Afiliație Școala de Științe Biologice, Centrul pentru Științe Biomedice, Universitatea Royal Holloway din Londra, Londra, Regatul Unit

genei

Afiliație Școala de Științe Biologice, Centrul pentru Științe Biomedice, Universitatea Royal Holloway din Londra, Londra, Regatul Unit

Afiliație Școala de Științe Biologice, Centrul pentru Științe Biomedice, Universitatea Royal Holloway din Londra, Londra, Regatul Unit

Afiliație Școala de Științe Biologice, Centrul pentru Științe Biomedice, Universitatea Royal Holloway din Londra, Londra, Regatul Unit

Afiliație Școala de Științe Biologice, Centrul pentru Științe Biomedice, Universitatea Royal Holloway din Londra, Londra, Regatul Unit

  • Mihail Soloviev,
  • Michelle P. Esteves,
  • Fakhria Amiri,
  • Mark R. Crompton,
  • Christopher C. Rider

Cifre

Abstract

Citare: Soloviev M, Esteves MP, Amiri F, Crompton MR, Rider CC (2013) Transcrierea elevată a genei QSOX1 care codifică Quiescin Q6 Sulfhydryl Oxidase 1 în cancerul de sân. PLOS ONE 8 (2): e57327. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057327

Editor: Jun Li, Facultatea de Medicină a Universității Sun Yat-sen, China

Primit: 16 septembrie 2012; Admis: 21 ianuarie 2013; Publicat: 27 februarie 2013

Finanțarea: Autorii nu au sprijin sau finanțare de raportat.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Este bine stabilit că brațul cromozomului 1q este supus amplificării la nivelul ADN în aproximativ 50-60% din cancerele de sân [1] - [3]. Deși aceasta nu este singura amplificare cromozomială în această boală, este una dintre cele mai mari și mai frecvente și a fost interpretată ca reprezentând un eveniment precoce în carcinogeneza sânilor [1]. Estimările dimensiunii și numărului de ampliconi individuali implicați variază, dar studii de hibridizare genomică comparativă cu rezoluție înaltă mai recente au indicat faptul că, deși întregul braț q poate fi amplificat, regiunile 1q21.1–1q31.1 și 1q32.1–1q44 sunt cel mai frecvent afectat [4], [5]. Spre deosebire de 1q, brațul 1p prezintă o amplificare mică, având adesea o pierdere a numărului de copii [1], [3] - [5]. Cu toate acestea, semnificația funcțională a amplificării genei 1q rămâne necunoscută. Așa cum ar fi de așteptat, numărul copiei genetice este asociat cu supraexprimarea ARNm în țesutul cancerului de sân, dar corelația de aici este mai puțin decât completă. Un studiu privind microarray-ul ADNc a arătat că 44% dintre genele foarte amplificate sunt puternic supraexprimate în cancerul de sân, dar la fel și 6% din gene cu un număr normal de copii [6].

Deoarece întregul braț 1q este supus amplificării genelor, am emis ipoteza că cartografierea mai multor gene în această regiune genomică este importantă în tumorigeneză și/sau progresie a cancerului de sân. Cu toate acestea, după cunoștințele noastre actuale, doar două gene 1q, COX2 [7], [8] și peroxiredoxin-6/PRDX6 [9] s-au dovedit până acum că sunt supraexprimate în cancerul de sân și au roluri cheie în metastază și supraviețuirea celulelor canceroase . Se știe că o altă genă 1q, nectina-4/PVRL4, este supraexprimată, dar semnificația patologică a acesteia este încă neclară [10]. Pentru a investiga dacă alte gene 1q ar putea fi supraexprimate în cancerul de sân, am analizat nivelurile lor de ARNm în țesutul mamar normal și canceros utilizând analiza în serie a expresiei genice (SAGE) și a datelor EST colectate în proiectul Cancer Genome Anatomy Project (http: // cgap.nci.nih.gov). Rezultatele acestor analize arată că mai multe gene prezintă niveluri deosebit de ridicate de supraexpresie, inclusiv QSOX1 (NM_002826) care codifică enzima quiescin Q6 sulfhidril oxidază 1. Această enzimă aparține unei familii de flavină adeninedinucleotidă (FAD) dependentă de sulfhidril oxidaze [11].

