* Cui trebuie să i se adreseze corespondența. E-mail: [email protected]

restricția

Afiliere Pennington Biomedical Research Center, Baton Rouge, Louisiana, Statele Unite ale Americii

Afiliere Pennington Biomedical Research Center, Baton Rouge, Louisiana, Statele Unite ale Americii

Afiliere Pennington Biomedical Research Center, Baton Rouge, Louisiana, Statele Unite ale Americii

Afiliere Pennington Biomedical Research Center, Baton Rouge, Louisiana, Statele Unite ale Americii

Afiliere Pennington Biomedical Research Center, Baton Rouge, Louisiana, Statele Unite ale Americii

Afiliere Pennington Biomedical Research Center, Baton Rouge, Louisiana, Statele Unite ale Americii

Afiliere Pennington Biomedical Research Center, Baton Rouge, Louisiana, Statele Unite ale Americii

Afiliere Pennington Biomedical Research Center, Baton Rouge, Louisiana, Statele Unite ale Americii

  • Anthony E Civitarese,
  • Stacy Carling,
  • Leonie K Heilbronn,
  • Mathew H Hulver,
  • Barbara Ukropcova,
  • Walter A Deutsch,
  • Steven R Smith,
  • Eric Ravussin

Cifre

Abstract

fundal

Restricția calorică fără malnutriție extinde durata de viață într-o serie de organisme, inclusiv insecte și mamifere și scade producția de radicali liberi de către mitocondrii. Cu toate acestea, mecanismul responsabil pentru această adaptare este slab înțeles.

Metode și constatări

Analiza biochimică

Grăsimea corporală a fost măsurată prin absorptiometrie cu raze X cu energie dublă (QDA 4500A, Hologics, http://www.hologic.com). Nivelul insulinei serice și al tri-iodotironinei (T3) au fost măsurate folosind teste imuno-testate (DPC 2000, Diagnostic Products Corporation, http://www.dpc.com). Glucoza plasmatică a fost analizată folosind un electrod de glucoză oxidază (Synchron CX7, Beckman, http://www.beckmancoulter.com), în timp ce adiponectina a fost determinată folosind ELISA non-radioactiv (Linco, http://www.lincoresearch.com).

ARNm cuantificarea expresiei genei

Probele de biopsie Vastus lateralis (

150 mg) au fost luate după anestezie locală utilizând tehnica Bergstrom [19]. Grăsimea și țesutul conjunctiv au fost îndepărtate din proba de biopsie, iar mușchii au fost înghețați în azot lichid și depozitați la -80 ° C până la finalizarea studiului. ARN-ul a fost izolat din aproximativ 30 mg de țesut utilizând metoda acid fenol și purificat cu coloane RNeasy (Qiagen, http://www.qiagen.com). ADN-ul a fost extras din aceleași probe de țesut, după degradarea proteinei și ARN-ului cu Trizol, prin extracție cu fenol-cloroform și precipitare cu etanol conform procedurii producătorului (Invitrogen, http://www.invitrogen.com). Amorsele și sondele (Tabelul S1) au fost proiectate folosind Beacon Designer V2.1 (Bio-Rad, http://www.bio-rad.com). Reacțiile qRT (în timp real cantitativ) -PCR au fost efectuate așa cum s-a descris anterior [20]. Toate datele de expresie au fost normalizate prin divizarea genei țintă de RPLPO sau peptidilprolil izomeraza B (PPIB) mARN (care codifică ciclofilina B).

PCR în timp real pentru ADN mitocondrial

Cantitățile relative de ADN nuclear și ADN mitocondrial (ADNmt) au fost determinate prin qRT-PCR așa cum s-a descris anterior [21]. Raportul dintre ADNmt și ADN nuclear reflectă concentrația țesutului de mitocondrii per celulă.

