Abstract

Dezvoltarea rezistenței la insulină periferică este o caracteristică importantă a diabetului de tip 2 (1,2). Mușchiul scheletic, reprezentând> 75% din eliminarea glucozei în starea postprandială (1) reprezintă o țintă terapeutică atractivă pentru prevenirea acestei boli. Mecanismul prin care insulina mărește absorbția glucozei în mușchi implică translocarea transportorului glucozei sensibil la insulină GLUT4 dintr-un loc de stocare intracelular către membrana plasmatică și tubulii T (3-5). S-a dovedit că translocația GLUT4 este defectă la nivelul mușchilor scheletici la subiecții diabetici insulino-rezistenți și de tip 2 (6-8). Insulina stimulează translocația GLUT4 prin activarea receptorului activității sale tirozin kinazei intrinseci către substraturi intracelulare (5). În mușchiul scheletic, acest lucru duce la fosforilarea tirozinei substratului receptorului de insulină (IRS) -1 și IRS-2 conducând la recrutarea și activarea 3-kinazei fosfatidilinozitol (PI), o enzimă cheie în reglarea transportului glucozei stimulat de insulină (9).

proteina

Identificarea efectorilor din aval de PI 3-kinază implicați în reglarea transportului glucozei face obiectul unei investigații intense. Acestea includ serina/treonina kinaze Akt (denumită și protein kinază B [PKB]) și protein kinază C atipică (aPKC). Dovezi ale implicației atât a Akt cât și aPKC în reglarea insulino-dependentă a transportului glucozei în celulele musculare provine din studii de transfecție folosind fie kinază inactivă, fie supraexprimare/forme constitutiv active ale kinazelor (10-13). În timp ce un defect în activarea insulinei PI-kinazei este bine stabilit la mușchiul animalelor rezistente la insulină (14-17), rolul potențial al oricărui Akt al aPKC în patogeneza rezistenței la insulină rămâne slab definit. Folosind șobolanul bogat în grăsimi ca model de rezistență la insulină legată de obezitate, am descoperit recent că acțiunea insulinei atât asupra activităților kinazice Akt, cât și aPKC sunt tocite în mușchiul scheletic al acestor șobolani (14). Aceste afectări ale semnalizării insulinei au fost asociate cu o abrogare completă a translocației GLUT4 stimulate de insulină atât la membrana plasmatică, cât și la domeniile tubulilor T de pe suprafața celulei musculare (14).

Se depun mult efort pentru a găsi noi abordări terapeutice pentru a depăși rezistența la insulină la om. S-a dovedit că intervențiile dietetice sunt o tactică utilă și eficientă pentru sensibilizarea țesuturilor țintă la insulină la animale (18). De exemplu, sa demonstrat că acizii grași polinesaturați ω-3 derivați din pești îmbunătățesc sensibilitatea la insulină la șobolanii hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (19). Mai recent, am investigat efectele proteinelor dietetice asupra sensibilității la insulină în obezitatea indusă de dietă. Am constatat că proteinele de cod din dietă, dar nu cazeina sau proteina din soia, au împiedicat dezvoltarea rezistenței la insulină a întregului corp prin normalizarea absorbției de glucoză stimulată de insulină în mușchii șobolanilor cu conținut ridicat de grăsimi. Acest lucru a fost observat în ciuda creșterii în greutate corporală, a adipozității și a expresiei TNF-α similare atât în ​​țesutul adipos, cât și în mușchiul scheletic din diferitele grupuri dietetice (20).

Prin urmare, acest studiu a fost întreprins pentru a clarifica mecanismele celulare din spatele acțiunii sensibilizatoare la insulină a proteinei de cod la șobolanii obezi cu conținut ridicat de grăsimi. Mai specific, am testat ipotezele conform cărora proteina de cod previne rezistența la insulină a mușchilor scheletici prin 1) îmbunătățirea semnalizării insulinei către PI 3-kinază, Akt și aPKC, 2) creșterea expresiei proteinei GLUT4 și/sau 3) îmbunătățirea translocației GLUT4 către suprafața celulelor musculare.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Materiale.

Tratamentul animalelor.

Clemă hiperinsulinemică-euglicemică și injecție trasoare.

Stimularea acută a insulinei.

