O V Leontieva

1 Departamentul de biologie a stresului celular, Roswell Park Cancer Institute, BLSC, L3-312, Elm and Carlton Streets, Buffalo 14263, NY, SUA

G Paszkiewicz

1 Departamentul de biologie a stresului celular, Roswell Park Cancer Institute, BLSC, L3-312, Elm and Carlton Streets, Buffalo 14263, NY, SUA

Z N Demidenko

1 Departamentul de biologie a stresului celular, Roswell Park Cancer Institute, BLSC, L3-312, Elm and Carlton Streets, Buffalo 14263, NY, SUA

M V Binevoitor

1 Departamentul de biologie a stresului celular, Roswell Park Cancer Institute, BLSC, L3-312, Elm and Carlton Streets, Buffalo 14263, NY, SUA

Abstract

Rezultate

Doza mică de rapamicină nu împiedică creșterea în greutate la șoarecii masculi cu HFD

potențează

Nivelurile de insulină din sânge (A), IGF-1b), glucozac) și trigliceride (d) la sfârșitul tratamentului. Șoarecii pe RD sau HFD au fost tratați cu resveratrol, rapamicină sau o combinație de resveratrol și rapamicină timp de 13 săptămâni, așa cum este descris în legenda din Figura 1. 1: RD; 2: HFD; 3: HFD + resv (resveratrol); 4: HFD + Rapa (rapamicină); 5: HFD + Re + Ra (+ resveratrol + rapamicină în combinație). Nivelurile de insulină, glucoză, trigliceride și IGF-1 în ser în sânge au fost determinate la post la sfârșitul tratamentului. Datele prezintă media ± S.E.M pentru fiecare grup de șoareci. Diferențele semnificative statistic au fost evaluate folosind testul t Student

Corelații între modificările metabolice

A existat o corelație puternică între greutate și nivelurile de insulină atunci când două grupuri de șoareci din două diete diferite au fost combinate (dieta obișnuită (RD) și HFD) (Figura 4a). Tratamentul cu rapamicină și resveratrol a scăzut corelația, care a rămas în continuare semnificativă. (Figura 3b). Nu a existat nicio corelație între insulină și nivelurile de glucoză (Figura 4c). Trei șoareci super-hiperinsulinemici („bolnavi”) au avut niveluri medii de glucoză (Figura 4c). Nu a existat o corelație semnificativă statistic între greutate și trigliceride și între glucoză și trigliceride.

Corelația dintre insulină și greutate ((A) grupuri netratate și (b) toate grupurile) și insulină și glucozăc) la șoareci individuali la sfârșitul tratamentului. 1: RD; 2: HFD; 3: HFD + resv (resveratrol); 4: HFD + Rapa (rapamicină); 5: HFD + Re + Ra (+ resveratrol + rapamicină în combinație). Analizele de corelație coeficientul Pearson r și valoarea P (două cozi) au fost efectuate folosind GraphPad Prism versiunea 5.00 pentru Windows

Resveratrolul inhibă răspunsul dependent de HIF-1 indus de insulină fără a inhiba mTOR

Efectele resveratrolului asupra inducției dependente de MTOR a transcripției responsive HIF-1 în celulele RPE. (A), (c): analiza imunoblotului. Celulele RPE au fost placate cu 10% ser-MEM, iar a doua zi, mediul a fost schimbat pentru MEM fără ser pentru o zi înainte de tratament. În celulele MEM fără ser au fost tratate cu concentrații indicate de resveratrol urmate fie de insulină (A) sau ser (c). Apoi celulele au fost lizate și s-a efectuat imunoblot pentru pS6 și S6. (b), (d): Inducerea luciferazei sensibile la HIF-1. Celulele au fost transfectate cu HRE-Luc (construct HIF-responsive-luciferase) așa cum s-a descris anterior. A doua zi, celulele au fost tratate cu concentrațiile indicate de resveratrol urmate fie de insulină (b) sau ser (d). După 16 ore, celulele au fost lizate și s-a măsurat activitatea luciferazei

Efectele resveratrolului și rapamicinei asupra senescenței dependente de mTOR în cultura celulară

Discuţie

Materiale și metode

Materiale pentru administrarea animalelor

Resveratrolul a fost oferit cu amabilitate de Dr. David Sinclair (Harvard Medical School, Boston, MA, SUA). Resveratrolul a fost dizolvat în etanol sub formă de soluție stoc de 100 mg/ml. Înainte de gavaj, soluția stoc de resveratrol (100 mg/ml) a fost diluată în apă la o concentrație finală de 20 mg/ml. Soluția orală Rapamune (Sirolimus, rapamicină) (1 mg/ml) a fost achiziționată de la Cardinal Health (Syracuse, NY, SUA) și diluată cu PBS conținând 5% Tween-80 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, SUA), 5 % PEG (Sigma-Aldrich) și 4% etanol. Toate tratamentele au fost administrate sub formă de gavaj de 3 ori pe săptămână (o dată la două zile).