Activități ale enzimelor mitocondriale ale mușchilor scheletici

Activitatea enzimei antioxidante

Lizatele celulare au fost preparate prin sonicare în tampon rece 20 mM HEPES (pH 7,2), conținând EDTA 1 mM, 210 mM manitol și 70 mM zaharoză și centrifugate la 1.500 g timp de 5 minute la 4 ° C. Activitatea totală superoxid dismutază (SOD) (Cu/Zn-, Mn- și Fe-SOD) a fost cantitativă prin măsurarea dismutației radicalilor superoxid generați de xantină oxidază. Activitatea enzimatică a fost determinată de o analiză indirectă, în conformitate cu kitul de analiză Cayman Chemicals disponibil comercial (http://www.caymanchem.com).

Potențialul membranei mitocondriale și masa mitocondrială

Măsurarea potențialului membrană mitocondrială ester etilic al tetrametilrodaminei (TMRE; Molecular Probes, http://probes.invitrogen.com) a fost efectuată așa cum s-a descris anterior [22]. Pentru cuantificarea masei mitocondriale am folosit sonda Mitotracker Green (Molecular Probes). Sonda Mitotracker Green se acumulează preferențial în mitocondrii, indiferent de potențialul membranei mitocondriale și oferă o evaluare exactă a masei mitocondriale. Celulele au fost spălate cu PBS și incubate la 37 ° C timp de 30 de minute cu 100 nM MitoTracker Green FM (Molecular Probes). Celulele au fost recoltate folosind tripsină/EDTA și resuspendate în PBS. Intensitatea fluorescenței a fost detectată cu lungimi de undă de excitație și emisie de 490 și respectiv 516 nm și valorile corectate pentru proteina totală (mg/ml).

Cultura celulelor musculare scheletice

Biopsii musculare Vastus lateralis (

100 mg) au fost obținute de la cinci indivizi sănătoși, cu greutate normală, tineri, sedentari (indice de masă corporală = 24,1 ± 0,5 kg/m 2; grăsime corporală = 15% ± 1%; concentrație de glucoză în repaus alimentar = 88 ± 2 mg/dl; insulină plasmatică în repaus alimentar = 4,4 ± 0,9 μU/ml). Celulele satelit au fost izolate așa cum s-a descris anterior [23]. Celulele au fost însămânțate în plăci cu 12 godeuri (ARN/ADN) și șase godeuri (proteină) la o densitate de 20 × 103 celule/cm2. Celulele au fost cultivate la 37 ° C într-o atmosferă umidificată cu 5% CO2. Două perechi de ARN-uri interferente mici (si) au fost sintetizate chimic (Invitrogen), recocite și transfectate (200 pmol/ml) în miocite umane primare confluente 50% -70% folosind reactivi de transfecție GeneSilencer siRNA (Gene Therapy Systems, http: //www.genetherapysystems.com). Secvențele siARN-urilor de sens sunt după cum urmează; AdipoR1, 5'-AAACAGCACGAAACCAAGCAGAUGG-3 '; AdipoR2, 5′-AUGUCCCACUGGGAGACUAUAAUGG-3 ′. Celulele transfectate cu siRNA (simulat) ne-funcțional (Ambion, http://www.ambion.com) au fost utilizate ca martori negativi (date nepublicate). Diferențierea mioblastelor în miotuburi a fost inițiată așa cum s-a descris anterior [23]. La 72 de ore după inducerea diferențierii, mediul a fost schimbat și tratat fie cu adiponectină globulară de mamifer timp de 48 de ore (R&D Systems, Minneapolis, MN, SUA), fie cu un donator de oxid nitric - 50 μM de 2,2 ′ - (hidroxinitrosohidrazono) bis- etanimină (DETA-NU) (Sigma, http://www.sigmaaldrich.com) - o dată pe zi timp de 4 zile [7,24].

Metode statistice

Datele sunt exprimate ca medii ± erori standard ale mediei. Analiza datelor a fost efectuată folosind SAS v. 9.1 (http://www.sas.com). Modificările de la momentul inițial la luna a 6-a au fost analizate prin analiza covarianței cu tratament și interacțiuni în timp și valoarea inițială inclusă ca covariantă. În experimentele de cultură celulară, s-au folosit teste t pentru a determina efectul tratamentului. Corelațiile Pearson sau Spearman au fost utilizate acolo unde a fost cazul. Datele au fost considerate semnificative dacă p Tabelul 1.