Am confirmat descoperirile noastre bioinformatice pentru QSOX1 experimental, prin efectuarea RT-PCR, 3'RACE PCR și PCR cantitativă în timp real. Am identificat o nouă formă extinsă 3'UTR a transcrierii QSOX1 și am arătat că gena este într-adevăr supraexprimată în cancerele de sân cu prognostic slab. Datele noastre identifică QSOX1 ca o genă demnă de investigații detaliate suplimentare pentru a defini relevanța sa în patogeneza și progresia acestei boli.

Rezultate

Supraexprimarea și extinderea 3 ′ a transcrierilor QSOX 1 în cancerul de sân

Pentru a investiga dacă amplificarea frecventă a genei brațului q al cromozomului 1 ar putea fi asociată cu supraexprimarea genelor situate în această regiune, am investigat o pereche de biblioteci SAGE potrivite folosind instrumentul DGED. Datele SAGE au arătat că 156 de gene 1q braț suferă o reglare transcripțională în carcinomul ductal al sânului comparativ cu țesutul mamar normal. Reglarea ascendentă a aproximativ o treime din aceste gene a fost considerată semnificativă (P≤0,05) și 25 dintre aceste gene prezintă o reglare ascendentă foarte semnificativă (P≤0,01). Ultimele gene reglate în sus sunt enumerate în Tabelul 1 în ordinea celui mai înalt grad de supraexprimare a acestora în cancerul de sân; gene cu (0,01

Panou A prezintă ADNc amplificat folosind primerii 45-F și 46-R (lungimea preconizată 550 bp). Panou B prezintă ADNc amplificat folosind primerii 43-F și 44-R (lungimea așteptată 735 bp). Alte amplificări PCR foloseau grunduri: 63-F cu 64-R (panou C, dimensiunea așteptată 836 bp), 47-F cu 48-R (panou D, dimensiunea așteptată 922 bp), 49-F cu 50-R E, 825 bp), 53-F cu 36-R (panou F, 883 bp), 23-F cu 54-R (panou G, 620 pb). Panou H prezintă ADNc amplificat al versiunii solubile a QSOX1 (QSOX1b) folosind primerii 17-F și 18-R (lungimea așteptată 814 bp). Panou Eu prezintă dimensiunea fragmentului de ADNc amplificat cu primerul senzitiv specific (106-Int-F) și primerul adaptor 3 ′ RACE antisens (Adap-1-R). Specificitatea amplificării (identitatea tuturor produselor PCR amplificate) a fost confirmată în continuare prin secvențierea ADN pentru toate produsele amplificate.

Pentru a identifica capătul real 3 ′ al ADNc QSOX1 extins, am efectuat 3′-RACE-PCR folosind un set de primerii specifici cuibăriți și un set de primerii adaptorului 3′-RACE (a se vedea tabelul suplimentar S2 pentru secvențe). ADNc amplificat a fost detectat ca o bandă de ~ 300 bp, a se vedea Figura 2, panoul I, iar capătul 3 'al ADNc QSOX1 a fost confirmat prin secvențiere. Sfârșitul ADNc QSOX1 extins corespunde poziției 150651 a secvenței genomice (AL390718), vezi Figura 1B. De asemenea, am identificat un semnal tipic de poliadenilare AATAAA poziționat la aproximativ treizeci de nucleotide în amonte de secvența poli-A din ADNc (Figura 1B). Combinarea RT-PCR-urilor suprapuse, a 3'-RACE-PCR și a semnalului de poliadenilare a confirmat fără echivoc poziția adevăratului capăt 3 'al ADNc QSOX1. Întrucât traducerea QSOX1 se oprește în interiorul exon12 care conține un codon stop, extensia nou identificată este, prin urmare, un 3’UTR lung non-codificat.

