Abstract

Pentru identificarea copiilor cu leziuni precoce ale mucoasei și pentru urmărirea rapidă sunt necesari markeri extrem de discriminatori pentru boala celiacă. Scopul acestui studiu a fost de a evalua potențialul anticorpilor IgA și IgG anti-țesut transglutaminază circulanți (tTG) în diagnosticul și urmărirea bolii celiace din copilărie. Un ELISA care utilizează tTG uman recombinant a fost utilizat pentru a măsura nivelurile de anticorpi anti-tTG IgA și IgG în 226 probe de ser de la 57 de copii cu boală celiacă verificată de biopsie, 29 de subiecți de control al bolii și 24 de subiecți de control sănătoși. Toate probele au fost, de asemenea, analizate pentru anticorpi anti-endomisiu (EMA). Nivelurile de anticorpi IgA și IgG anti-tTG corelate cu starea structurii viloase a intestinului subțire și nivelurile serice ale IgA EMA. Toate cele 25 de probe de ser obținute de la pacienți netratați conțineau anticorpi IgA anti-tTG, iar 24 din 25 aveau, de asemenea, IgA EMA. Dintre probele de ser de la 53 de copii martori, doi aveau anticorpi IgA anti-tTG și doi aveau IgA EMA. Copiii cu vârsta sub 5 ani cu boală celiacă netratată au avut cele mai ridicate niveluri serice atât de IgA cât și de IgG anti-tTG. A existat deja o creștere a anticorpilor anti-tTG IgA după 2 săptămâni de provocare cu gluten (p

Pacienții cu boală celiacă prezintă un spectru larg de diferite simptome nespecifice, iar descrierea clasică a bolii este probabil doar un capăt al spectrului larg de tulburări induse de gluten. Prin definiție, o biopsie din intestinul subțire proximal este esențială pentru diagnostic, iar boala celiacă este verificată cu cel puțin o biopsie intestinală care prezintă atrofie viloasă (1). Prin urmare, apar dificultăți de diagnostic atunci când se observă doar modificări patologice minore în morfologia mucoasei sau o densitate crescută a IEL.

Nivelurile crescute de IgA și IgG AGA și IgA EMA circulante sunt frecvente la pacienții cu boală celiacă, iar evaluarea acestor anticorpi este, în general, utilizată ca ajutor în diagnostic (2). Cu toate acestea, unii pacienți celiaci nu au niveluri crescute de AGA și EMA și, atunci când sunt crescute, diferitele niveluri de anticorpi scad lent, fiind reduse doar după 3-12 luni de restricție a glutenului (3).

tTG a fost identificat în 1997 ca principalul antigen țintă pentru anticorpii endomiziali (4). TTG a fost demonstrat în multe țesuturi umane diferite, cum ar fi pielea, ficatul și mucoasa jejunală (5). TTG este implicat în aderența celulară, asamblarea matricei extracelulare și mecanismele de vindecare a rănilor (6-8), iar gliadinele din grâu pot acționa ca substrat pentru reacțiile transglutaminazei (9, 10). De asemenea, s-a arătat că tTG deamidează selectiv peptidele gliadinei, ceea ce duce la o reactivitate puternic crescută a celulelor T derivate din intestin specific gliadinelor (11, 12).

Măsurătorile anticorpilor IgA serici împotriva tTG pot fi utilizate ca markeri sensibili și specifici pentru boala celiacă netratată. Testele pentru detectarea anticorpilor anti-tTG IgA au o sensibilitate de 92 până la 100% și o specificitate de 90 până la 98% (13-20). Rapoarte recente au indicat că testele tTG pot fi îmbunătățite în continuare prin utilizarea tTG uman în loc de tTG porc de guineea (18, 20-22).

Cu toate acestea, există încă unele îndoieli cu privire la faptul că tTG uman recombinant poate fi utilizat cu aceeași sensibilitate diagnostică și precizie ca testul EMA și dacă tTG uman recombinant este un marker mai sensibil și specific decât EMA pentru boala celiacă la copiii mai mici. Prin urmare, am studiat un grup mare de copii cu boală celiacă verificată de biopsie și am controlat subiecții cu alte boli gastro-intestinale pentru a investiga potențialul clinic al tTG uman recombinant în diagnosticul și urmărirea bolii celiace din copilărie.

METODE

Pacienți.