Șobolanii care au postit peste noapte au fost injectați fie cu soluție salină, fie cu insulină (8 unități/kg) timp de 4 minute, așa cum s-a descris anterior (4). Mușchii au fost excizați rapid și înghețați imediat în azot lichid. Mușchii Gastrocnemius au fost omogenizați în șase volume de tampon de liză (20 mmol/l Tris, pH 7,5, 140 mmol/l NaCI, 1 mmol/l CaCl2, 1 mmol/l MgCl2, 10% glicerol, 10 mmol/l pirofosfat de sodiu, 10 mmol/l NaF, 2 mmol/l Na3VO4, 2 mg/ml benzamidină și 1 mmol/l PMSF) și inhibitori de protează cocktail. S-a adăugat acid okadaic (100 nmol/l) în tampon de liză pentru activitățile kinazice Akt și aPKC. Omogenatele musculare au fost solubilizate în 1% NP-40 timp de 1 oră la 4 ° C și centrifugate la 14.000 g timp de 10 min. Supernatantul a fost utilizat pentru studii de semnalizare a insulinei așa cum este descris mai jos.

Fosforilarea tirozinei a receptorului de insulină și a IRS.

Lizatele musculare (1 mg de proteină) au fost imunoprecipitate cu 2 μg de anti-fosfotirozină (4G10) cuplată cu proteina A-Sepharose peste noapte la 4 ° C. Complexul imun a fost spălat de trei ori în PBS (pH 7,4) conținând 1% NP-40 și 2 mmol/l Na3VO4, resuspendat în tampon Laemmli și fiert timp de 5 minute. Proteinele au fost rezolvate pe SDS-PAGE (gel 6%) și procesate pentru analiza Western blot.

Activitatea PI 3-kinazei.

Lizatul muscular (1 mg de proteină) a fost imunoprecipitat cu 2 μg de anti-IRS-1 cuplat cu proteina A-Sefaroză peste noapte la 4 ° C. Complexul imunitar a fost spălat de două ori cu Wash I (PBS, pH 7,4, 1% NP-40 și 2 mmol/l Na3VO4), de două ori cu Wash II (100 mmol/l Tris, pH 7,5, 500 mmol/l LiCl și 2 mmol/l Na3VO4) și de două ori cu Wash III (10 mmol/l Tris, pH 7,5, 100 mmol/l NaCI, 1 mmol/l EDTA și 2 mmol/l Na3VO4). Margelele au fost resuspendate în 70 μl de tampon kinazic (8 mmol/l Tris, pH 7,5, 80 mmol/l NaCI, 0,8 mmol/l EDTA, 15 mmol/l MgCl2, 180 μmol/l ATP și 5 μCi [γ- 32 P] ATP) și 10 μl amestec sonic PI (20 μg l -α-PI, 10 mmol/l Tris, pH 7,5 și 1 mmol/l EGTA) timp de 15 minute la 30 ° C. Reacția a fost oprită prin adăugarea de 20 pl 8 moli/l HCI, amestecată cu 160 pl CHCI3: CH3OH (1: 1) și centrifugată. Faza organică inferioară a fost reperată pe placă TLC cu silicagel tratată cu oxalat și dezvoltată în CHCI3: CH3OH: H2O: NH4OH (60: 47: 11,6: 2). Placa a fost uscată și vizualizată prin autoradiografie cu ecran de intensificare la -80 ° C.

Act/PKB activitate.

Lizatul muscular (1 mg de proteină) a fost imunoprecipitat cu 4 μg de anti-Akt 1/2 cuplat la proteina G-Sepharose timp de 4 ore la 4 ° C. Complexul imun a fost spălat de două ori cu Wash I (PBS, pH 7,4, 1% NP-40 și 100 μmol/l Na3VO4) și de două ori cu Wash II (50 mmol/l tris, pH 7,5, 10 mmol/l MgCl2 și 1 mmol/l TDT). Margelele au fost resuspendate în 30 μl de tampon kinază (50 mmol/l Tris, pH 7,5, 10 mmol/l MgCl2, 1 mmol/l DTT, 8 μmol/l ATP, 2 μCi [γ- 32 P] ATP și 50 μmol/l Crosstide) timp de 30 de minute la 30 ° C. Produsul de reacție a fost rezolvat pe un gel de acrilamidă 40% și vizualizat prin autoradiografie cu ecran de intensificare la -80 ° C.

Activitate PKC atipică (ζ/λ).

