1 (c)): leziuni ușoare de grăsime au fost găsite în țesutul hepatic, picături mici de lipide au fost găsite în celulele hepatice, o parte a celulelor hepatice au fost umflate, infiltrarea unei cantități mici de celule inflamatorii a fost găsită, iar focarele necrotice s-au găsit ocazional în lobuli.

Grup SHD cu doză medie (Figura 1 (d)): acumularea de grăsime în țesutul hepatic a scăzut, structurile lobulelor hepatice au fost relativ intacte, structurile celulelor hepatice au fost relativ clare, nu s-au găsit focare necrotice și infiltrarea unei cantități mici de s-a găsit celule inflamatorii.

Grup cu doze mari SHD (Figura 1 (e)): Degenerarea grasă a celulelor hepatice nu a fost evidentă, structurile lobulelor hepatice au fost relativ intacte, structurile celulelor hepatice au fost relativ clare, nu s-au găsit focare necrotice și infiltrarea unui a fost găsită o cantitate mică de celule inflamatorii (Figura 1).

Figura 1. Colorarea H&E a țesutului hepatic la diferite grupuri (200 ×). (a) Grup control, (b) grup model, (c) grup SHD cu doză mică, (d) grup SHD cu doză medie și (e) grup SHD cu doză mare.

SHD: Si He Decoction.

Grupul cu doze mari SHD a fost aproape de grupul martor în rezultatele colorării H&E.

Rezultatul colorării roșii de ulei

Grup de control (Figura 2 (a)): Nu a fost găsită nicio picătură de grăsime colorată în roșu.

Grupa model (Figura 2 (b)): Probele prezentate cu colorare stacojie fulgi, o cantitate mare de picături de lipide au fost distribuite în citoplasmă, iar numărul de celule cu picături de lipide/numărul de celule totale în lobulii hepatici a fost de 70% –90%.

Grup cu doze mici SHD (Figura 2 (c)): Zonele colorate în stacojiu au scăzut, iar numărul de celule cu picături de lipide/numărul de celule totale din lobulii hepatici a fost de 35% -50%.

Grupa SHD cu doză medie (Figura 2 (d)): Zonele colorate în roșu au scăzut semnificativ, iar numărul de celule cu picături de lipide/numărul de celule totale din lobulii hepatici a fost de aproximativ 27% -45%.

Grup cu doze mari SHD (Figura 2 (e)): Zonele colorate cu roșu au scăzut semnificativ sau nu au fost găsite, iar numărul de celule cu picături de lipide/numărul de celule totale din lobulii hepatici a fost de aproximativ 18% –32%. Rezultatele colorării roșii ulei O a țesuturilor hepatice de la șobolani din fiecare grup sunt prezentate în Figura 2 .

Figura 2. Colorarea roșie ulei a țesutului hepatic în diferite grupuri (200 ×). (a) Grup control, (b) grup model, (c) grup SHD cu doză mică, (d) grup SHD cu doză medie și (e) grup SHD cu doză mare.

SHD: Si He Decoction.

Grupul cu doze mari SHD a fost aproape de grupul martor în rezultatele colorării cu roșu ulei.

Expresia adipokinelor în ficatul șobolanilor din fiecare grup

Datele din fiecare grup au fost testate pentru distribuția normală și omogenitatea varianței. Aceste date s-au dovedit a fi distribuite în mod normal, iar varianța a fost omogenă. Apoi, aceste date au fost comparate utilizând analiza univariată a varianței.

Compararea nivelurilor de expresie a visfatinei

Tabelul 1. Compararea nivelurilor de expresie a visfatinei, APN, LEP, rezistinei, TNF-α, IL-6 între diferite grupuri (x ¯ ± SD).

Tabelul 1. Compararea nivelurilor de expresie a visfatinei, APN, LEP, rezistinei, TNF-α, IL-6 între diferite grupuri (x ¯ ± SD).

Compararea nivelurilor de expresie APN

Valoarea OD și nivelul APN în ficatul șobolanilor au fost mai mari în grupurile SHD cu doză mare, SHD cu doză medie și SHD cu doze mici decât cele din grupul martor și toate diferențele au fost semnificative statistic (P 9 Tratamentul cu SHD ar putea îmbunătăți patologia ficatului în colorarea cu H&E și roșu uleios, iar șobolanii în doza mare SHD au avut cel mai bun efect de îmbunătățire.

Declarația de interese conflictuale
Autorii nu au declarat potențiale conflicte de interese în ceea ce privește cercetarea, autorul și/sau publicarea acestui articol.

Finanțarea
Autorii au dezvăluit primirea următorului sprijin financiar pentru cercetarea, autorul și/sau publicarea acestui articol: Proiectul instituției științifice centrale de interes public al academiei chineze de știință medicală chineză (nr. ZZ070816).

ORCID iD
Wei Wei https://orcid.org/0000-0001-7821-340X