Concentrația de insulină în serurile din sânge a fost măsurată folosind kitul ELISA ultrasunetos de insulină (șoarece) (ALPCO Diagnostics, Salem, NH, SUA) conform protocolului fabricantului. Datele au fost analizate folosind o serie de standarde de insulină și potrivirea logistică a patru parametri.

Concentrația IGF-1 în serurile din sânge a fost determinată folosind kitul ELISA IGF-1 (șoarece/șobolan) (ALPCO Diagnostics, Salem, NH) conform protocolului fabricantului. Datele au fost analizate folosind o serie de standarde IGF-1 și potrivirea logistică a patru parametri.

Concentrația trigliceridelor a fost măsurată folosind kitul de testare colorimetrică a trigliceridelor (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, SUA) conform protocolului fabricantului. Datele au fost analizate folosind o serie de standarde de trigliceride și regresie liniară.

Analizele statistice au fost efectuate folosind GraphPad Prizm 5.00 pentru Windows, GraphPad Software, San Diego, CA, SUA, www.graphpad.com '.

Sau (testul t și analizele de corelație (coeficientul Pearson r și valoarea P (două cozi)) au fost efectuate folosind GraphPad Prism versiunea 5.00 pentru Windows, GraphPad Software, San Diego, CA, SUA www.graphpad.com.

Linii telefonice

Celulele HT-p21 derivate din celulele fibrosarcomului uman HT1080 (ATCC, Manassas, VA, SUA), au fost descrise anterior. 47, 59, 60 celule HT-p21 în DMEM cu conținut ridicat de glucoză fără piruvat suplimentat cu ser FC2 (HyClone FetalClone II de la Thermo Scientific, Logan, UT, SUA). În celulele HT-p21, p21 poate fi activat sau dezactivat folosind IPTG. 59 de celule RPE au fost utilizate de noi anterior. 44, 47 Testul HRE-Luc a fost efectuat așa cum s-a descris anterior. 44

Analiza imunoblotului

Celulele au fost lizate în SDS 1%/10 mM Tis.HCl, tampon de liză pH 7,4 și supuse SDS-PAGE utilizând geluri cu gradient minim sau geluri cu gradient Criterion (Bio-Rad, Hercules, CA, SUA), urmate de transfer pe membranele PVDF . După ștergerea cu anticorpii respectivi, petele au fost procesate cu Substrat chemiluminiscent SuperSignal West Pico (Thermo Scientific, Rockford, IL, SUA) și expuse la filmul BioBlot BXR (Laboratory Products Sales, Inc, Rochester, NY, SUA). Antifosfos S6 de iepure (Ser 235/236) și anticorpi anti-S6 de șoarece provin de la Cell Signaling Biotechnology (Danvers, MA, SUA); anticorpii anticiclina de șoarece D1 și anticorpii antiactină de iepure au fost de la Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, SUA) și, respectiv, Sigma-Aldrich. Anticorpii secundari provin din Cell Signaling Biotechnology.

Testarea formării coloniilor

Celulele au fost placate la densitate scăzută, tratate cu un agent care induce senescența (IPTG) timp de 4 zile în prezența sau absența resveratrolului și/sau rapamicinei, așa cum s-a descris anterior. 49 Apoi, medicamentele au fost spălate și celulele au fost incubate în mediu proaspăt fără medicamente timp de 7 zile. Plăcile au fost fixate și colorate cu 1,0% cristal violet. Au fost numărate coloniile.

Viabilitatea replicativă ca măsură a „senescenței cronologice”

Celulele au fost placate la densitate inițială ridicată și cultivate timp de 4 zile așa cum s-a descris anterior. 50 Apoi au fost îndepărtate mediile cu celule plutitoare (celule moarte), celule tripsinizate și o mică parte alicotă de celule atașate a fost înlocuită la densitate celulară mică în plăci cu 6 godeuri în mediu proaspăt. După 6 zile, celulele au fost tripinizate și numărate.

Concentrațiile de acid lactic în mediul de creștere au fost măsurate utilizând setul de testare L-lactat de la Eton Bioscience Inc (San Diego, CA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului.

Mulțumiri

Mulțumim RPCI și Wilmot Center pentru sprijin. Această lucrare a fost finanțată parțial din grantul colaborativ RPCI/Wilmot 2011-12 acordat MV Blagosklonny. De asemenea, este consultant al Tartis-Aging.