Lizatul muscular (1 mg de proteină) a fost imunoprecipitat cu 2 μg de anti-PKC (ζ/λ) peste noapte la 4 ° C, apoi complexul imun a fost colectat pe proteina A/G-Sepharose timp de 2 ore. Margelele au fost spălate de două ori cu Wash I (PBS, pH 7,4, 1% NP-40 și 2 mmol/l Na3VO4), de două ori cu Wash II (100 mmol/l Tris, pH 7,5, 500 mmol/l LiCl și 100 μmol/l Na3VO4) și de două ori cu Wash III (50 mmol/l Tris, pH 7,5, 10 mmol/l MgCl2 și 100 μmol/l Na3VO4). Margelele au fost resuspendate în 30 μl de tampon kinazic (50 mmol/l Tris, pH 7,5, 10 mmol/l MgCl2, 40 μmol/l ATP, 5 μCi [γ- 32 P] ATP și 5 μg proteină bazică mielină) pentru 12 min la 30 ° C. Reacția a fost oprită prin adăugarea de tampon Laemmli și încălzită timp de 30 de minute la 37 ° C. Produsul de reacție a fost rezolvat pe 13% SDS-PAGE. Gelul a fost uscat și vizualizat prin autoradiografie cu ecran de intensificare la -80 ° C.

Fracționarea subcelulară.

Membranele plasmatice, tubulii transversi (tubulii T) și membranele intracelulare îmbogățite cu GLUT4 au fost izolate din 8-10 g de mușchi (gactrocnemie și cvadriceps mixte) folosind o procedură dezvoltată în laboratorul nostru (4,22). Acest protocol de fracționare subcelulară a fost caracterizat pe larg cu markeri imunologici și enzimatici (4,22). Pe scurt, această tehnică permite izolarea simultană și separată a membranelor plasmatice, a tubulilor T și a veziculelor cu membrană intracelulară din același omogenizat muscular. Conținutul de GLUT4 a fost determinat în fracții obținute de la șobolani cu soluție salină sau insulină prin Western blot, așa cum s-a descris anterior (14). Caracterizarea fracțiunilor de membrană este prezentată în Tabelul 1 și Fig. 6A și sunt de acord cu studiile noastre anterioare (4.22).

Analiza Western blot.

Membranele (10 μg) sau omogenatele musculare (50 μg) au fost supuse SDS-PAGE (gel 7,5%) și transferate electroforetic la membranele filtrante de poliviniliden difluorură (PVDF) timp de 2 ore. Membranele PVDF au fost apoi blocate timp de 1 oră la temperatura camerei cu tampon I (50 mmol/l Tris-HCI, pH 7,4, 150 mmol/l NaCI) conținând 0,04% NP-40, 0,02% Tween-20 și 5% lapte degresat, urmată de incubare peste noapte la 4 ° C cu anticorpi primari așa cum este descris în figurile legendelor. Membranele PVDF au fost apoi spălate timp de 30 de minute, urmate de o incubare de 1 oră cu imunoglobulină G anti-șoarece sau anti-iepure conjugată cu peroxidază de hrean în tampon I conținând 1% BSA. Membranele PVDF au fost spălate timp de 30 de minute în tamponul I, iar benzile imunoreactive au fost detectate prin metoda de chemiluminescență îmbunătățită. Un standard muscular (o fracție de membrană brută fără legătură) a fost rulat pe fiecare gel pentru compararea probelor de la diferiți imunobloti.

Analiza datelor.

Autoradiografiile au fost analizate prin densitometrie cu scanare laser folosind un scaner Agfa de masă (Arcus II; Agfa-Gavaert, Morstel, Belgia) și cuantificate cu programul National Institutes of Health Image (WEB: rsb.info.nih.gov/nih-image/) . Datele sunt prezentate ca mijloace ± SE. Efectele proteinelor alimentare au fost comparate de ANOVA. Diferențele au fost considerate semnificative statistic la injecția cu P d - [3 H] glucoză. Viteza de perfuzie a glucozei mediată de insulină, care era necesară pentru menținerea euglicemiei, a fost semnificativ mai mică (P -1 -1 min -1). Acțiunea insulinei din corpul întreg la șobolanii obezi cu conținut ridicat de grăsimi care consumă proteine ​​de cod s-a dovedit a fi similară cu cea observată în grupul slab de referință hrănit cu chow (16,9 ± 2,0 mg · kg -1 -1 min -1). Absorbția glucozei stimulată de insulină la mușchii gastrocnemius și cvadriceps la șobolani obezi cu conținut ridicat de grăsimi a fost, de asemenea, semnificativ mai mare (P -1 -1 min -1) și similară cu cea observată la șobolanii hrăniți cu chow (112,8 ± 13,5 nmol · g -1 · Min -1). Viteza de perfuzie a glucozei și absorbția de glucoză în 2-deoxid-d - [3H] nu au fost semnificativ diferite între animalele hrănite cu cazeină și proteine ​​din soia. Absorbția bazală a glucozei în mușchi a fost măsurată după injectarea trasorului la capătul clemei saline și sa dovedit a fi neafectată de sursa proteinelor alimentare (datele nu sunt prezentate).