PCR cantitativă în timp real a transcrierilor QSOX1 în cancerul de sân

Am căutat în continuare să confirmăm experimental atât existența acestei noi extensii de ARNm 3S QSOX1, cât și reglarea în sus a nivelurilor de ARNm QSOX1 în țesutul cancerului de sân. Prin urmare, PCR în timp real a fost realizat folosind seturi de sonde bazate pe secvența de codare QSOX1 (CDS) (Set 1) și pe extensia 3'UTR nou identificată (Seturile 2 și 3, vezi Figura 1A). Un panou de probe de ADNc preparate din țesut mamar îndepărtat chirurgical a fost selectat. Toate țesuturile testate au relevat transcrierea tuturor celor trei regiuni QSOX1 testate, confirmând faptul că mARN-ul QSOX1 există ca transcript de ~ 6 kbp, mult mai lung decât se credea anterior. Expresia tuturor celor trei regiuni a fost scăzută în țesuturile normale și în tumorile de gradul 1, dar a prezentat niveluri crescute într-o proporție crescândă de tumori de gradul 2 și gradul 3, Figura 3A - C. Analiza statistică non-parametrică pentru toate cele patru clasificări clinice a arătat un coeficient de corelație Spearman de 0,53 între nivelul relativ al transcrierii și gradul clinic, o valoare semnificativă la nivelul p 0,01. Dintre cele 15 tumori de gradul 3 examinate, expresia în 10 probe a depășit limita superioară a normalului (medie +2 abateri standard) pentru fiecare set de primer.

Sunt prezentate datele pentru trei seturi diferite de sonde TaqMan (panourile A-C). În toate panourile, axa verticală este abundența relevantă normalizată la niveluri de ARNr de 18s. A: Primer Set 1 (bazat pe QSOX1 CDS). B: Exemplu Set 2 (bazat pe QSOX1 3′UTR). C: Primer Set 3 (bazat pe QSOX1 3′UTR). Linia orizontală din fiecare grafic de puncte arată datele de expresie medie pentru fiecare set/condiție de sondă D: Grafic de împrăștiere pentru setul 2 vs. Setați 1 date pentru toate pregătirile. E: complot Scatter pentru Set 3 vs. Setați 2 date pentru toate pregătirile. F: complot Scatter pentru Setul 1 vs. Setați 3 date pentru toate pregătirile. Pentru toate graficele de împrăștiere, toate axele prezintă valori de abundență relevante pentru sonda relevantă setată în scara logaritmică. Regresia liniară cu cea mai bună potrivire este prezentată ca o linie diagonală punctată.

Dintre cei 41 de pacienți ale căror preparate de ADNc au fost supuse analizei PCR în timp real, 25 au avut tumori clasificate ca ductale (nivelul mediu de transcriere relativă, 3,21) și 9 au fost lobulare (valoarea medie, 1,346). Restul de 7 pacienți au fost distribuiți între clasificările patologice mixte (4), mucinoase (2) și cribriform (1). Pentru rezultatele obținute cu Setul 1, prezentate în Fig. 2A, testele T cu două cozi au stabilit o diferență semnificativă între media normală și media tumorii ductale (p = 0,00148) și între valorile medii ductale și lobulare (p = 0,120). Cu toate acestea, nu au existat diferențe semnificative în valorile medii pentru țesutul normal și tumorile lobulare (p = 0,122).

Corelația nivelurilor de expresie ale regiunilor individuale (seturile de sonde 1, 2 și 3) în probe individuale de țesut, a arătat unele diferențe în gradul de împrăștiere între semnalele măsurate cu sonda Set 1 (QSOX1 CDS) și fie cu sonda Set 2 sau 3, ambele se află în QSOX1 3′UTR nou identificat, (a se vedea Figura 3D - F). Acest lucru ridică în continuare posibilitatea ca evenimente de îmbinare alternative să poată avea loc pentru a explica un anumit grad de variabilitate în exprimarea unor regiuni distincte ale transcrierii. Când s-a normalizat împotriva exprimării în țesutul mamar normal, datele au arătat că QSOX1 CDS se exprimă la niveluri relativ mai ridicate în cancerele de gradul 1, comparativ cu nivelul de expresie al QSOX1 lung 3'UTR (ambele sonde Set 2 și Set 3), dar tendința este inversat în cazurile de cancer de gradul 2 și 3 (Figura 4).

Datele de expresie medii (ca în Figura 2A - C) pentru cele trei seturi diferite de probe TaqMan normalizate pe date de expresie medie pentru Setul de probe 1 sunt prezentate. Seturile 2 și 3 (regiunea 3'UTR a QSOX1) prezintă un grad mai mic de expresie în tumorile de gradul 1 și un grad mai ridicat de expresie în tumorile de gradul 3 față de setul 1 (QSOX1 CDS).