Caracteristicile metabolice ale subiecților care finalizează studiul (n = 36)

Glucoza de post nu a fost modificată în niciunul dintre grupuri, unde insulina de post a fost redusă semnificativ față de valoarea inițială în grupurile CR și CREX (Tabelul 1), în concordanță cu o îmbunătățire așteptată a sensibilității la insulină [26-28]. Importanța potențială a adiponectinei ca mediator al efectelor restricției calorice este subliniată de studii efectuate la rozătoare [29] și oameni [30], demonstrând că restricția calorică îmbunătățește sensibilitatea la insulină în paralel cu o creștere a adiponectinei circulante. În studiul nostru, adiponectina plasmatică totală a avut tendința de a crește în ambele grupuri de intervenție cu 17% ± 1% în CR și 7% ± 1% în CREX (Tabelul 1), posibil datorită dimensiunii reduse a eșantionului și/sau reglării diferențiale a forme de adiponectină.

Restricția calorică crește conținutul mitocondrial la nivelul mușchilor scheletici

Șase luni de restricție calorică au determinat o creștere a nivelurilor de expresie ale TFAM (principalul factor de transcripție implicat în reglarea transcripției ADNmt) și PPARGC1A (Figura 1A și 1B), sugerând o inducere a biogenezei mitocondriale. În mod consecvent, a existat o inducție semnificativă a conținutului de ADNmt (un marker pentru masa mitocondrială [31,32]) în grupurile CR (35% ± 5%; p = 0,005) și CREX (21% ± 4%; p = 0,004) cu nicio modificare în grupul de control (2% ± 2%) (Figura 2A). Cu toate acestea, în cele trei grupuri, nu am observat nicio modificare a conținutului de proteine ​​citrat sintază, un alt marker al masei mitocondriale (date nepublicate). Activitatea beta-hidroxiacil-CoA dehidrogenazei (o măsură a β-oxidării), a citratului sintază (o măsură a activității ciclului TCA) și a citocromului C oxidază II (o măsură a activității lanțului de transport al electronilor) nu s-a modificat ca răspuns la CR sau CREX (Figura 2B).

(A) TFAM: * CR, p = 0,001; # CREX, p = 0,014.

(B) PPARGC1A: * CR, p = 0,004; # CREX, p = 0,002.

(C) SIRT1: * CR, p = 0,016; # CREX, p = 0,023.

(D) eNOS: * CR, p = 0,002; # CREX, p = 0,039.

Graficele arată schimbări de șase luni în expresia enzimei ca răspuns la fiecare intervenție. Axa y reprezintă modificarea relativă a expresiei genei de la linia de bază pentru fiecare grup de studiu. Fiecare grafic de cutie arată distribuția nivelurilor de expresie de la percentila 25 la 75, iar liniile din interiorul casetelor denotă medianele. Mustățile indică intervalul dintre percentilele 10 și 90. Cercurile umplute marchează punctele de date din afara percentilelor 10 și 90. Analiza moleculară a fost efectuată la 11 din 12 voluntari pe grup din care a existat suficient eșantion pre și postintervenție pentru această determinare. Modificările de la momentul inițial la luna a 6-a au fost analizate prin analiza varianței cu valorile inițiale incluse ca covariabile.

(A și B) Fiecare grafic de cutie arată distribuția nivelurilor de expresie de la percentila 25 la 75 și liniile din interiorul casetelor denotă medianele. Mustățile indică intervalul dintre percentilele 10 și 90. Cercurile umplute marchează punctele de date din afara percentilelor 10 și 90. (A) Biogeneza mitocondrială indusă de deficit caloric în grupul CR (35% ± 5%, * p = 0,005) și în grupul CREX (21% ± 4%, # p Figura 3. Diagramele punctelor statistice care arată efectele DETA- Tratamentul cu NO și adiponectină asupra conținutului mitocondrial și proteinei SIRT1 în miotuburile umane primare

(A - C) Efecte ale tratamentului DETA-NO de 96 h de 50 μM asupra conținutului mitocondrial (folosind MitoTracker Green, p = 0,002) (A), activitatea lanțului de transport al electronilor (COX, p = 0,018) (B) și membrana mitocondrială potențial (TMRE, n = 6, p = 0,042) (C). Efectul tratamentului a fost determinat folosind eșantion t-test independent. OD, densitate optică.