Efectul proteinelor dietetice asupra receptorilor de insulină și fosforilării tirozinei substrat-1 a receptorului de insulină.

Am examinat mai întâi dacă proteina de cod își exercită acțiunea benefică asupra sensibilității la insulină musculară prin creșterea fosforilării tirozinei a receptorului de insulină și a proteinelor IRS, etapele mai proximale ale propagării semnalului insulinei către efectorii din aval (5). O injecție in vivo de insulină a indus o creștere mare a conținutului de fosfotirozină atât al receptorului de insulină (Fig. 1A și B), cât și al proteinelor IRS (Fig. 1A și C) la mușchii șobolanilor hrăniți cu chow. Efectul stimulator al insulinei asupra fosforilării tirozinei IR/IRS a fost similar la șobolanii care au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi, indiferent de sursa de proteine ​​dietetice (Fig. 1A - C).

Efectul proteinelor dietetice asupra activității PI-3 kinazei asociate cu IRS-1.

Activarea PI 3-kinazei reprezintă un pas esențial în stimularea transportului glucozei de către insulină (9). Prin urmare, am măsurat impactul alimentării cu conținut ridicat de grăsimi și a proteinelor dietetice asupra activității PI 3-kinazei stimulate de insulină în imunoprecipitații IRS-1, deoarece IRS-1 este principala izoformă responsabilă de absorbția glucozei în mușchi. În mușchiul scheletic al șobolanilor hrăniți cu chow, insulina a activat puternic PI 3-kinaza asociată cu IRS-1 (Fig. 2). Hrănirea șobolanilor o dietă bogată în grăsimi cu cazeină sau proteine ​​din soia a afectat grav capacitatea insulinei de a activa enzima (reducere de ~ 60% față de șobolanii hrăniți cu chow). În mod izbitor, proteina de cod din dietă a împiedicat complet pierderea acțiunii insulinei asupra activității PI 3-kinazei la șobolanii cu conținut ridicat de grăsimi.

Efectul proteinelor dietetice asupra activării Akt și a fosforilării GSK-3α/β.

Am determinat apoi dacă proteinele dietetice modulează starea activării Akt prin măsurarea fosforilării sale pe ambele site-uri de reglare (Ser473 și Thr308) și activitatea sa către un substrat exogen. Insulina a stimulat fosforilarea Akt atât pe Ser473 cât și pe Thr308 la animalele hrănite cu chow (Fig. 3A). Fosforilarea Akt indusă de insulină nu a fost diferită la șobolanii cu conținut ridicat de grăsimi care consumau proteine ​​de cazeină, cod sau soia. Activitatea kinazei Akt a fost apoi măsurată în imunoprecipitați Akt-1/2 folosind crosstidă, o peptidă care conține un motiv GSK-3 ca substrat. Am constatat că activitatea Akt este scăzută (-40%, P 2+ -ATPaza recuperată în acea fracție. Fracția TT conține un anumit nivel de Ca 2+ -ATPaza, reflectând cel mai probabil recuperarea unor cantități mici de triade (unde tubulii T În mod important, recuperarea tuturor acestor markeri nu a fost afectată nici de obezitate (chow versus grăsimi), nici de sursa proteinelor alimentare.

DISCUŢIE

Nutrienții precum glucidele și lipidele sunt modulatori importanți ai acțiunii insulinei asupra metabolismului glucozei (18). Cu toate acestea, se știe mult mai puțin despre impactul proteinelor alimentare asupra sensibilității la insulină și a homeostaziei la glucoză. Descoperirea noastră recentă că proteina de cod, dar nu cazeina sau proteina din soia, împiedică dezvoltarea rezistenței la insulină a mușchilor scheletici la șobolanii obezi cu conținut ridicat de grăsimi indică faptul că proteinele dietetice pot avea, de asemenea, un impact semnificativ asupra acțiunii insulinei (20). Prin urmare, este important să delimitați mecanismele celulare prin care proteinele dietetice influențează sensibilitatea la insulină în mușchi.