În acest studiu au fost incluși 86 de copii cu simptome gastro-intestinale și suspiciune de malabsorbție. Boala a fost diagnosticată la toți copiii de la Departamentul de Pediatrie, Spitalul Universitar Uppsala, iar în cursul anchetei boala celiacă a fost evidentă la 57 de copii (31 fete, 26 băieți; vârsta mediană, 4 ani; interval, 1-16 ani). Diagnosticul a fost confirmat în conformitate cu criteriile inițiale ale Societății Europene pentru Gastroenterologie Pediatrică, Hepatologie și Nutriție (ESPGHAN) (23) sau conform criteriilor revizuite pentru diagnosticarea bolii celiace la copii.

Au fost efectuate biopsii ale intestinului subțire la toți copiii și au fost incluse în acest studiu 25 de biopsii de la pacienți netratați, 21 de biopsii după 1-3 ani pe o dietă fără gluten și 38 de biopsii după 12 săptămâni de GC. Patruzeci dintre copiii celiaci au primit o probă de sânge după 2 săptămâni de GC. Toți copiii provocați au avut o dietă normală care conține gluten, cu recomandarea ca sarcina zilnică de gluten să fie cel puțin echivalentă cu 2-3 bucăți de pâine.

După o examinare diagnostică extinsă, 29 de copii (16 fete, 13 băieți; vârsta medie, 5 ani; interval, 1-18 ani) s-au dovedit a avea alte tulburări decât boala celiacă. În acest grup de control al bolii, doi au avut boli inflamatorii intestinale, nouă au avut intoleranță la laptele de vacă, trei au avut alte intoleranțe alimentare și 15 au avut tulburări gastro-intestinale tranzitorii. Toți subiecții de control al bolii au suferit o biopsie a intestinului subțire și au fost incluse 24 de biopsii în studiu.

Douăzeci și patru de copii (11 fete, 13 băieți; vârsta medie, 5 ani; interval, 1-16 ani) fără simptome gastro-intestinale și fără rude cu boală celiacă au servit drept subiecți de control sănătoși. Toate studiile la pacienți și subiecți de control au fost efectuate în conformitate cu regulile etice ale spitalului.

Anticorpi anti-tTG.

Anticorpii IgA și IgG la tTG în ser au fost determinați cu un ELISA (prototip de cercetare, Pharmacia Diagnostics, Freiburg, Germania). S-au utilizat benzi de microplacă acoperite cu tTG uman recombinant produse în sistemul Baculo/Sf9 la concentrație optimă. TTG uman recombinant a avut o puritate de 99% și a inhibat legarea endomizială IgA de la serul pacientului cu boală celiacă la esofagul maimuțelor mai eficient decât tTG la cobai și a dat o inhibare echivalentă tTG-ului nativ din eritrocitele umane (24).

Serurile pacienților au fost diluate în PBS cu 1% BSA și 0,1% azidă de sodiu (PBS-BSA) la concentrații adecvate. S-a adăugat ser de pacient (100 μL) și benzile au fost incubate timp de 30 min la temperatura camerei și spălate de trei ori cu PBS. S-a adăugat peroxidază de hrean - anticorpi anti-IgA sau IgG anti-umani conjugați și după 30 de minute la temperatura camerei plăcile au fost spălate de trei ori.

S-a adăugat o soluție de substrat care conține 3,3 ′, 5,5 ′ tetrametilbenzidină și reacția a fost oprită după 10 minute la temperatura camerei cu 0,5 M H2SO4. Absorbanta a fost masurata la 450 nm.

Calibratori de anticorpi IgA anti-tTG, un control negativ și semifabricate diluante au fost incluși în fiecare test. Concentrațiile de anticorpi au fost exprimate ca UA pe mililitru, iar probele de ser cu absorbanțe peste cel mai mare calibrator au fost diluate în continuare și reevaluate. Variațiile intra și interanalize au fost mai mici de 10%.

Limita pentru testele tTG a fost determinată de curbele caracteristice de funcționare a receptorului (25), iar nivelurile de tăiere au fost de 4,7 AU/mL pentru testul IgA tTG și 1,2 AU/mL pentru testul IgG tTG.

Analiza EMA.