(D) Efectele 50 μM DETA-NO asupra proteinei SIRT1 și β-actină (top blots); efectele a 0,5 μg/ml de adiponectină globulară (gAD) și receptorul adiponectinei R1- și R2-siARN pe expresia proteinei SIRT1 și β-actină (pete de fund). Imunoblotarea a fost efectuată la trei participanți, iar datele sunt prezentate ca o pată reprezentativă. Mijloacele sunt notate prin bare negre solide.

Semnalizarea adiponectinei crește proteina SIRT1

Examinarea ARNm SIRT1 (date nepublicate) și conținutul de proteine ​​(Figura 3D, partea de sus) în celulele tratate cu DETA-NO nu au demonstrat nicio diferență față de celulele netratate. Cu toate acestea, un tratament 2-d al miotuburilor umane cu 0,5 μg/ml adiponectină globulară a crescut proteina SIRT1 (Figura 3D, de jos), dar nu a avut niciun efect asupra ARNm SIRT1 (date nepublicate), indicând reglarea post-transcripțională. Dărâmarea expresiei genice a receptorului adiponectinei (izoformele -R1 și -R2) de către ARNsi a atenuat creșterea proteinei SIRT1 indusă de adiponectină în miotuburile umane primare (Figura 3D, jos).

Discuţie

Studiul actual a investigat impactul restricției calorice asupra funcției mitocondriale musculare la oamenii sănătoși supraponderali, dar non-obezi. Studiul oferă, după cunoștințele noastre, primele dovezi că un deficit caloric de 25% fie prin restricție calorică singură, fie printr-o combinație de restricție calorică și exerciții fizice a scăzut 24 ore EE și a îmbunătățit funcția mitocondrială. Analiza moleculară a relevat faptul că CR și CREX au crescut expresia genelor implicate în detectarea nutrienților și a biogenezei mitocondriale, precum și creșterea masei mitocondriale fără o schimbare a activității enzimelor cheie mitocondriale implicate în ciclul Krebs, β-oxidarea și activitatea lanțului de transport al electronilor. . Cu toate acestea, restricția calorică a scăzut markerii stresului oxidativ. Rezultatele noastre sugerează că restricția calorică induce biogeneza mitocondriilor „eficiente” ca mecanism adaptativ, care la rândul său scade stresul oxidativ.

Restricția calorică îmbunătățește eficiența metabolică a întregului corp și scade markerii stresului oxidativ

O explicație propusă pentru efectele benefice ale restricției calorice este consumul redus de oxigen, care la rândul său scade producția mitocondrială de ROS [33]. Cu toate acestea, studiile publicate au avut rezultate contradictorii. La primatele sănătoase, zece până la 11 ani de restricție calorică scad EE în repaus, dincolo de scăderea atribuită pierderilor în FFM și în masa de grăsime [34,35]. La rozătoare, rapoartele au fost mai divizive cu scăderea, nicio modificare sau creșterea EE ca răspuns la restricția calorică [7,36-39]. La om arătăm acum că restricția calorică pe termen scurt cu sau fără exerciții fizice reduce masa grasă, FFM și EE absolută de 24 de ore. Cu toate acestea, după corectarea modificărilor FFM și a masei de grăsime, EE de 24 de ore a fost încă redusă de CR sau CREX, sugerând că deficitul de energie, mai degrabă decât restricția calorică în sine, a cauzat creșterea eficienței energetice. Aceste rezultate sunt în concordanță cu studiile efectuate la indivizi obezi și slabi, în care sa raportat o reducere de 10% -15% a necesității de energie pentru menținerea greutății după ajustarea pentru FFM [40].