Am încercat să identificăm experimental orice transcriere QSOX1 alternativ îmbinată care ar fi putut contribui la observațiile de mai sus prin amplificarea PCR a ADNc derivat din celulele carcinomului T47D folosind perechi de grund concepute în jurul tuturor variantelor de îmbinare cunoscute și prezise. Nu am detectat alte variante de îmbinare alternative, dincolo de formele QSOX1a și QSOX1b raportate anterior [acesta din urmă codificând forma solubilă a proteinei [12] și 3’-UTR extins raportat mai sus.

Sunt afișați exonii QSOX1. Alternativele variante îmbinate QSOX1a și QSOX1b se bazează pe NM_002826 și respectiv NM_001004128. Alte variante alternative de îmbinare se bazează pe datele de mapare EST (vezi Tabelul 2) și sunt denumite QSOX1c - QSOX1i pentru coerența cu nomenclatura utilizată anterior. Site-urile de îmbinare identificate sunt afișate cu linii de conectare îndrăznețe. Exonul 12b denotă fragmentul de secvență care lipsește în versiunea mai scurtă alternativă a QSOX1b.

Domeniile proteine ​​QSOX1 Trx1, Trx2, HRR și ARV/ALR sunt prezentate ca niște cutii umbrite de culoare gri deschis. Asteriscurile și liniile verticale galbene indică poziția perechilor de cisteină în produsul transcriptului QSOX1. SP (cutii negre) denotă un peptid semnal, TM indică un domeniu transmembranar și C indică un terminal C. Liniile orizontale punctate pătrate indică îmbinarea domeniilor trunchiate. Cutiile eclozate prezintă secvențe de aminoacizi produse în cazul în care o astfel de îmbinare are ca rezultat citirea schimbărilor de cadre.

Discuţie

Anterior, doar două variante alternative ale enzimei derivate din splicing au fost raportate în țesuturile umane, șoareci și șobolani (NM_002826 și NM_001004128 secvențe umane care codifică mRNA scurte și, respectiv, lungi). Acesta din urmă codifică o proteină ancorată cu membrană pe toată lungimea, găsită în Golgi, granule secretoare și în reticulul endoplasmatic [28], [29]. Versiunea mai scurtă a mARN-ului QSOX1 este produsă de un eveniment alternativ de îmbinare, prin care un fragment lung de 733 de baze este șters din mijlocul exonului 12, rezultând o proteină QSOX1 trunchiată care lipsește domeniul transmembranar, iar aceasta codifică izoforma secretată [12], [30]. 3'UTR extins raportat aici nu pare să codifice o secvență proteică alternativă. Cel mai probabil este implicat în reglarea post-transcripțională a traducerii QSOX1 mARN și a exportului, scindării și poliadenilării nucleare a mARN. 3'UTR-urile sunt considerate vitale pentru stabilitatea transcriptului și reglementările privind expresia genelor, cum ar fi represiunea translațională mediată de proteinele care leagă ARN și micro ARN-urile [31] - [33]. Extensia QSOX1 3'UTR raportată aici ar putea fi implicată în reglarea stabilității transcrierii QSOX1 și poate explica variabilitatea observată a nivelurilor aparente ale QSOX1 CDS vs. Regiunile 3'UTR.

Analiza noastră sistematică a bazelor de date EST a dezvăluit opt ​​noi variante de îmbinare QSOX1. Dintre aceste trei variante de secvență, QSOX1c, d și e, au o ștergere internă în cadru care păstrează complet sau parțial structura primară a celor două domenii funcționale principale cunoscute ale proteinei: domeniul tioredoxinei de tip PDI-oxidoreductaza Trx1 și FAD domeniu dependent de sulfhidril oxidază ERV/ALR [34] - [37]. Domeniul tioredoxinei, Trx2 și regiunea HRR bogată în helix sunt șterse din toate, în afară de varianta QSOX1c. Reținerea principalelor domenii funcționale ale proteinei și a tuturor disulfurilor active redox din izoformele QSOX1c, d, e poate păstra funcția principală a enzimei - oxidarea grupărilor sulfhidril în disulfuri prin reducerea oxigenului în peroxid de hidrogen. Această ipoteză este în acord cu studiile funcționale recent publicate ale fragmentelor QSOX1 care au indicat importanța interacțiunii domeniilor Trx și ERV/ALR pentru activitatea de oxidare tiol a proteinei QSOX1 [37], [38]. Produsele variantelor de îmbinare rămase (QSOX1f-i) nu au în totalitate decât fragmentul N-terminal al domeniului Trx1 și sunt cel mai probabil proteine ​​disfuncționale.