IgA EMA au fost analizate prin microscopie indirectă de imunofluorescență utilizând secțiuni fixe de criostat de esofag de maimuță (Scimedx, Densville, NJ, S.U.A.) ca substrat antigenic (26). Serurile pacienților au fost diluate 1/10, iar serurile pozitive au fost, de asemenea, investigate la diluții de 1/50, 1/100, 1/500 și 1/1000. Titrul anticorpului a fost definit ca cea mai mare diluție serică care produce fluorescență.

Celule producătoare de AGA.

Celulele mononucleare din sângele periferic au fost obținute din sânge venos heparinizat prin separare pe Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suedia). Fenotipul celular a fost determinat prin analiza de sortare a celulelor activată prin fluorescență și 6 până la 22% din celulele mononucleare erau CD45 + CD19 + (citometru de flux FACSscan și MAb de la Becton Dickinson, San Jose, CA, S.U.A.).

Testul imunospot legat de enzime (ELISPOT) a fost efectuat așa cum este descris în altă parte (27). Specificitatea antigenului a fost demonstrată de absența celulelor care formează pete pe plăcile acoperite cu ovalbumină și tetanos-toxoid. Mai mult decât atât, adăugarea de gliadină în exces (1 mg/ml) la celulele mononucleare înainte de adăugarea la godeurile acoperite cu gliadină a inhibat formarea punctelor de 70 până la 85%, în timp ce 5 mg/ml ovalbumină nu a avut niciun efect.

Metoda ELISA pentru detectarea anticorpilor IgA și IgG la gliadină în ser a fost efectuată așa cum s-a descris în altă parte (27). Au fost utilizate seruri de pacienți pozitivi cu concentrații mari de AGA ca standarde, iar concentrația de anticorpi a fost exprimată ca AU pe mililitru.

Biopsie intestinală.

În acest studiu au fost incluse 108 biopsii intestinale subțiri reexaminate, toate acestea fiind studiate histologic de același patolog și care au fost normalitate definită cu un raport vilos la criptă de 2: 1 sau mai mult (28) și un număr IEL în limite normale ( ≤1 IEL/5 celule epiteliale) (29, 30).

Modificările histopatologice au fost clasificate ca mucoase normale, numărul crescut de IEL fără semne de atrofie „numărul IEL a fost clasificat în funcție de Michaëlsson și colab.(31) ”, atrofie viloză parțială sau subtotală (un raport vilos la criptă distinct mai mic de 2: 1) și atrofie viloză totală (mucoasă plată).

Statistici.

Numărul de UA per mililitru este raportat ca median (cu centile 10 și 90, între paranteze). Testul Kruskal-Wallis și Mann-Whitney U testul (cu două cozi) a fost utilizat pentru a calcula diferențele în UA între diferitele grupuri de pacienți, iar testul Wilcoxon cu rang semnat a fost utilizat pentru a compara valorile înainte și după GC.

REZULTATE

Anticorpii anti-tTG IgA și IgG.

Nivelurile serice ale anticorpilor anti-tTG IgA și IgG la copiii cu boală celiacă și subiecții martor sunt prezentați în Figura 1. Copiii mai mici de 5 ani au prezentat în mod constant niveluri serice atât de anticorpi anti-tTG IgA, cât și IgG decât copii mai mari.

uman

Nivelurile serice de anticorpi IgA (A) și anticorpi IgG (B) împotriva tTG uman recombinant exprimat ca UA pe mililitru la subiecții martori sănătoși (HC), subiecți de control al bolii (DC) și pacienții cu boală celiacă netratată (UT). Liniile reprezintă valori mediane. Cutoff pentru IgA anti-tTG, 4,7 AU/mL, și pentru IgG anti-tTG, 1,2 AU/mL.

Copiii bolii celiace netratate au avut cele mai ridicate niveluri de IgA anti-tTG „mediană, 958,4 (7,5–5480,6) AU/mL” și IgG anti-tTG „mediană, 44,8 (1,3–156,0) AU/mL”. Niciunul dintre cele 24 de controale sănătoase nu a avut mai mult de 5,1 IgA anti-tTG AU/mL „mediană, 1,3 (0,3-3,9) AU/mL” sau mai mult de 1,6 IgG anti-tTG AU/mL „mediană, 0,5 (0,09-1,2) AU/mL ”.

Dintre cele 46 de probe de ser prelevate de la cei 29 de subiecți de control al bolii, un copil a avut niveluri serice crescute de IgA anti-tTG (17,9 AU/ml). A fost diagnosticată ca având intoleranță la laptele de vacă.

Biopsia intestinului subțire.