Activitatea Akt de PI 3-kinază este cunoscută ca fiind dependentă de fosforilarea atât a reziduurilor Thr308, cât și a Ser473 de PDK-1 (37.38) și respectiv PDK-2 (39), respectiv. Cu toate acestea, am constatat că atât hrănirea cu conținut ridicat de grăsimi, cât și consumul de proteine ​​de cod au modulat activitatea Akt fără a afecta starea de fosforilare a enzimei de pe Ser473 și Thr308. Astfel, deși activarea Akt de către insulină pare neafectată pe baza statutului de fosforilare Akt, capacitatea reală a kinazei de a fosforila un substrat exogen a fost semnificativ modificată. Această discrepanță aparentă poate fi explicată prin faptul că PI 3-kinaza a fost activată de cel puțin trei ori de insulină în toate grupurile dietetice (Fig. 2), permițând probabil o producție suficientă de PI (3,4,5) P3, pentru activarea completă a PDK și fosforilarea Akt, sugerând că un alt mecanism poate explica modularea activității kinazei Akt prin hrănirea bogată în grăsimi și proteinele dietetice.

Un aspect nedumeritor al acestui studiu este observarea că insulina a reușit să mobilizeze o cantitate similară de GLUT4 din IM-urile izolate din animale hrănite cu proteine ​​din soia și cod, în timp ce translocarea transportorului către tubulii T a fost observată doar în ultimul grup. Se recunoaște acum că GLUT4 trece printr-o rețea complexă de organite intracelulare, inclusiv rețeaua trans-Golgi și sistemul endosomal și că insulina influențează mișcarea dintre aceste organite (rev. În 44). Este puțin probabil ca fracțiunea IM izolată prin procedura noastră să conțină toate aceste organite. Astfel, este posibil ca, în ciuda faptului că GLUT4 dispare în IM izolat de șobolanii hrăniți cu proteine ​​de cod și proteine ​​din soia au fost similare, țintirea acestor vezicule nu a fost aceeași. De exemplu, este posibil ca veziculele GLUT4 care părăsesc piscina IM la animalele hrănite cu proteine ​​din soia să fie direcționate greșit către alte compartimente intracelulare, rezultând o mobilizare afectată la suprafața celulei.

O altă problemă care merită atenție este capacitatea animalelor hrănite cu proteine ​​din soia de a menține capacitatea de a transloca GLUT4 în membrana plasmatică, în timp ce șobolanii hrăniți cu cazeină nu au răspuns complet la insulină în ceea ce privește translocația. În ciuda acestui fapt, transportul glucozei stimulat de insulină în mușchi, precum și semnalizarea insulinei către calea PI 3-kinază/Akt au fost afectate în mod similar în aceste două grupuri. O posibilă explicație este că, deși profilul „clasic” de semnalizare a insulinei era aproape identic între grupurile hrănite cu cazeină și proteine ​​din soia, s-ar putea argumenta că alte căi de semnalizare sunt afectate în mușchiul grupului anterior. De exemplu, calea CAP-Cbl-TC10 independentă de PI 3-kinază s-a arătat, de asemenea, că participă la translocarea GLUT4 la suprafața celulei (rev. În 45). Prin urmare, este posibil ca această cale să fie mai activă la animalele hrănite cu proteine ​​din soia în comparație cu cele hrănite cu cazeină. Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că translocarea GLUT4 către membrana plasmatică, fără translocare către tubulii T, nu a fost suficientă pentru a conferi sensibilitate la insulină la animalele hrănite cu proteine ​​din soia.

Pe scurt, acest studiu oferă dovezi convingătoare că proteinele dietetice sunt modulatori importanți ai semnalizării și acțiunii insulinei în mușchiul scheletal de șobolan. Mai mult, am arătat că proteina de cod dietetică este un agent puternic și natural sensibilizant la insulină care normalizează starea de activare a căii PI 3-kinază/Akt cuplată la o translocație crescută a GLUT4 către tubulii T la obezi cu conținut ridicat de grăsimi. șobolani. Identificarea mecanismului molecular precis prin care proteina de cod din dietă îmbunătățește semnalizarea insulinei către PI 3-kinază/Akt va ajuta la definirea unor noi instrumente terapeutice pentru prevenirea și tratamentul rezistenței la insulină.