Quiescin Q6 se găsește atât în ​​reticulul endoplasmatic/aparatul Golgi, cât și ca proteină secretată [12]. Această locație dublă, împreună cu activitatea sa față de polipeptidele desfăcute implică funcții atât în ​​plierea inițială a proteinelor secretate, cât și în remodelarea acestora odată ce au ajuns la suprafața celulei și matricea extracelulară. Această din urmă activitate ar putea fi legată de semnalizarea celulelor canceroase, migrație și metastază. În acest context, este pertinent faptul că într-un ecran genetic recent al ADNc-urilor care caută transcrieri capabile să promoveze metastaza liniei celulare a cancerului de sân 168FARN, izolaza tiol ERp5 a fost identificată ca promovând migrația și invazia celulelor tumorale și ca fiind reglată în sus în probe clinice invazive de cancer de sân [44]. Luat împreună cu constatările noastre, se constată că mecanismele celulare pentru formarea legăturilor disulfidice adecvate în proteinele secretate reprezintă o zonă fertilă de investigație în cancerul de sân cu prognostic slab.

Metode

Analiza datelor de expresie SAGE și EST

RT-PCR

Pentru amplificările RT-PCR a fost utilizat un ciclotermic cu gradient Mastercycler (Eppendorf). Toate reacțiile au fost asamblate folosind un kit REDTaq ReadyMix (Sigma-Aldrich). Condițiile de amplificare au inclus o etapă inițială de denaturare de 1 min la 96 ° C, urmată de 30 de cicluri, fiecare constând dintr-o etapă de denaturare de 30 s la 96 ° C, etapă de recoacere de 30 s la (Tm - 7 ° C) și extensie de 1 min. pas la 72 ° C și o incubație finală de 5 minute la 72 ° C. Exemple de secvențe sunt listate în tabelul suplimentar S2. Toți ADNc-urile amplificate au fost analizate prin electroforeză în 1,5% geluri de agaroză. Toți ADNc-urile au fost purificate folosind un kit de purificare QIAquick PCR (QIAGEN) și identitatea lor a fost confirmată prin secvențierea (GATC Biotech).

3'-RACE PCR

PCR în timp real

informatii justificative

Figura S1.

Graficul dispersat care arată lipsa de corelație între QSOX1 și expresia ESR1 sau HER2. Axa orizontală - date de expresie SAGE pentru ESR1 sau HER2 exprimate ca jurnal al numărărilor SAGE raportate. Axa verticală - numărare SAGE QSOX1, scară jurnal. QSOX1 vs. HER2 (cercuri umplute), QSOX1 vs ESR1 (cercuri deschise). Datele expresiei nu prezintă nicio corelație semnificativă. Coeficientul de corelație Pearson calculat pentru bibliotecile în care au fost detectate atât ESR1, cât și QSOX1 a fost -0,06 și -0,03 pentru HER2 și QSOX1.

Tabelul S1.

Expresia reglată în sus a genelor 1q în carcinomul ductal al sânului (având factor de semnificație 0,01

Tabelul S2.

Secvențe nucleotidice ale primerilor utilizați pentru toate amplificările PCR.

Mulțumiri

Mulțumim Caroline J. Pennington și Dylan R. Edwards, Școala de Științe Biologice, Universitatea din East Anglia, Marea Britanie, pentru desfășurarea studiilor qPCR.

Contribuțiile autorului

Coordonarea studiului: MS MRC CCR. Citiți și aprobați manuscrisul final: MS MPE FA MRC CCR. Conceput și proiectat experimentele: MS. Au efectuat experimentele: MS MPE FA. Analiza datelor: MS MPE FA. Reactivi/materiale/instrumente de analiză contribuite: MS MRC CCR. Am scris lucrarea: MS CCR.