În acest studiu au fost incluse 108 biopsii intestinale subțiri evaluabile. Optzeci și patru de biopsii au fost luate de la copiii diagnosticați cu boală celiacă și 24 din grupul de control al bolii. Toți copiii cu boală celiacă netratată au avut o atrofie viloasă totală sau parțială sau subtotală. Niciunul dintre controalele bolii nu a avut atrofie viloasă, dar un copil a avut diaree și niveluri crescute de IEL fără simptome clinice ale bolii celiace.

În mucoasa normală IEL a fost prezent în principal la membrana bazală, în timp ce în mucoasa cu un număr crescut de IEL limfocitele au fost prezente mai apical și au avut tendința de a se aglomera.

Figura 2 prezintă nivelurile de anticorpi IgA anti-tTG comparativ cu morfologia mucoasei intestinului subțire. Nivelurile serice ale IgA anti-tTG au fost crescute (p Figura 2

Nivelurile serice de anticorpi IgA împotriva tTG uman recombinant exprimate ca UA pe mililitru la subiecții de control al bolii (DC), pacienți cu boală celiacă netratată (UT), pacienți după o dietă fără gluten (GFD), și pacienții după GC în comparație cu histopatologia mucoasei intestinului subțire (VA, atrofie viloasă; VA parțială/subtotală, un raport vilos la criptă distinct mai mic de 2: 1;p valori vs. normal). Liniile reprezintă valori mediane. Cutoff, 4,7 AU/ml.

Dintre cei 21 de copii care au urmat o dietă fără gluten, doi au prezentat o atrofie viloză parțială sau subtotală, doi au avut un număr crescut de IEL și toți cei patru au avut niveluri serice crescute de IgA EMA.

O mucoasă cu un raport vilos normal la criptă, dar un număr crescut de IEL a fost evidentă la șase pacienți cu boală celiacă după 12 săptămâni de GC și, după o GC prelungită, toți cei șase au fost diagnosticați cu boală celiacă în conformitate cu simptomele lor clinice. Patru dintre acești copii au avut niveluri serice crescute atât de IgA anti-tTG, cât și de IgA EMA.

Anticorpii IgA anti-tTG în timpul provocării glutenului.

După mai mult de 1 an de dietă fără gluten, patru din 18 copii cu boală celiacă au avut niveluri serice crescute de anticorpi IgA anti-tTG „mediană, 1,9 (0,9-22,3) AU/mL” și patru din 18 au avut IgA EMA. Niciunul dintre copii nu a avut un număr crescut de celule care formează pete IgA AGA după o dietă fără gluten.

Nivelurile serice ale anticorpilor IgA anti-tTG au crescut (p Figura 3

Nivelurile serice de anticorpi IgA împotriva tTG uman recombinant exprimate ca UA pe mililitru la pacienții cu boală celiacă după o dietă fără gluten (GFD) și după 2 săptămâni și 12 săptămâni de GC. Liniile reprezintă valori mediane. Cutoff, 4,7 AU/ml.

Sensibilitatea și specificitatea diferiților markeri în detectarea bolii celiace.

Sensibilitatea și specificitatea diferiților markeri ai bolii celiace sunt rezumate în Tabelul 1. IgA anti-tTG ELISA a prezentat o sensibilitate de 100% comparativ cu 96% pentru testul IgA EMA. Specificitatea testelor IgA anti-tTG ELISA și a testelor IgA EMA a fost de 96%.

După 2 săptămâni de GC, 18 din 40 de copii au avut niveluri serice crescute de anticorpi IgA anti-tTG și IgA EMA, iar 31 din 40 de copii au avut un număr crescut de celule care formează pete IgA AGA circulante.

După 12 săptămâni de GC, 41 din 46 de copii au avut niveluri serice crescute de anticorpi IgA anti-tTG și un număr crescut de celule circulante care formează pete IgA AGA, iar 42 din 46 de copii au avut niveluri serice crescute de IgA EMA.

DISCUŢIE

Acest studiu s-a preocupat de utilizarea unui ELISA tTG uman recombinant ca metodă de diagnostic pentru boala celiacă din copilărie și dacă această analiză poate fi utilizată la copii mici ca alternativă la analiza laborioasă EMA și analiza AGA mai puțin sensibilă.

