Dovezi privind rarefacția, chimiotaxia macrofagelor și inflamația fără răspuns angiogen

  1. Magdalena Pasarica,
  2. Olga R. Miercuri,
  3. Leanne M. Redman,
  4. Diana C. Albarado,
  5. David T. Hymel,
  6. Laura E. Roan,
  7. Jennifer C. Rood,
  8. David H. Burk și
  9. Steven R. Smith
  1. De la Pennington Biomedical Research Center, Baton Rouge, Louisiana
  1. Autor corespondent: Steven R. Smith, smithsrpbrc.edu

Dovezi privind rarefacția, chimiotaxia macrofagelor și inflamația fără răspuns angiogen

Abstract

OBIECTIV- Pe baza studiilor de rozătoare, am examinat ipoteza că masa crescută a țesutului adipos (AT) la obezitate fără un sprijin adecvat al vascularizației ar putea duce la hipoxie, infiltrare de macrofage și inflamație.

reducerea

PROIECTARE ȘI METODE DE CERCETARE— Presiunea parțială a oxigenului (AT pO2) și temperatura AT la AT abdominal (9 bărbați și femei slabe și 12 supraponderali/obezi) au fost măsurate prin inserarea directă a unui electrod polarografic Clark. Compoziția corpului a fost măsurată prin absorptiometrie cu raze X cu energie dublă, iar sensibilitatea la insulină a fost măsurată prin clemă hiperinsulinemică-euglicemică. Țesutul subcutanat abdominal a fost utilizat pentru colorare, RT-PCR cantitativă și testarea secreției de chemokine.

REZULTATE— AT pO2 a fost mai mic la subiecții supraponderali/obezi decât la subiecții slabi (47 ± 10,6 vs. 55 ± 9,1 mmHg); cu toate acestea, acest nivel de pO2 nu a activat țintele clasice de hipoxie (piruvat dehidrogenază kinază și factorul de creștere endotelial vascular [VEGF]). AT pO2 a fost corelat negativ cu procentul de grăsime corporală (R = -0,50, P 2) sau supraponderal/obez (27-35 kg/m 2). Recrutarea a fost efectuată prin hârtie de ziar, cărți poștale și pagina web a Pennington Biomedical Research Center (PBRC). Subiecții au fost excluși dacă au avut afecțiuni renale, cardiace, hepatice, pulmonare sau neurologice semnificative. Hipertensiunea arterială a fost acceptabilă dacă tensiunea arterială a fost de 2 pe minut) a fost continuată timp de 3-4 ore. Insulina a fost perfuzată timp de cel puțin 1 oră după atingerea unei concentrații de glucoză ∼90 mg/dl. Glucoza plasmatică a fost măsurată la fiecare 5 minute și menținută printr-o infuzie variabilă de 20% glucoză. Rata medie a perfuziei exogene de glucoză în timpul stării de echilibru (ultimele 30 de minute) a fost corectată pentru modificările glicemiei și împărțită la masa fără grăsimi pentru a evalua sensibilitatea la insulină.

Măsuri de laborator.

Următoarele analize au fost făcute pe sânge prelevat după un post peste noapte. Glucoza a fost analizată folosind un Beckman Coulter DXC 600 Pro (Brea, CA) și insulină prin test imunologic pe Siemens Immulite 2000 (Siemens, Los Angeles, CA).

AT biopsie.

Pielea a fost anesteziată cu un amestec de lidocaină (2%) și bupivocaină (0,025%). AT a fost obținut folosind un ac cu capăt contondent conceput pentru liposucție (ac de liposucție „mercedes” cu diametrul de 3 până la 4 mm; MD Resource, Hayward, CA) și prelucrat la noptieră prin spălare în PBS la 37 ° C și fixare congelată sau conservată în 10% formalină pentru blocarea parafinei. Biopsiile obținute de la primii 14 subiecți completați (8 subiecți de sex feminin și 6 de sex masculin) au fost folosiți pentru următoarele proceduri.

Eliberarea AT pe termen scurt a citokinelor.

După cum s-a descris anterior (16), AT proaspăt a fost colectat în mediu pre-gazat la 37 ° C 199 și tocat în fragmente de 2 până la 5 mg și spălat pe o plasă de nailon. Alicote au fost incubate timp de 3 ore în mediu 199 conținând 1% BSA sub o atmosferă de 95% O2 până la 5% CO2 într-o baie de apă agitată (60 cicluri/min, 37 ° C).

MIP1α (chemokină [motiv C-C] ligand 3), VEGF, TNFα, leptină, IL1α și proteina chemotactică monocitică-1 au fost măsurate în mediul condiționat utilizând sistemul Luminex (nr. Cat. HCYT060K03; MIllipore). Mediul condiționat a fost testat pentru lactat dehidrogenază și a confirmat absența lizei celulare. Din 14 subiecți, 1 subiect nu a avut țesut de biopsie pentru test (din cauza limitărilor tehnice) și 1 subiect a avut testul compromis în timpul procesării și, prin urmare, nu a putut fi utilizat. Ulterior, eliberarea de citokine a fost măsurată la 12 subiecți (5 slabi și 7 supraponderali/obezi, dintre care 5 erau bărbați și 7 erau femei). Concentrațiile mediului condiționat de VEGF, TNFα și leptină au fost sub nivelul de detecție al testului (datele nu sunt prezentate).