Prin urmare, este de așteptat ca îmbunătățirea consumului de oxigen din întregul corp să scadă producția de ROS, un produs secundar normal al fosforilării oxidative. ROS se formează prin transfer unic de electroni către oxigen generând radicali superoxici (O2 • -), peroxid de hidrogen (H2O2) și radicali hidroxilici (OH •) [3,41]. ROS reacționează cu ADN, proteine ​​și lipide, ducând la deteriorarea oxidativă. Studiile anterioare au arătat că restricția calorică scade scurgerile de protoni și deteriorarea stresului oxidativ [33,42]. Conținutul mitocondrial scăzut pare să contribuie la creșterea producției de ROS [41]. Când masa mitocondrială este redusă, mitocondriile au crescut „volumul de muncă”, ducând la un potențial mai mare al membranei și la creșterea producției de ROS [3,6,7,41]. Creșterea masei mitocondriale ca răspuns la restricția calorică poate fi, prin urmare, un important mecanism adaptativ pentru reducerea stresului oxidativ fără o scădere necesară a respirației celulare [6,8]. În studiul nostru, deteriorarea ADN-ului a fost redusă față de valoarea inițială atât la participanții CR, cât și la participanții la CREX, cu o tendință spre o activitate SOD mai mică. Aceste date sunt în concordanță cu ipoteza că restricția calorică induce proliferarea mitocondriilor eficiente și reduce deteriorarea oxidativă a ADNmt și a organitelor celulare.

Restricția calorică îmbunătățește funcția mitocondrială

Restricția calorică crește expresia genelor implicate în biogeneza mitocondrială și detectarea nutrienților

La rozătoare, expresia SIRT1 este crescută ca răspuns la restricția calorică prelungită în țesutul adipos, hepatic, renal și cerebral [7,54]. Se știe că SIRT1 leagă, deacetilează și activează PPARGC1A, promovând astfel biogeneza mitocondrială [11]. Astfel de rezultate ridică posibilitatea ca SIRT1 să îmbunătățească funcția mitocondrială și să reducă daunele oxidative la om. În sprijinul acestui concept, mARN-ul SIRT1 a fost crescut în grupurile CR și CREX proporțional cu creșterea mARN-ului PPARGC1A, în concordanță cu rolul potențial al SIRT1 ca regulator direct al activității PPARGC1A [11,14]. Am observat o inducție mai mică în biogeneza mitocondrială și ARNm SIRT1 în CREX în raport cu grupul CR. Disparitatea în adaptarea moleculară între grupurile CR și CREX poate fi legată de activitatea SIRT1 și de raportul NAD +/NADH, care oscilează în funcție de rata glicolizei [55] și în timpul exercițiului submaximal [56]. Acest lucru ar putea fi de așteptat să schimbe activitatea SIRT1 și transcrierea genei. În schimb, exercițiul aerob poate îmbunătăți în mod independent eficiența metabolică musculară [57,58] printr-o creștere stimulată de contracție a biogenezei mitocondriale [59] și expresia genelor care codifică proteinele implicate în funcția mitocondrială, inclusiv PPARGC1A, PPAR-δ și PGC-1- coactivator asociat [17.60].

Adiponectina induce expresia proteinei SIRT1

O opinie larg acceptată este că restricția calorică pe termen lung îmbunătățește fosforilarea oxidativă mitocondrială [6], prin urmare scade producția de ROS și daunele oxidative. Am arătat, după cunoștințele noastre pentru prima dată, că la oamenii supraponderali non-obezi, restricția calorică pe termen scurt reduce cheltuielile de energie ale întregului corp (adaptare metabolică), în paralel cu o inducere a biogenezei mitocondriale, PPARGC1A și SIRT1 mARN, și o scădere în deteriorarea ADN-ului. Prin urmare, propunem că restricția calorică induce biogeneza mitocondriilor „eficiente” în mușchii scheletici umani ca mecanism adaptativ, care la rândul său scade stresul oxidativ.