Testele tTG umane s-au dovedit anterior a avea o sensibilitate și specificitate mai mari decât testele bazate pe tTG cobai atât la adulți, cât și la copii (18, 20-22). Acest lucru se poate datora diferențelor mici în secvențele de aminoacizi ale tTG cobai și tTG uman sau reactivității anticorpilor împotriva proteinelor contaminante din tTG ficat cobai parțial purificat. Deoarece majoritatea studiilor efectuate până acum au folosit ELISA-uri cu tTG porc de guineea, a existat în consecință o nevoie de studii ample axate pe reactivitatea față de tTG uman, iar în acest studiu am folosit tTG uman recombinant în acest scop.

Studiul nostru a arătat o concordanță foarte mare în rezultatele dintre testul EMA și actualul ELISA uman recombinant, iar IgA anti-tTG ELISA a prezentat o sensibilitate de 100% și aceeași specificitate (96%) ca testul IgA EMA în testul investigat pacienți, care a inclus un grup mare de copii cu alte tulburări gastro-intestinale și intoleranțe alimentare. Astfel, marea majoritate a copiilor netratați și GC cu boală celiacă au fost pozitive atât pentru IgA anti-tTG, cât și pentru IgA EMA. Câțiva pacienți au fost, totuși, pozitivi doar pentru unul dintre teste, adică. un copil celiac cu boală netratată a fost negativ pentru EMA, dar anticorpul anti-tTG a fost pozitiv, în timp ce un copil GC a avut un test EMA pozitiv și a fost negativ pentru IgA anti-tTG. Ambii copii au prezentat o atrofie viloasă parțială sau subtotală. Aceste discrepanțe pot fi explicate prin diferențe în specificitatea diferiților anticorpi și ar putea indica faptul că tTG nu este singurul antigen pentru autoanticorpii asociați bolii celiace.

Anticorpii IgG anti-tTG s-au corelat și cu diagnosticul și cu starea structurii viloase a intestinului subțire. ELISA anti-tTG IgG utilizat în prezent a prezentat o sensibilitate ridicată (91%) și specificitate (96%), în timp ce alte studii recente au raportat o sensibilitate între 21% și 98% (19, 21, 32). Detectarea anticorpilor IgG anti-tTG poate fi astfel utilă pentru diagnosticul bolii celiace la pacienții cu deficit selectiv de IgA (33); această problemă trebuie investigată în continuare.

După mai mult de 1 an de dietă fără gluten, niveluri crescute de anticorpi IgA anti-tTG au rămas la patru din 18 dintre copiii cu boală celiacă și după 12 săptămâni de GC 41 din 46 dintre copiii celiaci au avut niveluri crescute de IgA anticorpi anti-tTG. Aceste rezultate indică faptul că măsurătorile anticorpilor anti-tTG pot fi utilizate în urmărirea respectării dietei și a GC. Korponay-Szabóși colab.(34) au propus ca GC să fie recomandabil la unii pacienți cu atrofie inițială viloasă și rezultate EMA negative.

Am raportat anterior că apariția celulelor producătoare de IgA AGA circulante este o constatare reproductibilă la copiii cu boală celiacă și că există o creștere rapidă a numărului de celule care formează pete IgA AGA în timpul GC (27). Niciunul dintre copiii incluși în prezentul studiu nu a avut un număr crescut de celule care formează pete IgA AGA circulante după o dietă fără gluten. Cu toate acestea, o creștere a numărului de celule care formează pete IgA AGA circulante a fost evidentă la 31 din 40 de copii după 2 săptămâni de GC. Aceste date subliniază că o posibilă utilizare a testului ELISPOT poate fi găsită în monitorizarea modificărilor producției efective de AGA, de exemplu în evaluarea diferitelor studii imunoterapeutice.

Pe scurt, am demonstrat că detectarea anticorpilor anti-tTG poate fi utilizată pentru a distinge între copiii cu boală celiacă și copiii cu alte tulburări gastrointestinale. ELISA pe bază de tTG recombinant uman este un test sensibil, specific și reproductibil pentru a sprijini diagnosticul și urmărirea bolii celiace din copilărie și poate fi utilizat ca alternativă la testul EMA. Cu toate acestea, rămâne un studiu suplimentar pentru a determina dacă utilizarea tTG uman recombinant poate detecta cu precizie 100% dintre pacienții celiaci (20, 35, 36) și astfel în ce măsură ar putea înlocui în viitor biopsia intestinală pentru diagnosticarea bolii celiace în copilărie.