Densitatea capilară.

RT-PCR cantitativ.

ARN-ul total uman din ± 100 mg AT a fost izolat prin purificare pe coloană (Qiagen). Toți primerii și sondele au fost proiectate utilizând versiunea 2.1 a Primer Express (Applied Biosystems). Secvențele primerilor și sondelor sunt prezentate într-un tabel suplimentar. Leptina și GLUT1 provin de la ABI (nr. Cat. Hs00174877_m1, Hs00197884_m1). ARNm GLUT1 nu a fost detectabil în probele AT. RT-PCR cantitative în timp real (qRT-PCR) (19) au fost efectuate ca reacții într-o etapă în ABI PRISM 7900 (Applied Biosystems) utilizând următorii parametri: un ciclu de 48 ° C timp de 30 de minute, apoi 95 ° C timp de 10 min, urmate de 40 de cicluri la 95 ° C timp de 15 s și 60 ° C timp de 1 min. Metoda relativă a curbei standard a fost utilizată pentru a calcula cantitatea de genă țintă pentru fiecare extract de țesut cu un control intern. S-a demonstrat anterior că „gena menajului” ciclofilina B este „stabilă” la subiecții slabi și obezi (20-22). Prin urmare, fiecare valoare a probei a fost împărțită la cantitatea de ciclofilină B așa cum s-a descris anterior (20-23).

Dimensiunea adipocitelor.

Dimensiunea medie a adipocitelor a fost măsurată așa cum s-a descris anterior (24). Țesutul a fost fixat în tetroxid de osmiu. Disocierea și digestia proteinelor s-au efectuat cu 8 mol/l uree/NaCI. Celulele au fost filtrate pe un ecran de nailon de 10 µm apoi recoltate într-o soluție Triton X-100. Aproximativ 2.500 de celule din fiecare probă au fost analizate pe un contor Coulter folosind o deschidere de 400 μm.

metode statistice.

Comparația dintre subiecții slabi și supraponderali/obezi a fost efectuată folosind un test t nepereche. Semnificația statistică a fost definită în raport cu o rată nominală de eroare de 5% de tip 1. Valorile sunt prezentate ca medii ± SD. Toate analizele au fost efectuate în JMP (versiunea 5.0.1; SAS, Cary, NC).

REZULTATE

Caracteristicile subiectului.

AT pO2 și temperatura AT sunt invers corelate cu procentul de grăsime corporală. AT pO2, măsurată prin inserția directă a unui electrod de tip micro Clark în AT subcutanat abdominal, a fost mai mică în grupul supraponderal/obez (O/O) comparativ cu subiecții slabi (A) și invers corelată cu procentul de grăsime corporală (B). Temperatura AT măsurată de un termocuplu introdus în AT abdominală a fost invers corelată cu procentul de grăsime corporală (C). Bărbații sunt reprezentați de pătrate și femelele de cercuri, umplute cu diferite culori după cum urmează: alb pentru slab, gri pentru O/O fără diabet de tip 2 și negru pentru O/O cu diabet de tip 2.

Vascularizația AT. Secțiuni reprezentative AT de la subiecții slabi (A) și O/O (B) colorate cu lectină UEA (portocaliu) pentru a marca capilarele și cu lectină GS (verde) pentru a marca plasmalema adipocitelor. Densitatea capilară (C) a fost măsurată și mediată pe 6-10 secțiuni histologice pentru fiecare subiect și expresia mRNA VEGF măsurată prin RT-PCR cantitativă (D); ambele au fost mai mici la O/O comparativ cu subiecții slabi. ARNm VEGF a fost corelat pozitiv cu densitatea capilară (E) și PPARy1 mARN (G) și invers cu procentul de grăsime corporală (F). H: ARNm colagen VI (COL6) a fost corelat negativ cu AT pO2. Bărbații sunt reprezentați de pătrate și femelele de cercuri, umplute cu diferite culori după cum urmează: alb pentru slab, gri pentru O/O fără diabet de tip 2 și negru pentru O/O cu diabet de tip 2. (Vă rugăm să consultați http://dx.doi.org/10.2337/db08-1098 pentru o reprezentare digitală de înaltă calitate a acestei figuri.)

Hipoxie și inflamație AT. AT pO2 a fost invers corelat cu markerii de inflamație CD68 mARN (A) și MAC 2/CD163 mARN (B), cu expresia mRNA (C) a chemokinei MIP1α și secreția MIP1α în mediul de cultură ex vivo (D). Studiile anterioare din laboratorul nostru au demonstrat o corelație puternică între ARNm MAC2/CD163 și CD68 și infiltrarea macrofagelor prin colorarea macrofagelor în secțiuni AT prin imunohistochimie (R 2 = 0,77, P Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up

Caracteristicile clinice ale populației studiate